פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

Summary

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

Abstract

לאחרונה הוכח כי הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA), פלטפורמת הגברה איזותרמית לזיהוי פתוגנים, עשויה לשמש לכימות ריכוז דגימת ה-DNA באמצעות עקומה סטנדרטית. בכתב יד זה, מסופק פרוטוקול מפורט לפיתוח ויישום בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז כמותית בזמן אמת (בדיקת qRPA). תוך שימוש בכימות DNA של HIV-1 כדוגמה, מתוארים כולם הרכבה של תגובות RPA בזמן אמת, עיצוב רצף בקרה חיובית פנימית (IPC) והגברה משותפת של ה-IPC והיעד המעניין. ניתנים הוראות ותסריטי עיבוד נתונים לבניית עקומה סטנדרטית באמצעות נתונים מניסויים מרובים, אשר עשויים לשמש לחיזוי ריכוז הדגימות הלא ידועות או להערכת ביצועי הבדיקה. לבסוף, מתוארת שיטה חלופית לאיסוף נתוני פלואורסצנטיות בזמן אמת עם מיקרוסקופ ומחמם במה כצעד לקראת פיתוח בדיקת qRPA נקודתית. הפרוטוקול והסקריפטים המסופקים עשויים לשמש לפיתוח בדיקת qRPA עבור כל יעד DNA מעניין.

Introduction

הגברה חומצות גרעין הכמותית היא טכניקה חשובה לזיהוי של איכות הסביבה, foodborne, ופתוגנים שמקורן במים, כמו גם לאבחון קליני. תגובה בזמן אמת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) היא שיטת תקן הזהב לגילוי רגיש, ספציפי, וכמותי של חומצות גרעין, למשל, לHIV-1 בדיקה נגיפית עומס, זיהוי של חיידקים פתוגנים, ובדיקות סקר לאורגניזמים רבים אחרים ^{- 1 3.} במהלך זמן אמת qPCR, פריימרים להגביר DNA הפתוגן במחזורים, ואות ניאון שנוצרה היא פרופורציונאלי לכמות ה- DNA המוגבר במדגם בכל מחזור. מדגם המכיל ריכוז לא ידוע של DNA הפתוגן ניתן לכמת באמצעות עקומה סטנדרטית המתייחסת הריכוז הראשוני DNA של דגימות סטנדרטי והזמן שבו אות הניאון מגיעה ....

Protocol

תכנית 1. Cycler התרמי לתגובות qRPA בזמן אמת

1. צור פרוטוקול חדש בתוכנת Cycler התרמית.
   1. הכנס צעד מראש דגירה: 39 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
   2. הוסף צעד שני: 39 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ואחריו צלחת קריאה.
   3. לבסוף, הכנס "ללכת" שחוזר על השלב השני 59 פעמים יותר.
   4. שמור את הפרוטוקול.

Results

לפני בחירת רצף לשמש IPC בניסויי qRPA עם יעד מועמדי DNA (HIV-1), שליטה פנימית חיובית (IPC) נוצרים והוקרנו ביכולתם להגביר בתגובות qRPA ללא נוכחי DNA HIV-1. מועמדי IPC הם ארוכים יותר מהיעד (HIV-1) DNA כדי למנוע היווצרות IPC מהיווצרות amplicon HIV-1 מתחרה-out. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הדור של שני C. מועמדי parvum IPC אומתו על ידי הנוכחות של 415 ולהקות 435 נ"ב באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. בתגובות qRPA, מועמד IPC הקצר הציג הגברה קטנה (איור 2),

