Hydrogel לבנות והפיברין מבוסס גישת דבק כדי לספק Therapeutics באוטם שריר הלב דגם Murine.

סיכום

פרוטוקול זה נועד להקל על המגבלה של השתלת תאים לקויה לטיפול בתאי גזע באוטם שריר הלב באמצעות שימוש במערכת הידרוג'ל ודבק מבוסס פיברין. בגישה זו, ניתן לשמור על מגע בין תא לרקמה לאחר אוטם, מה שמגדיל את הפוטנציאל הטיפולי של גורמים מועילים באתר הפציעה.

תקציר

מודל MI של עכברים מוכר באופן נרחב בתחום מחלות לב וכלי דם, ושימש באופן עקבי כצעד ראשון לבדיקת יעילות הטיפולים in vivo¹. הפרוטוקול המסורתי והמבוסס כוונן עוד יותר כדי למזער את הנזק לבעל החיים. יש לציין כי שכבות שרירי החזה מתגרות במקום פשוט לחתוך אותן, ובית החזה ניגש בין-צלעי בניגוד לשבירת הצלעות בסטרנוטומיה, תוך שמירה על שלמות כלוב הצלעות. עם שינויים אלה, הלחץ הכללי על החיה פוחת.

טיפולים בתאי גזע שמטרתם להקל על הנזק שנגרם על ידי MIs הראו הבטחה לאורך השנים בשל היתרונות הפרו-אנגיוגניים והאנטי-אפופטוטיים שלהם. הגישות הנוכחיות של העברת תאים לפני השטח של הלב כוללות בדרך כלל הזרקת תאים ליד האתר הפגוע, בתוך עורק כלילי או לזרם הדם ההיקפי^2-4. בעוד שהתאים הוכיחו את עצמם כביתם של שריר הלב הפגוע, הפונקציונליות מוגבלת על ידי ההשתלה הלקויה שלהם במקום הפציעה, וכתוצאה מכך דיפוזיה לזרם הדם⁵. כתב יד זה מדגיש הליך המתגבר על מכשול זה באמצעות מדבקת הידרוג'ל עטופה בתאים. המדבקה מיוצרת לפני ההליך הכירורגי ומונחת על שריר הלב הפגוע מיד לאחר חסימת העורק הכלילי השמאלי. כדי להדביק את המדבקה במקומה, דבק פיברין חיצוני תואם ביולוגית מונח ישירות על גבי המדבקה, ומאפשר לה להתייבש הן על המדבקה והן על פני הלב. גישה זו מספקת שיטת הידבקות חדשה ליישום מבנה טיפולי עדין העוטף תאים.

מבוא

אוטם שריר לב (MI) מוגדר כהפרעה של דם לאזור של הלב נגרמים על ידי החסימה של עורקים הכליליים עיקריים. הנזק כתוצאה מאוטם בשל שיפוץ של רקמת לב קיימא לרקמת צלקת שאינה פונקציונלית, אשר מקטין את יכולתו של הלב או, לייתר דיוק, החדר השמאלי, להכות כראוי. זה גורם לירידה בנפח דם שיכול להיות מועבר לגוף עם כל פעימת לב, הידועה בשם נפח הפעימה, ואחוז הדם שנשאב מתוך הלב עם כל פעימת לב, המכונה מקטע הפליטה של ^6. אלה, יחד עם פונקציות אחרות פחתו, מגבירים את הלחץ על שאר הלב כדי לשמור על תפקוד נאות. לעתים קרובות, מתח מוגבר זה יכול להיות כל כך חמור שהיא גורמת התקף לב שני, תופעה ראתה בכ -10% מאנשים ^7.

