מאמר שיטה

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

DOI:

10.3791/52576

⸱

26 בפברואר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Würzburg, 2Translational Center Würzburg, Regenerative Therapies in Oncology and Musculoskelettal Disease, Würzburg Branch of the Fraunhofer-Institute Interfacial Engineering and Biotechnology, IGB

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות עור תלת מימדי בעובי מלא, הדומה לעור טבעי. עם מכשיר פציעה אוטומטי שנבנה במיוחד, ניתן ליצור פצעים מדויקים וניתנים לשחזור תחת שמירה על סטריליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים במבחנה הם אלטרנטיבה חסכונית ואתית לחקר תהליכי ריפוי פצעים עוריים. יתר על כן, על ידי שימוש בתאים אנושיים, מודלים אלה משקפים את מצב הפצע האנושי טוב יותר ממודלים של בעלי חיים. למרות שמודלים דו-ממדיים נמצאים בשימוש נרחב לחקירת תהליכים כמו נדידת תאים והתפשטות, מודלים מורכבים יותר נדרשים כדי להשיג ידע מעמיק יותר על ריפוי פצעים. מלבד מערכת דגם מתאימה, יצירת פצעים מדויקים וניתנים לשחזור היא חיונית כדי להבטיח תוצאות השוואה בין ריצות בדיקה שונות. במחקר זה, מוצג יצירת עור תלת מימדי בעובי מלא שווה ערך לריפוי פצעים במחקר. החלק העורי של המודלים מורכב מפיברובלסטים עוריים אנושיים המוטבעים בהידרוג'ל קולגן זנב עכברוש מסוג I. לאחר החיסון בקרטינוציטים אפידרמיסיים אנושיים וכתוצאה מכך תרבית בממשק האוויר-נוזל, נוצר אפידרמיס רב שכבתי על גבי הדגמים. כדי לחקור את תהליך ריפוי הפצעים, פיתחנו בנוסף מכשיר פציעה אוטומטי, המייצר פצעים סטנדרטיים באווירה סטרילית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף. זה יוצר חיץ בין הסביבה החיצונית והאיברים הפנימיים. יתר על כן, העור מגן על הגוף מפני אובדן נוזלים, השפעות סביבתיות, פציעות ודלקות ומסייע בויסות טמפרטורת גוף 1. בשל מיקומו החשוף, העור מושפע לעתים קרובות על ידי טראומה מכאנית, תרמית או כימית. למרות העור הוא בדרך כלל מסוגל תיקון עצמי, גורמים רבים מקומיים כגון זיהום, חמצון, והסתפקות ורידים יכולים להוביל לריפוי פצעים לקוי. ריפוי פצע יכול להיות גם הפריע ידי גורמים מערכתיים כמו השמנת יתר, אלכוהוליזם, עישון, תרופות, תזונה ומחלות כמו סוכרת. 2

התהליך של ריפוי פצע יכול להיות מחולק לשלבים 3: (i) השלב הדלקתי, (ii) השגשוג ו( iii) שלב שיפוץ. על פגיעה בעור, אות-מפל מורכב מתחיל, שהוביל לסגירת הפצע. 3לאחר פציעה, הפצע מדמם וקריש דם נוצר. Fibroblasts לעבור לקריש הדם ולהחליף אותו עם רקמה חדשה ששופצה לאחר מכן במשך שנים.

ההבנה הנוכחית של תיקון עורית תהליכים ביולוגיים הבסיסי היא מוגבלת. מודלים של בעלי חיים וחזיר קטנים ששמשו ללמוד ריפוי פצע. עם זאת, תוצאות אלה לא יכולים להיות מועברות ישירות לבני אדם בשל הבדלי מינים ספציפיים. בנוסף לדגמים אלה in vivo, כמה היבטים של ריפוי פצע ניתן ללמוד על ידי הדמיה של מצב פצע באמצעות גירוד של תרבויות monolayer במבחנה המבוסס על שורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים. 4 דגמים מגרדים אלה טופל מאוד אבל לא מספיק משקפים את פיזיולוגיה מורכבת in vivo. 5 מלבד דגמים דו-ממדיים, שווה עור אנושי תלת ממדים פותחו עבור מחקר דרמטולוגיים. חלק עורי של מודלים אלה הם generated באמצעות פיגומים שונים, כולל הדרמיס decellularized, 6 הידרוג קולגן, 7,8 glycosaminoglycans 9 או חומרים סינטטיים. 10 העסקת שווה עור אלה, התפקיד של אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 11, epithelialization מחדש, crosstalk הסלולרי בין fibroblasts וקרטינוציטים ו השפעה של גורמי גדילה שונים ניתן ללמוד. יתר על כן, מודלים אלה הם שימושיים כדי לצבור ידע חדש על איך fibroblasts להעביר לאזור הפצוע ואיך chemotactic גורמים משפיעים התחדשות רקמות. 12

