מאמר שיטה

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

DOI:

10.3791/52650

⸱

24 במרץ 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בדיקת qRT-PCR בעלת תפוקה גבוהה לניתוח חתימות ביטוי IFN מסוג I ו-III. הבדיקה מפלה הבדלים בזוגות בסיסים בודדים בין התעתיקים הדומים מאוד של גנים אלה. באמצעות הרכבת אצווה ופיפטינג רובוטי, הבדיקות עקביות וניתנות לשחזור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתואר בדוח זה הוא בדיקת qRT-PCR לניתוח של שבעה עשר תת-סוגים של IFN אנושיים בפורמט צלחת של 384 בארות המשלב בדיקות ספציפיות ביותר של חומצת גרעין נעולה (LNA) ומשואות מולקולאריות (MB), תקני תמלול, פיפטינג רב-ערוצי אוטומטי וייבוש צלחות. קביעת הביטוי בקרב אינטרפרונים מסוג I (IFN), במיוחד שנים עשר תת-הסוגים IFN-α, מוגבלת על ידי זהות הרצף המשותפת שלהם; כמו כן, הרצפים של IFN מסוג III, במיוחד IFN-λ2 ו-λ3, דומים מאוד. בדיקה זו מספקת אמצעי אמין, ניתן לשחזור וזול יחסית לניתוח הביטוי של שבעה-עשר תעתיקי תת-הסוג של אינטרפרון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוגי I ו- III אינטרפרונים (IFN) הם קריטיים בתגובה החיסונית לוירוסים וגירויים פתוגניים אחרים ובהווה בכל החוליות 1. תאי מערכת חיסון ואינו חסינים להביע ולהפריש, כמו גם להגיב ל, IFN 2. חיישני חיסון מולדים, כגון קולטנים לחיוג כמו (TLR), סטינג, וRIG-אני, לגרום לי סוג וביטוי III IFN על זיהוי של דפוסי הפתוגן קשורים מולקולריים (PAMP) 3,4. בבני אדם, סוג אני IFN כולל IFN-β, -ω, -κ, ו -12 תת-סוגים של IFN-α, ונקשר לרצפטור IFNAR1 / IFNAR2 המורכב 2,5. סוג III IFN כולל IFN-λ1, -λ2, ו-λ3 ולהיקשר לקולטן המורכב IL10RB / IL28RA 2. קלסי, סוגי I ו- III IFN נקשרים לקולטן מתחמים המיוחסים להם שלאחר מכן לגייס STAT1 / heterodimers STAT2 וליזום שעתוק של גני אינטרפרון מגורה (ISG) 6. ISG מעורב במגוון הרחב של פונקציות, מנגיפים ואנטיפעילות שגשוג להפעלה של התגובה החיסונית אדפטיבית 7.

מנגנונים הרבים פתוגנים התפתחו כדי להתחמק, ​​לערער, ​​ולחטוף את האלמנטים של מסלול איתות IFN להדגים את החשיבות של IFN בתגובה החיסונית המולדת 8. לדוגמא, וירוס vaccinia מבטא קולט דמה עם ההומולוגיה IFNAR1 שsequesters הקלד אני IFN 9 בעוד וירוס מחלה דמוי Yaba מפריש גליקופרוטאין שמעכב הקלד I ו- III IFN חלבונים 10. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, IFN גם מעורב במעקב הסרטן ומספר מחלות אוטו-דלקתי: השתקת ביטוי IFN בתאי סרטן השד מגבילה immunosurveillance 11, ייצור יתר של IFN-α הוא מנגנון בפיתוח מערכתי זאבת אדמנתית 12, והפעלה תועה של סטינג מובילים לדלקת מערכתית הנגרמת על ידי כמויות עודפות של IFN בvasculopathy הקשורים STING13. טיפולי, IFN משמש לטיפול בטרשת נפוצה 14, זיהומים נגיפיים כרוניים כגון 15 HBV ו- HCV 16,17, וסוגי סרטן כמו לוקמיה שעיר תא 18 ולוקמיה מיאלואידית כרונית 19. שאלות על הרלוונטיות של IFN בתהליך פיסיולוגי מסוים ברציפות לחשוף את הטבע בכל מקום של משפחת ציטוקינים זה.

הקלד אני IFN, במיוחד תת IFN-α, נחשב לעתים קרובות כישות אחת 20-23, ולא כקבוצה קשורה באופן הדוק, אך ברורה, חלבונים. הקיום וההתמדה של מיני IFN המרובים כולל תת IFN-α, לאורך האבולוציה חוליות 24 מצביעים על כך שלפחות קבוצת משנה של תת אלה יש פונקציות ספציפיות או ייחודיות. ייתכן שדפוסי ביטוי IFN הגדרה יהיו לפענח ולעזור לאפיין את הפונקציות הספציפיות של אחד או יותר מתת 17. האתגר של לימוד tהוא מקליד תת I ו- III IFN מבוסס על זהות הרצף המשותפת שלהם: שנים עשר תתי הסוגים IFN-α לשתף> 50% 25 ותת IFN-λ לשתף 81-96% 26 של רצפי חומצות אמינו שלהם. בassay qRT-PCR שתואר, משואה מולקולרית (MB) וחומצות גרעין נעולות (LNA) בדיקות ניאון להפלות הבדלי זוג בסיס יחידים בין הרצפים תת סוג IFN דומים מאוד ומאפשרים האפיון של חתימת ביטוי IFN. פורמט הצלחת 384 גם של assay כולל שני (סטנדרטים פרוטוקול) כמותי ו( גני משק הבית (HKG)) חצי כמותית אמצעים, המאפשר ניתוח על ידי עותק תמליל מספר וΔCq בהתאמה. הרכבה אצווה, בהנחייתם של pipetting אוטומטית רבת ערוצים, ואחסון לטווח ארוך, אפשרית באמצעות ייבוש פריימר / הבדיקה (Pr / Pb) קובעת על הצלחות, לשפר את שחזור, שירות, והמעשיות של assay.