בעוד נהלים רפואיים התפתחו לטיפולמייד לאחר MI, אין טכניקה פותחה לעצור, איטי, או להפוך את תופעות לוואי השליליות של שיפוץ רקמות. תאי גזע טיפולים בתאים צמחו כדרך אפשרית לטיפול כזה, עם זאת, למרות הפוטנציאל המבטיח שלהם, נובע לא הוכיחו מוצלחים במסגרת הקלינית. תאוריה אחת על החסרונות שלהם היא חוסר היכולת להבטיח את התאים מועילים להישאר באתר של אוטם מספיק זמן כדי לייצר תוצאות חיוביות ^5. הוכח כי לא יותר מ 24% מתאים שפשוט הוזרקו לאתר של אוטם שרדו ונשארו ביום שלאחר מסירת אתר 1 הפגום ^2. סיכוי אפשרי להתמודדות עם בעיה זו של שימור תא הוא לפתח מערכות הידרוג'ל ביולוגית שלתמצת או תאים או תרופות, אשר יכול להיות מועברות לאתר שניזוק. הידרוג'ל של בחירה בפרוטוקול זה הוא פולי (אתילן גליקול) dimethacrylate עקב השימוש הקודם שלה ביחסי ציבור אנקפסולציה התאocedures, עם זאת, ניתן להשתמש בכל הידרוג'ל מסוגל אנקפסולציה ^8. המשלוח של התיקון ישירות לאתר של פציעה מבטיח מגע תא אל רקמה על פני תקופה ארוכה של זמן, להגדיל את משך זמן התאים יכולים לספק גורמים מועילים לשריר הלב הבסיסי.

צוואר בקבוק לגישת התיקון הוא הקושי של דבקות התיקון אל פני השטח את הלב. קבוצות רבות להתגבר על זה באמצעות מגוון רחב של טכניקות, הנפוצות ביותר להיות תפר פשוט לקשור את המבנה אל פני השטח את לב ^9,10. זה הוכיח את יעילותו במספר מקרים בהם המבנה עשוי מחומר נוקשה, אך נכשל כאשר ניסה במערכת הידרוג'ל, בשל ריכוז מים הגבוה והאופי עדין של מבנה התיקון. כדי להתגבר על זה, יש לנו מנוצל מערכת דבק חיצוני דבק הפיברין המחקה את הכימיה של היווצרות קריש דם. דבק הפיברין נעשה שימוש בניתוחים רפואיים רבים, Including דמעות דורה, fistulas הסימפונות, והשתלה קרנית, המדגיש את ההתאמה הביולוגית של המוצר כחומר איטום פצע ^11-13. בנוסף, ליפין נעשה שימוש עבור מגוון רחב של מטרות לב, כוללים טיפול כירורגים של קרעי חדר שמאלי וניתוחים מעקפים של עורקים הכליליים, לעומת זאת, השימוש בו כדבק הדבקה לתיקון לב אינו משמש ^14-17 נפוץ. ניסוח פשוט של תוצאות תרומבין ופיברינוגן בדבק ביולוגית שיכול להיות ממוקם ישירות על החלק החיצוני של תיקון לב חיצוני, מתן מערכת הידבקות קיימא כדי להבטיח תיקון לאינטראקציה לב.

פרוטוקול

הליך הוא בתאימות מלאה עם מספר פרוטוקול IACUC 13302 ואושר על ידי חלוקת משאבים בבעלי חיים.

1. כלי הכנה

1. החיטוי כל המכשירים שאינם חד פעמי המשמשים לפני ההליך כירורגי כדי להבטיח סטריליות.
2. לעקר מכשירים המשמשים פעמים רבות בפגישה עם מעקר חרוז זכוכית בין שימושים.