לא רק הדור של מודל ריפוי הפצע עצמו הוא מאתגר, אלא גם להקים פצע סטנדרטי מאוד במודל הוא בעייתי. טכניקות נפוצות ליצירת פצעי בדיקות מאפס, 13 כוויות, שחיקה קלטת 14, 15 פגיעת תרמית, 16 שלפוחיות יניקה, חנקן נוזלי 17, 18 לייזרים, 19 אזמלים, 18 meshers 6 ואגרופי ביופסיה. 20 רוב השיטות אלה יש את אותו חסרונות. פציעות מיושמות באופן ידני קשות כדי לתקנן ולהתרבות בין בדיקות מרובות. גודל, צורה ועומק של הפצע משתנים בין מחקרים ובכך לפגוע באיכות של נתוני מחקר. השימוש בליזר לפציעת עור מוגדר יכול להיות סטנדרטי בקלות יחסית, אך מוביל למצב מחקה פצעי כוויות. חום מיושם על ידי לייזר יכול לגרום denaturation החלבון, צבירת טסיות דם או כלי התכווצות, מה שעלול להוביל לרקמות נמקית.

בגישה חלופית, שפיתחנו מכשיר אוטומטי פציעה (AWD), אשר מאפשר לנו ליצור פצעי cutaneous מוגדרים ומדויקים בתנאים סטריליים. פרמטרים פצעו, כמו עומק ומהירות של חדירה, כמו גם מהפכות של ראש המקדח יכולים להיות מוסדרים. במחקר זה, אנחנו בשילוב עם AWD שווה עור בעובי מלא בבית פיתח (ftSE) שניתן להשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי et al Gangatirkar. 8 שכבת הדרמיס של העור שווה הערך מורכב מfibroblasts האנושי עורי (HDF), ששובצו בקולגן אני הידרוג'ל. בשכבת הדרמיס, קרטינוציטים אדם אפידרמיס (HEK) הם זורעים. בתוך שבועיים בממשק האוויר הנוזלי HEK לבנות את האפידרמיס מורכב מכמה שכבות תאים חיוניות ושכבה קרנית. חוץ מזה הדור של מודל זה, מחקר זה מציג את השימוש של AWD כדי ליצור פצעים מוגדרים ומדויקים בFTSE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול מיועד לייצור של 24 שווי עור בעובי מלא. אדם fibroblasts עורי וקרטינוציטים אפידרמיס בודדו מביופסיות עור על פי פרוטוקול שפורסם בעבר. 21,22 הסכמה מדעת הושגה מראש והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד במחקר אנושי של יוליוס-מקסימיליאן-האוניברסיטה וורצבורג (182 להצביע / 10).

1. הפקה של Dermal רכיב

  1. לפזר קולגן עם 0.1% חומצה אצטית לריכוז סופי של 6 מ"ג / מיליליטר. לפתרון נטרול ג'ל, לערבב 232.5 מיליליטר 2x DMEM, 7.5 מיליליטר סרום עגל עוברי, 7.5 מיליליטר 3 M HEPES, 2.5 מיליליטר כונדרואיטין סולפט (5 מ"ג / מיליליטר). שמור על פתרון ג'ל נטרול ופתרון קולגן על קרח. לחשב 500 μl של ג'ל למקבילה להוסיף / עור.
    הערה: כפתרון נטרול ג'ל יהיה מעורב עם שני חלקים של prepa פתרון קולגןמחדש כמות כפולה של קולגן.
  2. מניחים 24 מוסיף לצלחת גם 24.
  3. Resuspend fibroblasts עורי האנושי (HDF) ב 10 מיליליטר DMEM, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 270 XG ולספור את התאים. לחלץ את הסכום הדרוש של HDF (5 x 10 4 תאים לכל 500 ג'ל קולגן μl) ו צנטריפוגות התאים למשך 5 דקות ב 270 x g.
  4. הסר את supernatant וזהירות resuspend HDF ב 4 מיליליטר מקורר פתרון נטרול ג'ל מבלי לייצר בועות אוויר. משלב זה לוודא לעבוד מהר ככל האפשר, כדי למנוע הַקשָׁאָה המוקדמת של ג'ל קולגן.
  5. Resuspend הפתרון עם 8 מיליליטר של תמיסת קולגן.
  6. קח קולגן תאים-התערובת עם פיפטה ורבה שלבים-למלא במהירות 500 μl של תערובת בכל הוספה. דגירה ג 'לים 20 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) להתממש ג'לי.
  7. להטביע את ג'לי 2 מיליליטר הנשר בינוני השתנה Dulbecco 10% בסרום (DMEM) + עגל עוברי (FCS) בכל טובדגירה זה למשך 24 שעות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).