פרוטוקול זה מתאר את התהליךלהכנת 384 גם צלחות assay qRT-PCR (איור 1) עם עד שבעה עשר קבוצות שונות Pr / Pb מיקוד תת אנושי IFN (טבלת 1). Pr / Pb להגדיר עובד צלחות מקור המניה (איור 2) משמשות להכנה מרובה 384 גם צלחות assay בתהליך שיכול להיות אוטומטי באמצעות pipettor רב-ערוצי רובוטית. בעוד ההתמקדות הראשונית הייתה על יצירת פרוטוקול ללימוד חתימות ביטוי IFN אדם, שיטה זו יושמה על קופי רזוס, כמו גם. למרות צלחת הפריסות שונות במקצת וסטי Pr / Pb (טבלת 2) נבדלים, שיטת ההכנה כוללת ליצירת הצלחות האנושיות ורזוס היא זהה. עם שינויים מינימאליים של הפרוטוקול, השיטה יכולה להיות מוצאת להורג, כדי לאפשר פיתוח של מבחני ללמוד קבוצות אחרות של גנים הקשורים באופן הדוק.

דמויות ראו 1 ו -2 להלן

ראה לוחות 1 ו -2 Below

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דילולי סדרה רגיל (איור 3 א)

הערה: סדרת דילול סידורי של פלסמידים לינארית המכילים הרצפים ממוקדים על ידי מערכת Pr / Pb משמשות כסטנדרטים כמותיים לassay qRT-PCR. כל סט דילול סדרתי סטנדרטי לתת IFN מכיל נפח מספיק כדי לרוץ 90 צלחות assay. ארבע נקודות של עקומת הדילול הסטנדרטי המשמשת לassay נבחרו כדי לכסות ערכי ה- CT ממגוון של 20 עד 32 (טבלה 3).

  1. הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה סטנדרטית (50 בצהריים) ו- DNA זרע סלמון (ssDNA, 10 מ"ג / מיליליטר) פתרונות מניות.
  2. מכין את תערובת ssDNA / מים לדילול 17 סטים סטנדרטיים על ידי ערבוב 51 μl של ssDNA עם 20.3 מיליליטר של מים.
  3. תווית רצועת PCR 8-צינור אחד עבור קבוצת דילול סטנדרטית.
    הערה: הכנת דילולים הסידוריים סטנדרטיים מפתרוני המניות תיקח 2-3 שעות.
  4. לוותר 190 μl של תמהיל ssDNA / מים לfצינור irst ברצועה ו -180 μl של ssDNA תערובת / מים לחמישה צינורות הנותרים.
  5. לבצע דילול 01:20 על ידי העברת 10 μl מהמניות רגילות 50 בערב ועד הצינור עם 190 μl של ssDNA / המים, לערבב; מערבולת ובמהירות צנטריפוגות רצועת PCR.
  6. לבצע דילול 1:10 על ידי העברת 20 μl מהצינור ביותר בדילול לאחרונה לצינור הבא בסדרה; מערבולת ובמהירות צנטריפוגות רצועת PCR.
  7. חזור על שלב 1.6 עד הצינור האחרון בסדרת הדילול קיבל הסטנדרטי.
  8. חזור על שלבים 1.3-1.7 עבור כל תקן.

ראה טבלה 3 להלן

2. הכנת פריימר / Probe (Pr / Pb) ואין תבנית הבקרה (NTC) עבודה בורסת תערובות (איור 3)

הערה: כל 1.7 מיליליטר Pr / Pb להגדיר עובד מניות ו128.6 μl אין תבנית בקרה (NTC) עובד תמהיל המניה תעשה 30 צלחות assay.

  1. הכן את Pr / Pb להגדיר תערובות המניה עובדות.
    לאE: הכנת סט Pr / Pb ומנייה עובדת NTC מתערבבת מפתרוני המניות תיקח 2-3 שעות.
    1. Resuspend פריימרים ובדיקות בבית 100 מיקרומטר עם מים טהורים להכנת פתרונות מניות.
    2. תווית עד שבע עשרה 2 צינורות מיליליטר; אחד עבור כל קבוצת Pr / Pb הכלול בassay.
    3. הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה פריימרים (100 מיקרומטר), בדיקות (100 מיקרומטר), וssDNA (10 מ"ג / מיליליטר) פתרונות מניות.
    4. הוסף 2 μl של ssDNA לכל צינור באמצעות פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. הוסף את פריימר קדימה המתאים, לאחור תחל, ולחקור לכל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה. ראה בטבלת 1 סטי Pr / Pb מיקוד תת IFN אדם וטבלה 2 למקוק רזוס סטי Pr / Pb. מוסיפים מים כדי להביא את עוצמת הקול של כל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה ל -200 μl.
      הערה: הנפח של פריימרים, בדיקה, ומים להוסיף תלויה בריכוז התגובה הסופי המבוקש לPr / Pbלהגדיר.
  2. הכן את תערובות המניה NTC עובד.
    1. שתי רצועות PCR 5-הצינור לייבל למניות פועלות NTC מתערבבת.
    2. העבר 14.3 μl של כל Pr / Pb מוגדר צינור תערובת המניה עובדת המתאים NTC. ראה טבלה 4 לשילובי סט Pr / Pb לבארות NTC. מוסיף מים לכל אחד מהמנייה עובדת NTC מתערבב להביא את הנפח הסופי 128.6 μl.
    3. וורטקס, צנטריפוגה בקצרה, ולמקם את הצינורות בחושך על קרח או ב -20 ° C לאחסון ארוך טווח.

