הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

14.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52564

⸱

8 באפריל 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי T תושבי עור מביופסיות עור אנושיות. פרוטוקול זה מניב מספר מספיק של לימפוציטים תושבי עור אנושי ברי קיימא לניתוח זרימה ציטומטרית ותרבית ex vivo.

תקציר

יש עור אדם תפקיד מחסום חשוב ומכיל תאים חיסוניים שונים שתורמים הומאוסטזיס רקמות והגנה מפני פתוגנים. כפי שהעור הוא יחסית קל לגשת, הוא מספק פלטפורמה אידיאלית ללמוד מנגנוני ויסות היקפיים חיסוניים. תאי תושב חיסון immunosurveillance התנהגות עור הבריא, אלא גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של מחלות עור דלקתיות, כגון פסוריאזיס. למרות תובנות מתעוררים, הבנתנו את הביולוגיה שבבסיס מחלות עור שונות דלקתי עדיין מוגבלת. יש צורך באיכות טובה (יחיד) אוכלוסיות תאים שבודדו דגימות עור ביופסיה. עד כה, נהלי בידוד כבר הקשו ברצינות על ידי חוסר קבלת מספר מספיק של תאי קיימא. בידוד לניתוח שלאחר מכן גם הושפעו אובדן סמני שושלת תא חיסון, בשל הלחץ המכאני וכימיות נגרם על ידי נהלי דיסוציאציה הנוכחיים להשיגהשעית תא בודדת. כאן, אנו מתארים שיטה שונה כדי לבודד תאי T משני בריא מעורב עור אנושי פסוריאטית ידי שילוב דיסוציאציה עור מכאני באמצעות Dissociator רקמות אוטומטי וטיפול collagenase. מתודולוגיה זו שומרת ביטוי של סמני שושלת החיסוניים ביותר כגון CD4, CD8, Foxp3 ו CD11c רק בעת הכנה של השעיות תא בודדות. דוגמאות של בידוד תא מוצלח CD4 + T ו פנוטיפי עתידי אנליזה פונקציונלית מוצגות.

מבוא

העור, כממשק העיקרי בין הגוף לסביבה, מספקת את קו ההגנה הראשון נגד פיזי חיצוני, כימיים ועלבונות ביולוגיים כגון פציעה, קרינה אולטרה סגולה ו מיקרואורגניזמים. העור מורכב משני תאים העיקרי, האפידרמיס הדרמיס, ומכיל מגוון של תאי מערכת החיסון כולל תאי לנגרהנס, מקרופאגים, תאים דנדריטים (DCS), וכ -20 מיליארד תאי זיכרון T, כמעט פי שניים בהווה מספר בהיקף הדם כולו 1 , 2. גוף גדל והולך של נתונים תומך ברעיון כי העור יש פונקציות חיסוניות חיוניות, הן במהלך הומאוסטזיס רקמות במצבים פתולוגיים שונים. תאים חיסוניים תושב בעור רגיל נחשבים לנהל immunosurveillance 3 הוכחו לשחק תפקיד בהתפתחות של מחלות דלקתיות כגון פסוריאזיס 4. בשנת העור lesional פסוריאטית, הן CD4 + ו- CD8 + הסתננו תאי T היו observed וזה היה הראה כי היחס בין CD4 ו- CD8 משתנה בהתאם למצב המחלה 5. עם זאת, אוכלוסיות אלה של תאים שקשה ללמוד בגלל הטכניקות הקיימות לאפשר בידוד של תאים בודדים בלבד.

הטכניקות בשימוש כיום נרחב עבור בידוד תא T מעור אדם לשלב ניתוק העור מכני עם טיפול אנזימטי. ביופסיות עור אדם הם טחונים בהרחבה וטופחו עם אנזימים כמו טריפסין, collagenase ו / או EDTA 6-8. עור בהתחשב בכך הוא רקם מחסום אשר עמיד מאוד לכוחות מתיחת חלוקה מכאנית, השיטות הוקמו של בידוד תא T המיוצר בתאים מעט מאוד, ואפילו מספרים נמוכים יותר של תאי קיימא, מה שהופך תרבות vivo לשעבר לתא של אוכלוסיות תאים אלה קשים מאתגר.

כאן אנו מדווחים על שיטה שונה לבודד לימפוציטים הן מעור אדם פסוריאטית בריא מעורב ידי שילוב mechanדיסוציאציה iCal של העור באמצעות Dissociator רקמות אוטומטיות במקום השיטה הוקמה ממינסינג בהרחבה, יחד עם עיכול אנזימטי באמצעות collagenase. תת תא חיסון קיימא שונה כולל DCs ותאי T נצפו לאחר הכנת השעית תא בודד. חשוב לציין את הביטוי של סמני המשטח CD3, CD4 ו CD8 השתמר היטב. תאים ובכך מוכן, מוכנים לשימוש בתרביות תאים vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometric. פרוטוקול זה הועסק בהצלחה לניתוח ביופסיות עור יחידות (4 מ"מ) נגזרות עור lesional של חולי פסוריאזיס. תוצאות המחקר הראו כי תושב העור המטופל בתאי T מיוצר יותר ציטוקינים דלקתיים כמו IL-17 ו IFNγ בהשוואה למתנדבים בריאים 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: עור ביופסיות מיחידים בריאים התקבלו שאריות עור בטן של אנשים שעברו ניתוחים פלסטיים אלקטיבי לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. שימוש עור אנושי אושרה ובהתאם לתקנות שקבעו הוועדות האתיות הרפואיות למחקר האדם של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud, ניימיכן, הולנד אונ' אסן, גרמניה.

1. הכנת תרחיפים תא יחיד מעור אדם (עבודה סטרילית בתוך ארון-Flow אם תרבית תאים לאחר נדרש)

  1. הכן בינוני תרבית תאים: RPMI 1640 + פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי 100 יחידות / מ"ל ​​ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) + פירובט (0.02 מ"מ) ו Glutamax (0.02 מ"מ), ללא בסרום הוסיף.
  2. כן בינוני תרבות שלם: בינוני התרבות מוכן בשלב 1.1 + 10% בסרום נקווה אדם (HPS); לאחסן ב 4 ° C.. תביאו בינוני עד 20 ° C ± 2 לפנינוing.
  3. השג את ביופסיה של העור באמצעות מכשיר ביופסיה סיבוב 4 מ"מ ולשמור אותו במדיום תרבות שלמה RPMI1640 ב 20 ° C ± 2 עד 4 שעות או 4 ° C ON. לעבד הביופסיה בהקדם האפשרי עם ההגעה במעבדה.
    הערה: ארוכה יותר אחסון של עור ישפיע על תשואת התא כדאי תא.
  4. לייבל צינור דיסוציאציה כחול הכתיר ולהוסיף 5 מ"ל בינוני תרבות שלמה לתוך הצינור שכותרתו.
  5. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות שלמה לבאר כל (ב 3 בארות בסך הכל) של צלחת תרבות 6-גם סטרילי. השתמש בכלים סטריליים להציב הביופסיה לתוך באר אחת, לשטוף, תזיז אותה אל באר שני וחזור על שלב זה עוד פעם אחת, ובכך להשיג סכום כולל של שלוש שטיפות.
  6. מעבירים את ביופסיה של העור שטוף היטב את צלחת פטרי סטרילית, להוסיף 100 μl של המדיום תרבות שלמה על החלק העליון של ביופסיה, ובזהירות לגרד רקמת שומן תת עורי באמצעות אזמל סטרילי חד פעמי נירוסטה.
    הערה: Thהוא הוא שלב קריטי.
  7. חותך כל ביופסיה של עור ל -4 חתיכות קטנות על צלחת פטרי סטרילית. דגימות העברה (עד ארבעה 4 ביופסיות מ"מ לכל צינור) אל הצינור דיסוציאציה מוכן המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבות שלמה.
  8. הבשר ומהדקים את הצינורות עם כובע, ולצרף במהופך לשרוול של Dissociator רקמות אוטומטיות. ודא כי כל חומר המדגם ממוקם באזור של הרוטור.
  9. התחל את תהליך הניתוק ידי ההפעלה "תכנית m_spleen _01" (תכנית מוגדרת מראש שמספקת בזיכרון הפנימי של המכשיר או על ידי כרטיס התכנית המלווה) כדי לנתק את הביופסיה במהירות הסיבוב המתאימה 56 שניות.
  10. לאחר עיבוד, לנתק את הצינור דיסוציאציה מן Dissociator ולוודא שכל החומר ניתק נאסף בתחתית של התחתית.
  11. להוסיף 150 μl collagenase IA (80 מ"ג / מ"ל) לתוך הצינור דיסוציאציה דגירה המדגם באמבט מים רועד ב 37° צלזיוס למשך 60 דקות. הוספת 100 μl של DNase אני (5 MU / מ"ל) לתוך צינור thedissociation, ומערבבים היטב.
    הערה: ריכוז גבוה של collagenase או זמן הדגירה כבר תשנה כדאיות התא.
  12. צרף הצינור דיסוציאציה לשרוול של Dissociator הרקמות האוטומטיות ולהפעיל את "_01 טחול תכנית m_" כדי לנתק את הביופסיה עוד פעם אחת.
  13. מניחים מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר על גבי צינור פלקון 50 מ"ל. החל חומר המדגם ניתק מסננת תא זה כדי להסיר גושי תא / פסולת רקמות.
  14. לשטוף מסננת תא פעם אחת עם 5 מ"ל של מדיום תרבות שלמה. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 10 דקות ו supernatant לשאוב.
  15. חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת. Resuspend כדורי תא 300 μl של מדיום תרבות השלם. המתלים תא יחיד מוכנים לניתוח נוסף; להמשיך עם פרוטוקולי תרבית תאי vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometry.
  16. במקרה של i הנוספתמכתים ציטוקינים ntracellular, לעורר תאים עם PMA (12.5 ng / ml), ionomycin (500 ng / ml) ו Brefeldine A (5 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 4 שעות לפני ביצוע זרימת ניתוח cytometry.

2. הפעלת Polyclonal של תאי T עור-Resident (תרבית תאי Ex Vivo)

  1. Aliquot 100 תא בודד השעיות μl (מוכן בשלב 1.15) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית.
    הערה: לכל אחד מ -4 מ"מ ביופסיה של העור, השעיות תא בודד רכשה ניתן לפצל לפחות שתי בארות של צלחת 96-היטב.
  2. להוסיף microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 מב-מצופה (25,000 חרוזים לכל טוב), ציטוקינים אנושי רקומביננטי RIL-2 (הריכוז הסופי 25 U / ml) ו RIL-1β (מ"ל / הריכוז הסופי 50 נ"ג).
  3. מכסים את הצלחת תרבות עם מכסה צלחת גם שכותרתו, דגירה 5% CO 2, 100% לחות, 37 ° C חממה. שנה בינונית כאשר הצבע הבינוני פונה צהוב.
    הערה: מושבת תא ברורה ניתן להבחין בין יום 8 של תרבית תאים.

3. ניתוח cytometry זרימה של הראשים / עור-Resident בתרבית תאי T

  1. הכן חיץ FACS: PBS + 0.2% BSA.
  2. עבר תאי עניין לתוך צלחת 96-גם נ-תחתון. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  3. Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  4. הכתם התאים עם 100 μl של eFluorescence780 מוכן מצומדות צבע הכדאיות ניתן לתקן (1: דילול 1,000 באמצעות PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  5. בחר מבז סמן פני התא הנדרש, למשל: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), ואת CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), להכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ FACS על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם.
  6. הוסף 25 μl של מבז-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. דגירה 20 דק 'ב 20 ° C ± 2, להגן מפני אור.
  7. הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  8. לקבלת דוגמיות שרק דורשים מכתים פני התא, המשך לסעיף 3.16.
  9. במקרה של מכתים Foxp3 תוך תאי:
    1. כן קיבעון חיץ permeabilization ידי ערבוב חלק אחד של תרכיז עם 3 חלקים של מדלל.
    2. הכן חיץ permeabilization 1x: 1 חלק 10x permeabilization חיץ + 9 חלקים של H 2 O. לעקר
  10. כדורי Resuspend ב 100 μl של קיבעון permeabiliחיץ zation, ומערבבים היטב, דגירה על 4 ° C למשך 30 דקות.
  11. הוספת 100 חיץ permeabilization μl היטב כל, צנטריפוגות ב 450 XG ב RT במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  12. שטפו תאים עם חיץ permeabilization עוד פעם אחת.
  13. בחר נדרש מבז תאיים, למשל, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ו IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). מכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ permeabilization המכיל סרום עכברוש נורמלי 2% על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם.
  14. הוסף 20 μl של מב-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. לדגור על 4 ° C למשך 30 דקות, להגן מפני אור.
  15. לאחר 30 דקות דגירה, להוסיף 100 μl של חיץ permeabilization לבאר כל אחד. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב.
  16. שטפו תאים עם permeabilization buffer עוד פעם אחת. Resuspend גלולה ב 110 μl של חיץ FACS, השעיות תא העברה לתוך צינור microFACS.
    הערה: Sample מוכן למדידה באמצעות 10 צבעים cytometry זרימה.
  17. במקרה של מספר סלולארי מדויק הנדרש, להוסיף 10 μl של השעיה אחידה מוּרבָּך של fluorospheres לתוך מדגם זה מייד לפני ביצוע מדידות באמצעות cytometry זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המובא כאן יניב בין 2,200 ± 615 (ממוצע ± SEM, עור של מתנדבים בריאים) עד 178,000 ± 760 (ממוצע ± SEM, עור lesional של חולי פסוריאזיס) לימפוציטים קיימא מעור אדם בעת שימוש ביופסיה של עור יחידה 4 מ"מ.

סוגים שונים של CD45 + תאים אותרו תא בודד השעיות נגזר העור של אנשים בריאים כולל CD4 + T-תאים (~ 45%), CD8 + T תאים (~ 30%), ו CD11c + DCS (~ 5% ), בעוד כמה B תאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאי T תושב העור ביעילות ביופסיות עור האדם. היתרון של פרוטוקול זה הוא הבידוד של מספרים גבוהים יחסית של לימפוציטים קיימא, מבקש להביע סמני משטח רלוונטיים. תת תא מזוהה היו: CD11c + DCS, CD4 + ו- CD8 + T תאים Foxp3 + CD25 + תאים. חשוב לציין, לשעבר vivo התרבות של תאים מבודד עור תושב T הייתה טוב מאוד ריאלית ואפשר אנליזה פונקציונלית שלאחר מכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ביופסיות עור מחולים פסוריאזיס נמסרו באדיבות על ידי ד"ר אנדראס Koerber (המחלקה לדרמטולוגיה באוניברסיטת אסן, גרמניה) לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי.

XH נתמכת גם על ידי NSFC 61263039 ו NSFC 11,101,321.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ביופסיה חד פעמית פונץ'Kai EuropeBP-40F4 מ"מ
אזמל סטרילי חד פעמיDalhausen1100000510
צינור עדין MACS CMiltenyi Biotech130-093-237מכסה כחול, המשמש כצינור הדיסוציאציה.
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotech130-093-235דיסוציאטור רקמות אוטומטי. שימוש ב"spleen_01 התוכנית" לדיסוציאציה של ביופסיית העור.
מסננת סלולרית BD35235070 ומיקרו; m ניילון
96 בארות צלחת U תחתונהגריינר ביו-וואן650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
נתרן פירובטטכנולוגיות חיים11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
פניצילין/סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים15140-122
אנושי סרום מאגר (HPS)מוכן
קולגנאז ISigma-AldrichC2674סוג 1-A, מתאים לתרבית תאים
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
צבע כדאיות קבוע (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18צביעת תאים מתים לפני קיבוע התאים; לדלל עם PBS ב-1:1,000
תרכיז קיבוע/פרמיביליזציהeBioscience00-5123-43
קיבוע/פרמיביליזציה מדללeBioscience00-5223-56
מאגר פרמיביליזציה (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 עכבר אנטי-אנושי CD45BD563879שיבוטHI30;: מקדם דילול 1:50
FITC עכבר אנטי אנושי CD14DakoT0844שיבוט: TUK4; גורם דילול 1:50
PE עכבר אנטי אנושי CD56DakoR7127שיבוט: MOC-1; גורם דילול 1:50
עכבר ECD אנטי אנושי CD3Beckman - CoulterA07748שיבוט: UCHT1; גורם דילול 1:50 לצביעה על פני השטח; גורם דילול 1:25 לצביעה תוך תאית.
PC5.5 עכבר אנטי אנושי CD4בקמן - קולטרB16491שיבוט: 13B8.2; גורם דילול 1:200
PeCy7 עכבר אנטי אנושי CD11cבקמן - קולטרA80249שיבוט: BU15; גורם דילול 1:50
APC עכבר אנטי אנושי CD1cMiltenyi Biotech130-090-903שיבוט: AD5-8E7; גורם דילול 1:10
APC-AlexFluo700 עכבר אנטי אנושי CD8בקמן - קולטרA66332שיבוט: B9.11; גורם דילול 1:400
APC-AlexFluo750 עכבר אנטי-אנושי CD19בקמן - קולטרA94681שיבוט: J3-119; גורם דילול 1:50
PeCy7 עכבר אנטי-אנושי CD25eBioscienceAD5-8E7שיבוט: BC96; גורם דילול 1:50
  CLA עכברוש אנטי אנושיMiltenyi Biotech130-091-635שיבוט: HECA-452; גורם דילול 1:
eFluo450 חולדה אנטי אנושי Foxp3eBIoscience48-4776-42שיבוט: PCH101; צביעה תוך-תאית; גורם דילול 1:50
AlexFluo488 עכבר אנטי אנושי IL-17AeBioscience53-7179-42שיבוט: eBio64DEC17; צביעה תוך-תאית; גורם דילול 1:50
PeCy7 עכבר אנטי-אנושי IFNgeBioscience25-7319-41שיבוט: 4S. ב3; מכתים תוך תאיים; גורם דילול 1:400
פלואורוספירות ספירת זרימהבקמן - קולטר7547053חרוזי ספירה, לזרימה ציטומטרית
בבית

מקורות

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FACSex vivo
בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.