2. תוספת של אדם עוריות קרטינוציטים (HEK)

  1. הסר בינוני לאחר 24 שעות. לפזר חלבון אנושי פיברונקטין עם מים ultrapure לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. כיסוי כל עורי שווה ערך עם 25 μl של פתרון פיברונקטין. דגירה ג'לי למשך 30 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2).
  2. בינתיים, resuspend HEK ב 10 מיליליטר קג"מ-2 ולהגדיר ריכוז תא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם קג"מ-2 FCS% מוכנים 5 +. הזרעים 1 x 10 5 HEK על כל ג'ל. דגירה ג 'לים 45 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) כדי לאפשר לתאים לדבוק.
  3. Submerse ג'לי עם קג"מ-2 FCS מוכן + 5% ותרבותם בחממה (37 ° C, 5% CO 2).

3. תרבות השווה עור בעובי מלא (FTSE)

  1. FTSE תרבות ל6-7 ימיםיורד FCS-ריכוז (5%, 2%, ו 0% FCS). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עם הריכוז נמוך יותר FCS הבא. לשם כך, להסיר לחלוטין את בינונית ומוסיף 1.6 מיליליטר של מדיום חדש.
  2. ביום 7, להסיר בינוני לחלוטין.
    הערה: אל תיגעי במשטח FTSE עם קצה פיפטה תוך כדי כך.
  3. מניחים כל להכניס לתוך היטב 1 של צלחת 6 היטב עם מלקחיים סטרילית. להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני רכבת אווירית לכל טוב, להבטיח שלא להרטיב את משטח FTSE. שנה בינונית כל 2-3 ימים למשך 14 יום נוסף.
    הערה: רמת המילוי של המדיום היא עד המניסקוס של FTSE.