ראה טבלה 4 להלן

  1. לדלל את Pr / Pb להגדיר מניות עובדות.
    1. בעקבות הסרת aliquot של סטי Pr / Pb נדרשים לתערובות המניה עובדת NTC, להוסיף 1.5 מיליליטר של מים כדי להביא את הנפח הסופי של כל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה לרמה של 1.7 מיליליטר.
    2. וורטקס, צנטריפוגה בקצרה, ולמקם את הצינורות בחושך על קרח או ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך יותר.
3. הכנת לוחות assay 384 גם באמצעות pipettor רב-ערוצי האוטומטיים

  1. הכן צלחת מקור 96-היטב של סטי Pr / Pb ותערובות של NTC לaliquoting 384-גם צלחות assay.
    הערה: הכנת צלחת המקור מתערובות מניית פעולת Pr / Pb תיקח פחות משעה 1. כל צלחת מקור 96-גם היא מספיק כדי להפוך את שש צלחות 384 גם assay (איור 3 ג).
    1. מערבולת בקצרה צנטריפוגות Pr / Pb להגדיר מניות פועלות ותערובות של המניה עובדת NTC.
    2. מניחים צלחת 96-היטב חדשה בבלוק 96-היטב קירור מקורר ולייעד את הבארות עבור כל קבוצת Pr / Pb או NTC לערבב הבארות לקבל (ראה איור 2).
    3. מוסיף מים עד לצלחת 96-היטב בעזרת פיפטה רבה 250 μl אלקטרונית: לוותר 66 μl מים לכל Pr / Pb להגדיר היטב (למעט 4 הבארות ליעד 17). לוותר 82.5 μl מים ל4 יעד 17 הבארות. לוותר 27.5 μl מים לכל תערובת NTC כן.
    4. הוסף את Pr / Pb הנכון להגדיר עובד המניה לבארות המיועדות של הצלחת 96-היטב: לוותר 54 μl של Pr / Pb הנכון להגדיר עובד המניה לבארות המיועדות Pr / Pb הסט (למעט 4 הבארות ליעד 17). לוותר 67.5 μl של היעד 17 Pr / Pb להגדיר עובד המניה ליעד 17 בארות סט Pr / Pb המיועדים. להוסיף 22.5 μl של התמהיל הנכון NTC עובד המניה לבארות המיועדות.
    5. חותם את צלחת 96-היטב עם חותם צלחת דבק ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 XG כדי להבטיח שהתוכן בחלק התחתון של הבארות.
    6. מניחים את הצלחת 96-היטב במיקסר המערבולת באמצעות מתאם צלחת 96-היטב ולערבב 1 דקות ב 1000 סל"ד. צנטריפוגה הצלחת 96-היטב במשך 5 דקות ב 700 x גרם.
    7. אחסן את צלחת מקור 96-גם בחושך על 4 מעלות צלזיוס אם באמצעות באותו היום, אחרת לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש.
  2. הכן את צלחות assay 384 גם על ידי הוספת Pr / Pb מגדיר באמצעות pipettor רב-ערוצי האוטומטיים.
    הערה: הכנה של שש צלחות assay מצלחת המקור 96-גם תיקח 3-4 שעות.
    1. לפני ביצוע צלחות, מראש לצנן את קן הקירור עד 4 מעלות צלזיוס וחימום מוקדם של מאייד הצלחת 125 ° C וגוש החום התחתון עד 80 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר נושבת בין 20-25 ליטר לדקה (LPM).
    2. הפעל את pipettor רב-ערוצי האוטומטיים ולפתוח את הפרוטוקול להכנת לוחות assay IFN על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.
    3. להתקנת הפלטפורמה, למקם את תיבת קצה pipet מלאה לחלוטין בעמדת פלטפורמת 1, 96-גם צלחת המקור בעמדת 4, וצלחת 384 גם חדשה בעמדה 6. בגין הריצה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.
      הערה: בסיומה של ריצה, כל טוב יכיל 5 μl של תמהיל Pr / Pb.
      הערה: הסכום הסופי של ssDNA הוסיף לכל טוב של צלחת assay 384 גם היא 0.025 מיקרוגרם.
    4. לטפוח בעדינות את צלחת assay 384 גם על משטח שטוח כדי להבטיח נוזלים נמצאים בתחתית של הבארות וליישם דבקחותם צלחת.
    5. צנטריפוגה הצלחת 1 דקות ב 700 x גרם. הסר את חותם צלחת הדבק, למקם את צלחת 384 גם assay לתוך מייבש הצלחת ולמקם את סעפת 384 גם ישירות מעל הבארות.
    6. כאשר התוכן של הצלחת 384 גם assay יבש, להחיל חותם צלחת דבק חדש, לעטוף בנייר כסף, תווית, וחנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.
    7. חזרו על שלבים 3.2.3-3.2.6 עד 6 x 384 גם צלחות assay מוכנים או הנוזלי בצלחת מקור 96-גם מרוקנת.
    8. כבה את קן הקירור, סגור את התוכנה, ולכבות את pipettor רב-ערוצי האוטומטיים. כבה את מייבש הצלחת.