Discussion

על מנת לקבל נתונים כימות משמעותיים באמצעות אלגוריתם MATLAB, המשתמש חייב לבחור ערכי קלט מתאימים כאשר תתבקשו לעשות זאת. לאחר ביצוע כל תסריט בסעיפים 5 ו -6, כל משתני הקלט שנשלחים באופן אוטומטי בחלון הפקודה ותפוקות נוצרות באופן אוטומטי. בסעיף 5.7 המשתמש יתבקש לבחור סף מדרון. הערך של סף המדרון משפיע על הריבוע של מקדם המתאם (r ²⁾ לכושר. כאשר משתמשים בנתוני הקרינה גלם מיוצאים מCycler תרמית, ערכים בין 2.0 ו -5.0 נוטים להניב r ² מקדם גבוה. בסעיף 5.8 המשתמש חייב לציין .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA Assay
HIV-1 קדימה פריימר	משולב טכנולוגיות DNA	מותאמות אישית DNA אוליגוס	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'
HIV-1 פריימר הפוך	טכנולוגיות DNA משולבות	מותאמות אישית DNA אוליגוס	5'-CCC GAA AAT TTT GA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G-3'
בדיקת HIV-1	BioSearch Technologies	אוליגוס DNA מותאם אישית	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'
בדיקת IPC	BioSearch Technologies	אוליגוס DNA מותאם אישית	5'-AGG TAG TGA CAA GA ATA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
ריאגנטים exo RPA (כדורים, מאגר התייבשות, מגנזיום אצטט	TwistDx	TwistAmp רצועות צינור PCR אקסו
	BioRad	TLS0801
PCR רצועות צינור מכסה שטוח	BioRad	TCS0803
דבק מיקרו-אטם	BioRad	558/MJ
יעד HIV-1 (pHIV-IRES- eYFPΔ סביבה ודלתא; VifΔ Vpr)			פלסמיד מותאם אישית, ראה: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. אפיון וזיהוי של lentivirus בעל יכולת שכפול מלאכותי של טווח מארח שונה. טיפול מולקולרי 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
DNA גנומי זכר	אנושי יישומי ביוסיסטמס	360486
96 באר בלוק קר	קול פארמר	EW-36700-48
מחזורי תרמי	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
מערבולת	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free	water Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	ניתן גם להזמין מטרה סינתטית דו-גדילית מ-IDT אם המשתמש אינו מצויד לעבוד עם C. parvum (חומר זיהומי BSL-2). פריימרים PCR ו-RPA עבור C. parvum תוכננו באמצעות מספר כניסה של GenBank AF115377.1
פריימר PCR קדימה	טכנולוגיות DNA משולבות	מותאמות אישית DNA oligos	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
PCR ארוך הפוך פריימר	משולב DNA טכנולוגיות	DNA מותאם אישית	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion High Fidelty DNA פולימראז ניו	אינגלנד Biolabs	M0530S
ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick Qiagen		28704
TAE 10X מאגר	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
ניסויי
מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף	Zeiss	Zeiss Imager.J1
מחמם	במה כלים ביו-מדעיים	TC-GSH
1 ערוץ דיוק יציבות גבוהה בקר טמפרטורה	ביו-מדעיים	TC-1100S
FAM/GFP קוביית מסנן	זייס	סט מסננים 38 (000000-1031-346)	עירור BP 470/40 ננומטר, פליטה BP 520/50 ננומטר
קוביית מסנן HEX	Chroma	49014	עירור BP 530/30 ננומטר, פליטה BP 575/40 ננומטר
חותך לייזר	רשת חרט	VLS3.60
1/8 אינץ' אקריליק שחור	מקמאסטר קאר	8505K113
1.5 מ"מ אקריליק שקוף	מקמאסטר קאר	PD-72268940
סופר דבק	אופיס דיפו	דורו סופר דבק
שמן מינרלי בדרגת PCR	Sigma Aldrich	M8662-5VL
ניתוח
Microsoft	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB סקריפט : "JoVE_qRPA_standard_curve.m"	כלול בתסריט SI
MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	כלול בתסריט SI
MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	כלול ב-SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	כלול ב-SI
JoVE_qRPA_base.ai	כלול בתוכנת SI
AxioVision	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	כלול ב-SI