2. Hydrogel הכנה

1. להפשיר ותאי גזע צלחת לפחות 24 שעות לפני יצירת מבנה הידרוג'ל.
2. הכן טלאי יום אחד לפני ההליך כירורגי באמצעות מנגנון stereolithography (או המכשיר דומה) אשר תואר בפירוט מלא בפרסומים קודמים ^8,18.
3. כדי ליצור הידרוג'ל, ליצור ראשון עיצוב מודל בעזרת מחשב (CAD) של התיקון הרצוי ולייצא את העיצוב לפורמט stereolithographic (STL).
4. ליצור פתרון מראש ג'ל על ידי dissolvindimethacrylate פולי גרם (אתילן גליקול) (PEGDMA) בסטרילי 1X PBS להשיג 20% w / v פתרון. במקביל, לפזר את photoinitiator 1 [4 (ethoxy 2-הידרוקסי) -phenyl] -2-הידרוקסי-2-מתיל-1-פרופאן-1-אחד בDMSO. הוסף את photoinitiator לפתרון PEGDMA בגמר w / v של 0.5%. ישירות לפני crosslinking, להוסיף את הצפיפות הרצויה של תאים 100 מיליליטר. הערה: צפיפות תאים בין 2.0 x 10 ⁵ -2.0 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר מומלץ.
5. פיפטה הפתרון מראש ג'ל לתוך צלחת במרכז פלטפורמת צד"ל ולהפעיל את תוכנת SLA עם עיצוב STL המעוצב שנטען בעבר.
6. הסר את התיקונים ממנגנון דגירה הידרוג O / N במדיום השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS), 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, כדי לאפשר לתאים להסתגל לסביבה במסגרת התיקון.

3. הכנת בעלי החיים וintubati שבעל פהב

1. להעריך כל עכבר לפני ההליך כדי להבטיח שבעלי החיים הוא במצב בריאותי טוב, כפי שיקבעו מהרגלי הטיפוח ויחסי הגומלין שלהם עם חבריהם לכלוב שלהם. הערה: C57BL / 6J ישן 8-10 שבוע נקבה שמשו להליך זה, עם זאת, ניתן להשתמש בכל גיל בעכבר או סוג.
2. הנח חיות לחדר הרדמה ולחשוף לisofluorane 5% עם תמיכת O ₂ L 1 / דקה. לפקח על הרמה של הרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן.
3. ברגע שבעלי החיים הוא בהרדמה כראוי, לשקול ומניח אותם על דוכן אינטובציה.
4. לכוון מקור אור לכיוון חלל החזה של בעלי החיים ולהשתמש במלקחיים לחזור בי משטח הגרון ולחשוף את מיתרי קול. להדריך בזהירות 20 angiocath G בין מיתרי קול, וצורה חלקה להכניס לתוך קנה הנשימה. זיהוי הכנסה נאותה על ידי תנועה מכאנית של חלל החזה פעם קטטר מחובר למכונת ההנשמה החיה הקטנה.
5. התאם את הגדרות אוורור המשקל אלקטרוני של בעלי החיים המבוססים על ההנחיות של היצרן.
6. ברגע שמחובר לצינור, הנח את החיה במצב שכיבה על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. ודא שכרית החימום אינה עולה על 40 מעלות צלזיוס. אם יש צורך, להציב חיץ בין בעלי החיים וכרית החימום כדי למזער את הסיכוי לכוויות.
7. להסיר שיער מהאתר כירורגית באמצעות קרם מקריח. לעקר את האתר על ידי 3 סקראבס לסירוגין של בטאדין ו -75% אתנול כדי להבטיח עיקור נכון. הנח וילון לחשוף רק את האתר כירורגית, ולמקם את המשחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש במהלך ההליך.