4. טעינה והפעלה פלייט 384 גם Assay

  1. הכן שני גן המשק (HKG) גם תערובות, אשר מורכבת של קבוצת Pr / Pb לHKG, ssDNA, תערובת אמן PCR, ומים, שיש להוסיף לצלחת 384 גם assay מיובש ( איור 3D).
    הערה: הכנת תערובות וטעינת צלחת assay תיקח 1-2 שעות. ריצת צלחת assay תיקח פחות משעה 2.
    1. תווית צינור 1.5 מיליליטר לכל תערובת HKG.
    2. לדלל 2 μl של ssDNA (10 מ"ג / מיליליטר) עם 84.9 מים μl. הוסף 2 μl של ssDNA המדולל, 11.8 μl מים, 23 μl של תערובת אב, ו -9.2 μl של 20x הנכון HKG Pr / Pr להגדיר על צינור אחד, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה.
    3. השתמש dehydrogenase glyceraldehyde-3-פוספט (GAPDH) ו- C יוביקוויטין (UBC) כHKG עבור assay האדם (ראה לוח חומרים). השתמש GAPDH וRNA ריבוזומלי 18S כHKG עבור assay רזוס.
      הערה: HKG משמש לביצוע assay גמיש וצריך לשקף את הגנים מתאימים לסוג התא שנבדקה GAPDH, UBC, ו18S הם דוגמאות לHKG נפוץ;. HKG האחר עשוי להיות מתאים יותר.
  2. הכן את המדגם וpositive לשלוט גם תערובות, אשר מורכבת של המדגם או cDNA שליטה החיובי, תערובת אמן, ומים, שיש להוסיף לצלחת 384 גם assay מיובש. הכן את המדגם ותערובות שליטה החיוביות במספיק כמות לוותר עד 21 בארות צלחת (איור 3D).
    1. לפני סינתזת cDNA, בצע את הוראות היצרן כדי להכין את דגימות RNA בצעד עיכול DNase.
    2. הכן את הדגימות ובקרה חיובית מראש מסינתזת cDNA של לפחות 500 ננוגרם של RNA ואחריו טיפול עם RNase H (נפח סופי של 24 μl עבור כל דגימה) הבאים הוראות היצרן. אחסן את cDNA מוכן ב -20 ° C עד לשימוש. הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה cDNA המדגם.
    3. להוסיף 78.8 μl של תערובת אמן ו54.8 μl מים לכל דגימה 24 μl וצינור ביקורת חיובי.
    4. מערבולת בקצרה צנטריפוגות הצינורות.
  3. הכן את הסטנדרטים וNTC גם מתערבב, consisting של תערובת אמן ומים, שיש להוסיף לצלחת assay 384 גם מיובש (איור 3D). לסטנדרטים גם לערבב, להוסיף 165 μl מים עד 275 μl של תערובת שני בצינור 1.5 מיליליטר. לNTC גם לערבב, להוסיף 52.5 μl מים ל52.5 μl של תערובת שני בצינור 1.5 מיליליטר. מערבולת בקצרה צנטריפוגות הצינורות.
  4. הכן צלחת assay 384 גם מיובשת לטעינה של תערובות ודוגמאות.
    1. הסר צלחת מיובשת 384 גם assay מ4 ° C ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 x גרם.
    2. מניחים את הצלחת על בלוק 384 גם קירור מקורר, להסיר את חותם צלחת הדבק ולהתוות את הבארות של הצלחת לייעד בי תערובות ודוגמאות השונות יהיו pipetted (איור 1).
  5. טען את צלחת assay 384 גם עם תערובת היטב סטנדרטית, סטנדרטים, NTC גם לערבב, דגימות, בקרה חיובית, ותמהיל HKG (איור 3E). כל הפתרונות וורטקס ו צנטריפוגות לזמן קצר לפני הניפוק לצלחת.
    1. לוותר 6 μl של הסטנדרטים ולערבב היטב כל אחד סטנדרטי עם פיפטה הרבה האלקטרונית 30 μl. לוותר 1.5 μl של דילול סדרתי הסטנדרטי הנכון למיועד גם עם פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית.
    2. לוותר 7.5 μl של NTC גם לערבב לכל NTC היטב עם פיפטה הרבה האלקטרונית 30 μl. לוותר 7.5 μl של המדגם לבארות המיועדות עם פיפטה רבה 30 μl האלקטרונית. לוותר 2.5 μl של HKG Pr / Pb תערובות לבארות המיועדות עם פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית.
    3. למלא את כל בארות ריקות עם 7.5 μl של תערובת מים ותערובת אמן שאריות עם פיפטה הרבה אלקטרוני 30 μl; 7.5 μl מים לבד יעבוד גם.
    4. חותם את צלחת 384 גם assay עם סרט הדבק האופטי ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 x גרם. מערבולת הצלחת 384 גם האטום במיקסר המערבולת 2 דקות ב2,600 סל"דוצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 700 x g.
    5. מניחים את צלחת assay 384 גם האטום במכונה qRT-PCR, לפתוח את התבנית לפריסת assay ולהתחיל לרוץ.
      תוצאות ניתן לייצא כגיליון אלקטרוני או כקובץ טקסט לניתוח: הערה.
    6. השתמש בתנאים התרמיים אופטימליים הבאים תגובת Cycler עבור assay: i) 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ii) 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, iii) 95 מעלות צלזיוס למשך 25 s, iv) 59 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. חזור על השלבים III ו- IV במשך 40 מחזורים.
    7. לייצא את הנתונים הגולמיים מפלטפורמת qRT-PCR ליישום תוכנת גיליון אלקטרוני. עלילה כל תקן שנקבע כעקומה סטנדרטית להתבונן ליניאריות 4 נקודות. ביצוע ניתוח על ידי חישוב ΔCq או על ידי עותק מספר מבוסס על העקומות סטנדרטי ארבע נקודת 27.