4. ניתוח היסטולוגית

  1. תיקון ופרפין-הטבעה של FTSE
    1. הסר בינוני תרבות, להעביר מוסיף ב 24 צלחות גם טריות ולתקן רקמות על ידי הוספת 1.6 מיליליטר של 4% paraformaldehyde לכל היטב דגירה הרקמות לשעה 2 ב RT. זהירות! Paraformaldehyd הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסת מנוע קטר. העברהFTSE לקלטת הטבעת רקמות. הסר מקבע הנותר על ידי שטיפה במים ומייבשים את הרקמות באמצעות ריכוזי אתנול עולה.
    2. מחלקים את המקבילה העור על ידי חתך אנכי באמצע. מניחים שתי חתיכות בתבנית מתכת מלאות פרפין עם משטחי חיתוך כלפי מטה. הוסף את קלטת הרקמה על גבי העובש כגיבוי.
    3. לחתוך 3-5 פרוסות מיקרומטר ולצוף על אמבט מים C ° 40 להִצטָרְרוּת, הר שקופיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ מתאימות. פרוסות יבשים ביסודיות.
  2. צביעת Hematoxylin וEosin (H & E) וimmunohistochemical (IHC)
    1. מקום מחליק לתוך מדף דגירה עבור שעה 1 ב 60 ° C. ודא שפרפין הוא נמס. כתם rehydrated פרוסות עם H & E כמכתים סקירה סטנדרטית.
    2. לצביעת H & E להכין cuvettes צביעת זכוכית 4x עם xylol, 3x עם אתנול 96%, 2x עם אתנול 70%, 1x עם 50% אתנול, 4x מים ללא יונים, hematoxylin 1x, 1x HCl-ethanol (13.7 מיליליטר 1 M HCl מודעה 200 מיליליטר 50% אתנול), 1x מים כרטיסייה, 1x eosin (eosin 1 גרם ל -100 מיליליטר מים deionized) ו2x 2-propanol.
    3. מקום שקופיות 10 דקות בי xylol ו -10 דקות בxylol השנייה לdeparaffinize ורעננותם שקופיות. טובלים שקופיות 3x באתנול 96% אני, 3x באתנול 96% השני, 3x באתנול 70% ו3x באתנול 50%. סובב שקופיות במים ללא יונים. כדי לבדל את צבע hematoxylin, 2x לטבול בHCl-אתנול. יש לשטוף במים ללא יונים. כלְּחִילָה, מקום מחליק 5 דקות במי כרטיסייה. עבור מכתים eosin, מקום שקופיות 1 דקות בeosin ולשטוף לאחר מכן במים ללא יונים. להתייבשות, מגלשות לטבול 2x באתנול 70%, 2x ב 96% אתנול ולמקם אותם במשך 5 דקות באני 2-propanol, במשך 5 דקות ב2-propanol השני, 5 דקות בxylol אני ו5 דקות בxylol השנייה. לאחר צביעת H & E, גרעיני תאים הם מוכתמים בכחול, ציטופלסמה ומטריצה ​​תאית מוכתמים באדום.
    4. לאחזור אנטיגן, להסיר פרפין עם קסילן ורעננותם פרוסות לצביעה. פרוסות מקוםבסיר אדים ומבשלים פרוסות deparaffinized וrehydrated במשך 20 דקות במחוממים מראש 10 מ"מ חיץ ציטרט (pH 6).
    5. מגלשות מקום בחיץ כביסה (חיץ + Polysorbat 0.5% PBS 20) ופרוסות המעגל עם עט נוזל דוחה שקופית סמן או עט יהלומים.
    6. הנח שקופיות בתא לחות. לחסום peroxidase אנדוגני, על ידי הוספת 3% מי חמצן פתרון 100 μl על כל פרוסה. זהירות! מאוד מסוכן במקרה של מגע עם עור ועיניים. ידית עם ציוד מגן אישי. לשטוף שקופיות בכביסת חיץ.
    7. החל נוגדן ראשוני דגירה במשך השעה 1 בRT. לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם חיץ כביסה. מכאן והלאה, יש לשמור דגימות בחושך.
    8. השתמש במערכת איתור יוטין-streptavidin לצורך זיהוי של אנטיגן-נוגדן ספציפי מחייב.
    9. Counterstain גרעינים עם Hematoxylin דקות 1. מייבשים והר שקופיות.
    10. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
5. פגיעה על ידי שימוש במכשיר האוטומטי הפציעה (AWD)