4. נוהל כירורגי

1. פתיחת בית החזה מתבצעת בצד השמאל של בעלי החיים, ולכן, לעשות חתך בעור כ 1 סנטימטר מהשמאל לעצם החזה, שמנהל את אורכו של עצם החזה.
2. שימוש במלקחיים כדי להפריד את שכבת השריר מבית החזה הבסיסי בשני שלבים. שים לב Delineקו ating שמייצג את השרירים הגדולים pectoralis של בעלי החיים. הרם שריר זה מעט, להפריד אותו מהשרירים האלכסוניים החיצוניים הבסיסיים ולחזור מדיאלית. לאחר מכן, לשחרר את השרירים אלכסוניים החיצוניים מבית החזה הבסיסי באותו אופן, ולחזור רוחבי, מתן נוף לא מוסתר של הצלעות השניה, שלישיים, והרביעי.
3. בצע את פתיחת בית החזה בין הצלעות השלישית והרביעית. רם בעדינות את הצלע הרביעית ולהשתמש cauterizer כדי לפתוח את חלל החזה בין הצלעות השלישית והרביעית. הנח מפשקים לפתוח עוד יותר את החלל ולחשוף את הלב.
4. שימוש במלקחיים כדי לקרוע את קרום הלב הדק של הלב.
5. ולקשור את העורק הכלל השמאלי עם תפר ניילון 8-0 monofilament. מניחים את התפר כ 4 מ"מ מהשיא של הלב, ממש מתחת לקצה התחתון של אטריום השמאל. לקבוע מיקום תפר נכון על ידי לבנה של שריר הלב של החדר ועלייה בגודל של אטריום השמאל לאחר sutuמחדש כבר קשור.

5. תיקון מיקום ודבק

1. שמור טלאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ תנאים עד לשימוש.
2. רם בעדינות את הכתם בעזרת מרית שטוחה הסתיימה ובעדינות מניח אותו על פני השטח של הלב, באתר של אוטם.
   הערה: כדי למנוע החלקה מהחדר השמאלי, התיקון יכול להיות מוחזק במקום על ידי אורח קל לשמור על קשר או באמצעות המרית או הקצה של זוג המלקחיים.
3. הכן את הדבק על ידי ערבוב 4: 1 של פיברינוגן לתרומבין. מערבבים את הפתרון על ידי pipetting חזר עד שהוא מתחיל להתעבות, בדרך כלל בתוך דקות 1 לאחר תחילת ההכנה.
4. ברגע שצמיגות הפתרון מגיעה לרמה הרצויה, להעביר במהירות של כ -10 מיליליטר למשטח התיקון. הערה: זמן הקרישה של דבק הפיברין הוא מהיר, מתן חלון קטן של הזדמנות להעברה יעילה של הדבק.

6. תפירה

1. בצע את כל תפרי הסגירה באמצעות תפר ניילון 6-0 monofilament.
2. סגור את שכבת הצלעות עם 03:57 תפרי קטע בודדים.
3. לפני סגירה מלאה של שכבת הצלע, להכניס צינורית PE-10 לתוך החתך לפנות את חלל החזה לאחר הסגירה היא שלמה ולהקים מחדש לחץ intrapleural נכון.
4. סגור את שרירי חזה עם 03:57 תפרי קטע בודדים.
5. חותם את שכבת העור עם תפר רציף.
6. בעקבות סגירה מלאה, לצרף מזרק 1.0 מיליליטר לסוף הצינורית ולהשתמש בו כדי לפנות את חלל החזה.
7. החל דבק רקמות לאתר החתך לחזק את אתר התפר.

טיפול 7. לאחר ניתוח

1. תן עכברי הזרקה של עצירות (.05-1.0 מ"ג / קילוגרם) וcarprofen (2.2 מ"ג / קילוגרם) תת עורי לאחר קשירה כלילית ו -20 דקות לפחות לפני התחייה באופן מיידי. לנהל שתי התרופות 6-8 שעות לאחר ניתוח, ולאחר מכן לתת פעמיים ביום לתקופה של עד שלושה ימים לשליטה בכאב ומצוקה.
2. ברציפות לפקח על בעלי החיים עד שעה מודעת וכל לניתוח 4 שעות הראשונות שלאחר. לבצע בדיקה שנייה הלילה של הניתוח (2-4 שעות מאוחר יותר) לניהול מנה שנייה של משכך כאבים.
3. צג החיות יומי אחרי היום השני הבא ההליך, עד בעלי החיים מופיעים יציבים.

8. ניתוח של תפקוד לב והיסטולוגיה

1. בצע echocardiographs על 4 שבועות העכברים בעקבות ההליך כדי לקבוע את מידת הנזק הבא MI.
2. הרדימי עכברים עם isoflurane 4-5% בתוך תא הרדמה לאינדוקציה של הרדמה משאיפת, ולאחר מכן 2% isoflurane באמצעות מסיכת פנים להרדמת תחזוקה.
3. נקה את אזור ההדמיה עם קרם מקריח ולהשתמש אולטרסאונד חיה קטן כדי להשיג סריקת אקו 2D M-מצב של הלב הפועם ולהקליט את Asso הפרמטרים התפקודיciated עם זה.
4. להרדים את העכברים בתא פחמן דו חמצני, ולאחר מכן לאסוף את הלבבות מבעלי החיים והמקום בפתרון פורמלין 10% למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, להעביר את לבם עד 70% אתנול ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד רקמות.
5. לעבד את הלב ולשבץ אותם בלוקים פרפין.
6. חותך 5 מ"מ סעיפים דרך אזור חדרית של הלב, מתחיל בשיא ומסתיים באטריום.
7. כתם מחולק פרוסות עם שני Trichrome של האסון וhematoxylin וכתם eosin תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים.

תוצאות

במהלך ההליך הכירורגי, קשירה של העורק הכלל השמאלי ניתן לזהות על ידי מסומן לחלוט במורד הזרם של העורק החסום. כמבחן לפני קשירת הקשר, התפר ניתן להדק בקצרה כדי לבדוק אם הוא נמצא במקום המתאים. בנוסף, מאז חסימה של עורק התוצאות בירידה כמעט מיידית ביכולת של אטריום השמאל להכות כראוי, אטריום השמאל יגדיל בתגובה לזרימה חוזרת של דם במערכת.

מדידות אקו M-מצב נלקחו מוקדם ככל 2 ימים לאחר אוטם-להראות הפסקת קיר תנועת שמאל, מעידה על ש...

דיון

עם גישה זו למודל עכברי MI, פיתחנו מערכת הממזערת את הנזק לאזורים שאינם שריר הלב הקשורים לטכניקות MI עכברית אחרות. אזורים אלה כוללים נזק שנגרם על ידי הנשמה, חיתוך של השכבה הרירית, ושבירה של צלעות לחשוף את חלל החזה. אנו מאמינים כי שינויים אלה ישפרו את הודות התוצאה הניתוחית הכולל לטיפול נלקח כדי לשמור על כמה שיותר המבנים הגדולים, כולל צלעות ושכבות שרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הרווארד דגם 687 מאוורר עכבר	הרווארד מכשיר	55-0001
Inintech Biosciences LLC מעקר חרוזי זכוכית יבשה	פישר NC9531961
Leica MZ6 מיקרוסקופ כירורגי	Leica
ערכת קוטרי	Gemini	GEM 5917
מלקחיים עדינים - 0.4 מ"מ טיפים כלים	מדעיים	עדינים בזווית11063-07
מפסק אגריקולה - 3.5 ס"מ פיזור	כלי מדע עדינים	17005-04
מספריים קפיציים - 2.5 מ"מ להבים ישרים	כלי מדע עדינים	15000-08
מחזיק מחט Castroviejo - עם נעילה טונגסטן קרביד 14 ס"מ	כלי מדע עדינים	12565-14
מספריים לאיריס - ישר עדין 10.5 ס"מ	כלי מדע עדינים	14060-10
8-0 תפר מונופילמנט	Ethicon	8730P
6-0 תפר משי	Ethicon	639G
תרומבין	סיגמא	T7009
פיברינוגן	סיגמא	F3879
דבק רקמות Vetbond	3M	1469SB

מדעי