ראה איור 3 להלן

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay qRT-PCR מתואר יכול להיות מיושם לנתח דפוסי ביטוי של סוגי I ו- III IFN במגוון רחב של סוגי תאים והקשרים. לדוגמא, אני סוג של אדם וחתימות ביטוי III IFN נותחו בתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMC) מ -6 תורמי מגורה עם ligands TLR; LPS C (25 מיקרוגרם / מיליליטר), (10 מיליליטר / ng), imiquimod (10 מיקרומטר), וoligonucleotides CPG (1 מיקרומטר) (איור 4): פולי אני. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת יישום גיליון אלקטרוני ומוצגים כתרשימי רדאר עם תת IFN-α מסודר בכיוון השעון לפי עץ פילוגנטי של רצף החלבון שלהם 27. תרשימי הרדאר של ביטוי IFN האנושי מוצגים בקנה מידת יומן מחושב באמצעות שתי שיטות שונות של ניתוח שולב בעיצוב assay: ערך CQ מוחלט המנורמל לHKG (ΔCq), ולהעתיק את מספר התבנית למיקרוגרם (מק"ג) של רנ"א הכל . ערכי מספר עותק מחושבים מo התוצאות עקומת הסטנדרט של תמליל fa. הנתונים מראה כי חתימות ביטוי אנושיות IFN שהושרו על ידי אגוניסטים TLR הן יגנד ספציפיים.

ראה איור 4 להלן

כפי שהודגם לחתימות ביטוי IFN האנושיות, חתימות ביטוי של סוגי I ו- III IFN בקופי רזוס היו גם יגנד TLR הספציפי. PBMC מ 3 תורמים היו מגורה עם פולי אני: C (50 מיקרוגרם / מיליליטר), LPS (10 מיקרוגרם / מיליליטר), וimiquimod (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 3 שעות (איור 5). הביטוי תת סוג IFN בתאי unstimulated בתחילת המחקר היה נמוך. מספר מוגבל של IFN- תת באו לידי ביטוי בתגובה לLPS ופולי אני: C. בניגוד לכך, ביטוי IFN בתגובה לimiquimod היה גבוה והביטוי תת הסוג היה רחב. ביטוי של IFN-β וIFN-λ1 היה מוגבר על ידי כל שלושת TLR אגוניסטים 28.

ראה תרשים 5 להלן

תמיד "> figure-results-1
איור 1:. מספר הפריסה לצלחת 384 גם assay עם שבע עשרה סטי Pr / Pb יעד מתייחס לסט Pr / Pb. עקומות ארבע הנקודה סטנדרטית (המשולש אפור כהה) מתווספות לעמודי 1-5. סטי HKG Pr / Pb (הרקע לבן) מתווספים לעמודי 6 ו -7 עמודים שנותרו, 8-24, הם ספציפיים לאחד משבעת-העשרה סטי Pr / Pb. דוגמאות נוספות לשורות AP, מעמודים 6-24 (חיצים שחורים). שתי הבארות (O5, P5) בחלק התחתון של עמודה 5 מקבלות רק מים ותערובת אמן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2:. הפריסה לצלחת מקור 96-היטב עם שבע עשרה סטי Pr / Pb מספר היעד מתייחס לPr / Pbלהגדיר. חיצים שחורים מייצגים כאשר סט Pr / Pb מתווסף בארות מרובות. תערובות NTC מתווספות לבארות המיועדות (הרקע אפור כהה). שתי הבארות (F3, G3) עם קווים אלכסוניים הן שאינן בשימוש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: סכמטי של צעדים ספציפיים בפרוטוקול assay qRT-PCR תרשים AE לבחור חלקים מהפרוטוקול.. (א) שלב 1: הכנת דילולים סדרתי סטנדרטיים. הכנת תערובות המניה עובדת Pr / Pb וNTC: שלב 2 (ב). הכנה של צלחת מניות 96-גם עבודה של סטי Pr / Pb ותערובות של NTC: שלב 3.1 (C). שלב (D) 4.1-3: הכנת התערובות לטעינת צלחת 384 גם assay. (E) Step 4.5: טעינת צלחת 384 גם assay. תרשימים נקראים משמאל למעלה בפינה הימנית התחתונה. ריאגנטים לאינטרפרון assay (IFN) מאוחסנים ב -20 מעלות צלסיוס ושמותיהם מופיעים בעמודה השמאלית; פעולות נפרדות קווים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4: החתימה האנושית ביטוי IFN בתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) שונה בתגובה לligands TLR משמש לגירוי PBMC היו מגורה עם ligands TLR וRNA היה לקצור לניתוח qRT-PCR.. האמצעים הגיאומטריים של תגובות השיא לפולי אני: C (25 מיקרוגרם / מיליליטר) בשעה 8 שעות (ריבועים אדומים), LPS (10 ng / ml) בשעה 4 שעות (משולשים ירוק), imiquimod (10 מיקרומטר) בשעה 16 שעות ( יהלומים סגולים), CPG (1 מיקרומטר) ב16 שעות (עיגולים שחורים), ושליטה unstimulated ב 16 שעות (עיגולים כחולים) מ -6 תורמים מוצגות ביומן 10 בקנה מידה כפונקציה של ביטוי של HKG UBC ΔCq (משמאל) או כעותק מספר לכל מיקרוגרם של RNA (מימין) . תת IFN-α מסודרים על פי עלילת פילוגנטי דמיון רצף חומצות האמיניות. נתון זה פורסם במקור באימונולוגיה והביולוגיה של תא 27.

figure-results-5
איור 5:. חתימת רזוס IFN מקוק הביטוי בתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) שונה בתגובה לligands TLR משמש לגירוי PBMC משלושה קופי רזוס (שנקבע על ידי רבוע, יהלומים, ומשולש) היו מבודד מכל דם ו מגורה עם lipopolysaccharide (LPS) (10 מיקרוגרם / מיליליטר), פולי אני: C (50 מיקרוגרם / מיליליטר) או imiquimod (10 מיקרוגרם / מיליליטר). תאים נקצרו ב0 שעה (אופn צורות) או אחרי 3 שעות של גירוי TLR (צורות סגורות) למדידת ביטוי IFN. רמות התמליל אני סוג, II ו- III IFN מוצגות ביומן 10 בקנה מידה כפונקציה של ביטוי של HKG GAPDH ΔCq (משמאל) או כRNA מספר / מיקרוגרם עותק (מימין). נתון זה פורסם במקור בכתב העת של אינטרפרון וציטוקין המחקר 28.

figure-results-6
טבלה 1:. רצפי סט פריימר / בדיקה IFN אדם ותגובת מידע אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

figure-results-7
טבלה 2:. רצפי סט מקוק רזוס IFN פריימר / בדיקה ותגובת מידע אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

ריכוז פלסמיד (FM)
B C D
IFN-α1 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α2 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α4 2,500 250 25 2.5
IFN-α5 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α6 250 25 2.5 0.25
IFN-α7 250 25 2.5 0.25
IFN-α8 250 25 2.5 0.25
IFN-α10 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α14 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α16 250 25 2.5 0.25
IFN-α17 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α21 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ1 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ2 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ3 250 25 2.5 0.25
IFN-β 25 2.5 0.25 0.025
IFN-ω 250 25 2.5 0.25

לוח 3: מידע ריכוז סט דילול רגיל.

סטי IFN Pr / Pb הוסיפו נפח מים מוסף (מיליליטר)
NTC 1 IFN-β, -ω, -λ3 85.7
NTC 2 IFN-α1, -α5 100.0
NTC 3 IFN-α2 114.3
NTC 4 IFN-α4 114.3
NTC 5 IFN-α7 114.3
NTC 6 IFN-α6, -α8, -α10 85.7
NTC 7 IFN-α14, -α16 100.0
NTC 8 IFN-α17 114.3
NTC 9 IFN-α21, -λ1 100.0
NTC 10 IFN-λ2 114.3

לוח 4: המניה עובדת NTC מתערבבת מידע.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו"ח זה מתאר עיצוב, ייצור אצווה, וגישה כלפי ניתוח של assay למדוד שעתוק של קבוצה של גנים דומים מאוד בהגדרת מעבדת מחקר. Assay qRT-PCR תפוקה הגבוהה דיווח כאן מודד את IFN- ו-- תת λ עם סגוליות גבוהות. שיטה זו כרוכה שני היבטים מרכזיים, העיצוב של סטי Pr / Pb שמפלים בין בני משפחת גן הומולוגי והפיתוח של פלטפורמת הפקה ליצירת צלחות assay אמינות ועקביות 384 גם מראש עם סטי Pr / Pb. בדיקות qRT-PCR לשלב או כימי גישה מבנית (MB) (LNA) לקראת שיפור הסגוליות שלהם 29. לשתיים מקבוצות פריימר בassay רזוס (הטבלה 2), מערכת ההגברה-עקשן מוטציה (נשק) שולבה ברצפי פריימר כדי לשפר את הספציפיות 30 נוסף. בזמן שהוא בדרך כלל הטוב ביותר כדי למקד את צמתים אקסון-אקסון לenhaהספציפיות פליטות של תגובת qRT-PCR, זה לא היה אפשרי בגלל הסוג אני IFN גנים אין אינטרונים. לכן, הדנ"א הגנומי יהיה מוגבר בתגובת PCR, והוא חייב להיות מושפל על ידי טיפול DNase לאחר מיצוי RNA.

אזור היעד לסטי Pr / Pb הוגבל לאזורי הקידוד של פפטיד הבוגר לכל IFN. בגלל דמיון רצף הגבוה בקרב תת IFN-α, במיוחד באזור פפטיד הבוגר, זה היה לפעמים יש צורך להתפשר רגישות כדי להבטיח סגוליות. זה היה במיוחד המקרה עם IFN-α17, שבו יש לו את תמליל פפטיד הבוגר רק ארבעה בסיסים ייחודיים בהשוואה נגד תת IFN-α האחר. IFN-α17 מיקוד הנדרש פריימרים המחייבים את התמלילים של תת מרובים, הגבלה ספציפי לבדיקה. כתוצאה מכך, תגובת PCR תגביר סוגים אחרים מאשר IFN-α17, ובכך לצרוך אחוז ניכר של חומרים כימיים PCR וlowering את המשרעת של אות הקרינה מהבדיקה הספציפית לIFN-α17. אתגר נוסף לעיצוב סטי Pr / Pb רגישים וספציפיים לגנים דומים מאוד כגון IFN הוא האפשרות שהרצפים באתר GenBank המבואר לא יכולים להיות מלאים או מקיפים בזמן של עיצוב. שוב, זה היה אתגר עבור IFN-α17, שבו רצפים מבואר חדש לא ליישר באופן מושלם עם הגרסה של הרצף באתר בעת העיצוב. לכן, בעת תכנון Pr / Pb מציב לגנים שלא נחקרו באופן אינטנסיבי, זה חכם כדי לבדוק את הרצף המבואר האחרון של גן יעד מעת לעת. לבסוף, יש צורך להבטיח שקבוצות Pr / Pb לא להגביר פסוידו-שניתן עיבד אבל לא תורגם.

לאחר עיצוב סטי Pr / Pb, האתגר הבא הוא אופטימיזציה תנאי PCR של שבע עשרה Pr / Pb שונה קובע בצלחת אחת 384 גם. סטנדרטים תמליל הם important בבדיקת הספציפי של קבוצת Pr / Pb ולהיות חיוניים להרמונית תנאי qRT-PCR של PCR התגובות השונות ומשונות. בדיקת סט Pr / Pb נגד הסטנדרטים התמליל קובעת את היעילות והרגישות שלה; פלסמידים המבטאים פסוידו-דומה מאוד עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי Pr / Pb להגדיר באופן סלקטיבי מודד שעתוק של הגן הפונקציונלי. הסטנדרטים התמליל גם לספק אמצעים כמותיים של ניתוח (מספר התמלילים), בנוסף לחצי כמותית הניתוח יחסית לגן משק (ΔCq).

pipetting רב-ערוצי רובוטית מצלחת מקור 96-היטב לתוך צלחות assay 384 גם מרובות משפר את הדיוק ועקביות של תוצאות בין-צלחת. DNA זרע סלמון (ssDNA) משמש כנשא שמייצב ומשמר את סטי Pr / Pb לאחסון ארוך טווח, כפי שעושה ייבוש ריאגנטים לוותר לתוך הצלחות. ייבוש הצלחות גם מקטין את הנפח של התגובההכרחי לתוצאות לשחזור, אשר בתורו שומרת דגימות יקרות ומפחיתה את השימוש בחומרים כימיים יקרים. באמצעות צעדים אלה, קבוצות של צלחות הם התאספו המספקות דיוק ועקביות במשך יותר משישה חודשים.

בעקבות הכנת צלחת, אמצעי בקרת איכות הוא קריטי כדי לבדוק את העקביות של קבוצה של צלחות. לצורך כך, ארבע קבוצות נוספות של סטנדרטים מנוהלות על צלחת. הצלחת "סטנדרטי 5x" עוקבת אחר ביצועים ויוצרת מערך נתונים שהסטנדרטים של צלחת פרט בהשוואה. בעוד עשרה דילולים של פי 10 של כל תקן משמשים במהלך עיצוב assay, שיקולי החלל דורשים כי ארבע נקודות משמשות לעקומה סטנדרטית על כל צלחת assay, ולצלחת סטנדרטית 5x. בנוסף, בקרה חיובית צריכה להיות כלולה בכל צלחת כדי להבטיח את תוקפו של הצלחת.

בדרך כלל, זה לוקח 3-4 שעות כדי להכין את שש צלחות assay מאחד Pr / Pb שלצלחת ource; זה אפשרי להכין שתים עשרה צלחות ביום אחד במעבדת מחקר. מאז כל צלחת assay תת אנושית IFN בוחנת שבע עשרה סטי Pr / Pb ויכולה להכיל חמישה עשר דגימות ניסוי, יום אחד של הרכבה מייצר קבוצה של צלחות עם היכולת לייצר עד 3,060 נקודות נתונים ניסיוניות. נתונים גולמיים מפלטפורמת qRT-PCR יכולים להיות מעובד ונאספו באמצעות תסריטי תכנות בתוכנת יישום גיליון אלקטרוני כדי למלא תבנית ניתוח מוגדרת מראש באופן אוטומטי. שיטה זו מקטינה את ידיים על הזנת נתונים, טעויות העתקה ובכך למנוע ומאפשרת לחוקר להתמקד בניתוח נתונים ולא הרכבה נתונים. כפי שתואר כאן, assay qRT-PCR תפוקה גבוה זה יכול להיות מיושם על מנת למדוד את הביטוי של תת אינטרפרון בדגימות מקוק רזוס אדם או ויכול להיות מותאם לשימוש עבור מינים אחרים או קבוצות גן הומולוגיות. הגמישות של פריסת הצלחת מאפשרת למשתמש לשנות את פריימר / בדיקה קובעת להתאים את הגנים שלריבית כלפי מערכת מודל סוג תא מסוים או. assay זה יכול להיות מיושם למדידת חתימות ביטוי IFN בדגמי תרבית תאים לומדים פתוגנים או בדגימות מטופל בהקשר של מודלים מחלה על מנת להבהיר את מנגנוני האיתות מעורבים בתגובה חיסונית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VPM ו-RLR הם ממציאים שותפים של הטכנולוגיה למדידת ביטוי של תת-סוגים IFN ו-IFN ולהפיק ממנה הכנסות מתמלוגים. שאר המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency הסכם YI-AI-6153-01, קרנות ביצוע עצמיות FDA ​​/ CBER, וה- FDA הנגד רפואי היוזמה. TCT, MNB, VPM, LMS, וKDK נתמכו על-ידי מינוי לתכנית להשתתפות במחקר במרכז להערכת ביולוגיה ולמחקר מנוהל על ידי Oak Ridge המכון לחינוך מדעי באמצעות הסכם Interagency בין departmen אנרגיה של ארה"ב ובארה"ב מנהל מזון ותרופות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רצועות צינור PCR 0.2 מ"ל Eppendorf (ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב)E0030 124 286
12 ערוצים 384 אקולייזר פיפטה אלקטרונית, 0.5-12.5 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)14-387-139*הופסק
12 ערוצים 384 אקולייזר פיפטה אלקטרונית, 1-30 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)14-387-137*
פיפטה אלקטרונית 12 ערוצים הופסקה, 5-250 ulתרמו-פישר סיינטיפיק (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב)14-387-118*
הופסק צינור מיקרו צנטריפוגה 2.0 מ"ל,מוצרים מדעיים סטריליים של Celltreat (שירלי, מסצ'וסטס, ארה"ב)229446
פיפטה אלקטרונית 8 ערוצים, 15-1250 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)14-387-115
מאגרי ריאגנטים חד פעמיים שהופסקו VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)89094-668מאגרי 25 מ"ל עם 2 חוצצים
E-CentrifugeWealtec Corp. (Sparks, NV, ארה"ב)1090003
Eukaryotic 18S rRNA (18S)Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)Hs99999901_s1סט פריימר/בדיקה Rhesus HKG
במהירות קבועה מיני וורטקסרתרמו-פישר סיינטיפיק (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)02-215-360
אטם צלחת דבק חדיר גזThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)AB-0580אטם צלחת חד פעמי המשמש בתהליך הכנת הצלחת 
גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)FBR (סילבר ספרינג, מרילנד, ארה"ב)הזמנה מותאמת אישיתסט פריימר/בדיקה HKG אנושי
גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)Rh02621745_g1פריימר/בדיקה Rhesus HKG
הדסון סולו פיפטור רב-ערוצי אוטומטי הדסון רובוטיקס (ספרינגפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)800200שונה עם קן קירור של 384 בארות
פלסמידים ליניאריים (גנים IFN)Aldevron (פארגו, ND, ארה"ב)הזמנה מותאם אישית3000, 3580; משמש לתקני בדיקה 
מעכבי LNAExiqon (וובורן, MA, ארה"ב)הזמנה מותאמת אישית500100
LNA ProbesSigma-Proligo (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)הזמנה מותאמת אישיתמספר חומר VC00023
קצות פיפט מסוננים מטריצה, 12.5 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)14-387-193
קצות פיפט מסוננים מטריקס, 30 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)14-387-196
קצות פיפט באורך מורחב של מטריקס TallTip, 1,250 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)14-387-160
קצות פיפט באורך מורחב של Matrix TallTip, 250 ulThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)14-387-152
צלחת תגובה אופטית של מיקרו-אמפר עם ברקודApplied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)N8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)4311971סרט דבק המשמש לאיטום הצלחת לפני הפעלת qRT-PCR 
גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel 2010Microsoft (רדמונד, וושינגטון, ארה"ב) של Office 2010Visual Basic 
מיקסר מערבולת MixMateEppendorf (ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב)5353 000.014מנגנון מערבולת צלחת דו-ממדית
בדיקות משואות מולקולאריותFBR (סילבר ספרינג, MD, ארה"ב)הזמנה
PCR Cooler, מערכת אחסון קר ללא קרח עבור 96 צלחות באר וצינורות PCREppendorf (ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב)Z606634-1EA
מייבש צלחות (סעפת)ייצור עיצוב מכני וחשמלי, משרד שירותי המחקר של NIH (בת'סדה, מרילנד, ארה"ב)מותאמת אישית
FBR (סילבר ספרינג, מרילנד, ארה"ב)הזמנה
pUC57 פלסמיד DNAGenescript (פיסקאטאווי, ניו ג'רזי, ארה"ב)SD1176
ללא Rnase 1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגהLife Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)AM12400
DNase ללא RNase סט (50)Qiagen (ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב)79254
RNase Hמעבדות ביולוגיות ניו אינגלנד (Ipswitch, MA, ארה"ב)M0297L
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen (ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב)74106
טיפים לרובוט (קצה שקוף קצות פיפט מעוקרים מראש)הדסון רובוטיקס (ספרינגפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)800350-S
תמיסת DNA זרע סלמוןInvitrogen (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב)15632-011
SoftLinx Version VHudson Robotics (ספרינגפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)בהזמנה מותאמת אישיתלתכנות צעדי פיפטינג
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), ללא AmpErase UNGLife Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)4352042
ABgene אטמי צלחות דבק   תרמו-פישר סיינטיפיק (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)AB0580
יוביקוויטין C (UBC)Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)Hs01871556_s1ערכת פריימר/בדיקה HKG אנושית
ערכת סינתזה Verso cDNAThermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)AB1453B
ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמתApplied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)4453536
Water-Ultra PureQuality Biological, INC. (גייטרסבורג, מרילנד, ארה"ב)351-029-101
Zipvap 384 (גוף חימום מייבש צלחות)Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, ארה"ב)384-109Aמייבש צלחות
* של סט פריט פריט שפת התיכנות מותאמת אישיתערכות פריימר בהזמנה מותאמת אישיתתוכנה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
  2. Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
  3. Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
  4. Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
  5. Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
  6. Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
  7. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
  8. Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
  9. Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
  10. Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
  11. Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
  12. Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
  13. Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
  14. Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
  15. Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
  16. Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
  17. Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
  18. Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
  19. Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
  20. Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
  21. Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
  22. Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
  23. Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
  24. Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
  25. Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
  26. Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933(2009).
  27. Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
  28. Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
  29. Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
  30. Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LNAMolecular Beacon384IIII

מאמרים קשורים