  1. הכן את AWD על ידי חיטוי אזור העבודה עם אתנול 70% ואור אולטרה סגול. ודא שראש הקידוח בגודל הרצוי (למשל, 1 מ"מ) מצורף.
  2. הנח שווי עור לאזורים מיועדים של מדגם צלחת מוביל autoclaved באמצעות מלקחיים סטרילית. מניחים את מדגם צלחת ספק לשקע מתחת לראש הקידוח.
  3. השתמש בתוכנת הבקרה כדי להגדיר פרמטרים פצעו כדלקמן: מהירות ספין: 15,000 סל"ד; חדירה: 1.5 מ"מ; הנעה: 100 הרץ. פרמטרים אלו צריכים להיות מוגדרים לכל סוג מדגם בנפרד. העברה פצעה פרמטרים לAWD.
  4. התחל פצע הליך. הסר מדגם צלחת מוביל מהשקע. העברת פצועים FTSE בחזרה למוסיף משמש לתרבות באמצעות מלקחיים סטרילית.
  5. להמשיך עם התרבות של FTSE נפצע בחממה (37 ° C, 5% CO 2) לחקירה של התחדשות. אלternatively, להשתמש במודלים לניתוח היסטולוגית בכל עת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDF המבודד וHEK שונה הן במורפולוגיה ובביטוי של סמנים אופייניים. HDF הראה מורפולוגיה ציר בצורה אופיינית, ואילו מורפולוגיה של HEK יכולה להיות מתוארת על ידי מורפולוגיה מרוצפת. התאים התאפיינו במכתים immunohistochemical (איור 1) לפני השימוש בהם לFTSE. HDF הם חיובי עבור vimentin (איור 1 א), סמן לfibroblasts. העיקרי HEK להביע מאוד cytokeratin-14 מוקדם חלבון בידול (איור 1), אך כמעט לא חלבון בידול keratinocyte מאוחר cytokeratin-10 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתאים במבחנה, בדרך כלל, הרחיבו בתרביות תאים הדו-ממדי, שבו תאים לדבוק משטחי פלסטיק. עם זאת, תנאי התרבות אלה אינם משקפים את התנאים תלת ממדים הפיסיולוגיים שבו תאים לגדול in vivo. בתנאים תלת-ממדיים, תאים יכולים ליצור קבצים מצורפים תא-תא ותא-מטריצה ​​טבעיות ולהעביר בשלושה ממדים. במיוחד בפצע עורי ריפוי הדמיון של המצב בvivo הוא ציר מרכזי להפיק נתונים משמעותיים, כמו נדידת תאים ודור מטריצה ​​הם מרכיבים מרכזיים של ריפוי פצעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ל-Fraunhofer ISC על שיתוף הפעולה בנוגע לבניית מכשיר הפציעה האוטומטי. הפרויקט הוקם על ידי הפרויקט הפנימי של Fraunhofer "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טריפסין EDTA (1:250) 0.5% ב-DPBSPAAL11-0030.05%
Dulbecco' s פוספט בופרמלח SigmaD8537
קולגן (6 מ"ג/מ"ל ב-0.1% חומצה אצטית)מיוצר בבית
פיברונקטין חלבון אנושי, פלזמה (50  ומיקרו; גרם/מ"ל)Life Technologies33016-015
מוסיףNunc140627
צלחת 6 בארות Nunc140685
24 בארות צלחתNunc142485
שקופיות מיקרוסקופR. Langenbrinck03-0070
<חזק>תרבית פיברובלסטים (500 מ"ל):
DMEM, גלוקוז גבוהLife Technologies11965-09289% (445 מ"ל)
סרום בקר עובריביו & למכורFCS. ADD.050010% (50 מ"ל)
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140-1221% (5 מ"ל)
<חזק>מדיום תרבית קרטינוזיטן (500 מ"ל):
קרטינוציטים גידול בינוני 2פרומוסל C-2011189% (445 מ"ל)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPackPromocell C-39011
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140-1221% (5 מ"ל)
<תמיסת נטרול ג'ל חזק>ה (250 מ"ל):
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, אבקת גלוקוז גבוהה עם L-גלוטמיןPAAG0001,301093% (232.5 מ"ל)
כונדרואיטין סולפט מלח נתרן מסחוס כרישSigmaC4384-1g1% (2.5 מ"ל)
סרום בקר עובריBio & למכורFCS. ADD.05003% (7.5 מ"ל)
HEPESSigma H3375-1 ק"ג3% (7.5 מ"ל)<
קרטינוציטים גידול בינוני 2פרומוסל C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 תוספי תזונהPromocell C-39011
סרום עגל עובריביו & למכורFCS. ADD.05005%-2% (25 מ"ל-10 מ"ל) 
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140-1221% (5 מ"ל)
<חזק>דגם עור ממשק אוויר-נוזל בינוני (500 מ"ל):
קרטינוציטים גידול בינוני 2
גידול בינוני 2 חבילת תוספי תזונהPromocell C-39011מוסיף רק תוספי מזון: אינסולין, הידרוקורטיזון, אפינפרין, טרנספרין, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140-1221% (5 מ"ל)
CaCl2 (300 מ"מ)סיגמא C7902-500 גרם0.62% (3.1 מ"ל)<
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRPDCSPD000KIT
נוגדן וימנטיןAbcamab92547
CK14 נוגדןסיגמא HPA023040-100 ומיקרו; l
CK10 נוגדןDakoM7002
Filaggrin נוגדןAbcamab81468
<חזק>H& מכתים E: < / חזק>
מאייר וחריף; s HaemalaunAppliChemA0884,2500
קסילולסיגמא אולדריץ'296325-4X2L
אתנולסיגמא אולדריץ'32205-4X2.5L
HClסיגמא אולדריץ'H1758-500 מ"ל
אאוזיןסיגמא אולדריץ'E4009-5G
2-פרופנולולסיגמא אולדריץ'I9516-500 מ"ל
הרכבה בינוניתסיגמא אולדריץ'M1289-10ML
td colspan="4" ><חזק>צולל דגם עור בינוני (500  מ"ל):קרטינוציטיםtd colspan="4"><חזק>היסטולוגיה:

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
  2. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
  3. Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
  4. Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
  5. Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
  6. Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
  7. Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
  8. Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
  9. Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
  10. El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
  11. Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
  12. Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
  13. Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
  14. Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
  15. Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
  16. Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
  17. Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
  18. El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
  19. Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
  20. Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
  21. Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
  22. Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
  23. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים