הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

33.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52671

⸱

22 במרץ 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery and Cancer, Imperial College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בדיקות ממוספירה צפה יכולות לחקור את תת-הקבוצה של תאי סרטן שד דמויי גזע ששורדים בתנאי השעיה ומראים גידול משופר כאשר הם מושתלים בעכברים. פרוטוקול זה מספק מדד נוח במבחנה של יכולת יצירת כדור, פרוקסי לגידול in vivo, תוך הקלה על ניתוח נוף השעתוק הקשור לגבעול.

תקציר

בדומה לרקמות בריאות, רב דם ומחל ממאירות סולידיות עכשיו חשבו להיות מאורגן באופן היררכי, עם תת-קבוצה של תאי סרטן כמו גזע שעצמי לחדש-בזמן והוליד צאצאים מובחנים יותר. הבנה ומיקוד תאים אלה גזע סרטני בסרטן השד, אשר עשוי להחזיק chemo- משופר והרדיו-התנגדות בהשוואה לגידול בכמות גדולה אינו גזע, הפכה אזור חשוב מחקר. סמנים כוללים CD44, CD24, ופעילות ALDH ניתן להעריך באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד מכאן ולהבא תאים המציגים tumorigenicity משופר כאשר מושתלים לעכברי מדוכאי חיסון: גם assay mammosphere הפך בשימוש נרחב ביכולתה לזהות sphere- למפרע יצירת תאים המתפתחים משיבוטים כמו תא גזע בודד. כאן אנו מתארים גישות לculturing המתאים של mammospheres משורות תאים או דוגמאות מטופל עיקריות, passaging, וחישובים להעריך f תחוםיעילות orming (SFE). ראשית עלינו לדון בשיקולים מרכזיים ואת חסרונות בתכנון ובפרשנות של ניסויי mammosphere המתאימים.

מבוא

קיומם של שושלות תאים הסרטניים בראשותו של תאי גזע סרטני כמו גזע הוסיף רב להבנת ההטרוגניות גידול שלנו. בעוד קצת גיוון פנוטיפי בגידולים אין נובע מהתולדה המשובט של שיבוטים גנטיים שונים, רכיב מהותי מופיע לנבוע מהבדלים אפיגנטיים: תאים סרטניים יכולים לעבור (לפעמים הפיך) בין גזע, אב, ומדינות מובחנות באמצעות הפעלה או דיכוי של גן ספציפי תוכניות ביטוי 1-3. זה עשוי לשקף גורמים פנימיים או חיצוניים תא, המשקף את תכנית ביטוי גנים בימים אלה באים לידי ביטוי בתא עם איתות autocrine התוצאה שלה בשילוב עם המנגנון פאראקריני משכנות סרטן, סטרומה או תאי מערכת חיסונית ומספק גורמי modulatory, ותנאי microenviromental כגון מידת היפוקסיה 2,4,5.

למרות גישות שושלת התחקות חדשניות מתקדמים את היכולת שלנו ללמוד תאי גזע סרטני משוערים בנישה שלהם in vivo 6-8, מבחני יוצרי תחום להישאר גישה פופולרית ונוחה להעריך את הפוטנציאל של תאי סרטן השד להתנהג כמו תאי גזע, לפחות בתנאי assay בשימוש. הוא משמש לעתים קרובות לצד שיטות רטרוספקטיבית לתאי גזע סרטני טיהור, על ידי הביטוי שלהם CD44 סמני קרום ו -9 CD24, ורמת הפעילות של ALDH (dehydrogenase אלדהיד) האנזים 10, סמנים שהוצעו למתאימים ליותר mesenchymal- ואפיתל תאי גזע סרטני דמויים בהתאמה 11. גישת היווצרות הכדור פותחה לראשונה כassay neurosphere, מה שמאפשר את הצמיחה של תאי גזע המשוערת משיבוטים בודדים בתנאים שאינם חסיד, סרום חופשיים עם התוספת של גורם גדילת אפיתל (EGF) 12, לאחר מכן מיושם מועיל למצב נורמלי וסרטני רקמות שד.

ss = "jove_content"> הזהות של תא מייסד יוצרי תחום, וסוגי התאים המעורבים המרכיבים את מסת הכדור, רלוונטיים למסקנות שיכולות להיות עשויה מmammo-, או-תחום אחר להרכיב מבחני. תאים לטווח ארוך עצם שקט בתום גזע, חשבו לנוח בשלב G0, לא תוכל לחוות את השילוב המדויק של גורמים שהיה מעדיפים הפעלה in vivo. Assay mammosphere במקום מאפשר את הצמיחה של תאים או בכוננות חלוקת mitotic או שכבר חילקו 13. אבות אלו, אם כי לא תא באמת שקט, עשויים להיות שלב התא שמתרבה עם mitogens EGF וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) המשמשת בassay. אף על פי כן, הם מכילים מגוון של האיתות הקשורים בתאי גזע מופעל מסלולים מ-14. בנוסף, קצב היווצרותם מתייחס לtumorigenicity של הרקמות שנלקחו מ, כשהיא נמדדת בעצמה שלהם במבחני דילול מוגבלים בxenografts עכבר 2,15,16 </ Sup>.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבודד תאים בודדים וליצור mammospheres עיקרי משני קווים אנושיים סרטן שד תא ודגימות קליניות של גידולים בשד. אנו גם מתארים כיצד לבצע קטעים סידוריים של mammospheres העיקרי להעריך התחדשות עצמית, וכיצד לחשב תחום יצירת יעילות המאפשרת השוואה בין צפיפות זריעה שונה (ראה תכנית באיור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההנחיות המפורטות להלן אושרו על ידי אתית אימפריאל קולג ', לונדון.

1. דור של Mammospheres הראשוני משורות תאי סרטן שד האנושי

הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית.

  1. הכן Mammosphere מדיה המכילה DMEM / F12 בתוספת L- גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / ml פניצילין, 100 U / סטרפטומיצין מיליליטר. הכן תקשורת מלאה מייד לפני השימוש על ידי הוספת 20 גורם ng / ml רקומביננטי צמיחת אפידרמיס האנושי (EGF; Sigma), 10 ng / ml גורם רקומביננטי אדם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF; מערכות R & D) ותוספת 1x B27.
  2. תקשורת לשאוב מבקבוק המכיל MCF-7 או מד"א MB-231 תאים חסיד (או שורת תאי סרטן השד על פי בחירתך; 70-80 מפגש%), לשטוף פעמיים ב1x PBS, וtrypsinize תאים.
  3. תאי צנטריפוגה XG 200 בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תאי supernatant ו resuspend למזוג ב1-5 מיליליטר של תקשורת mammosphere. פיפטהלמעלה ולמטה ואם יש צורך להשתמש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג השעיה תא בודד. השתמש hemocytometer כדי להבטיח השעיה תא בודדת יצרה (אם לא, השתמש מחט 25 G למזרק ההשעיה התא עד 3 פעמים).
  4. אם CD44 בודד הצורך + CD24- משנה סלולארי באמצעות FACS באמצעות אנטי CD24-Phycoerythrin (PE) ואנטי-CD44-והעמסת isothiocyanate (FITC) נוגדנים חד-שבטיים 9. לחלופין, לבודד אוכלוסייה כגון באמצעות תא-מגנטי הופעל מיון מערכת (MACS) עם אנטי CD44 וmicrobeads המשולב אנטי CD24 ביוטין לפי הוראות יצרן. לבצע סלקציה חיובית באמצעות LS עמודות, וסלקציה שלילית באמצעות עמודות LD ולאשר את פנוטיפים של כל התאים המבודדים על ידי cytometry זרימה 17.
  5. לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר באמצעות trypan כחול.
    הערה: כדאיות תא מחושבת כמספר תאי קיימא מחולקים במספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על hemocytometer. תאים שתופסים trypan כחול נחשבים לא-קיימא. ההליך הבא משמש כדי לקבוע שיעור של תאי קיימא בצורה מדויקת.
    1. הכן פתרון 0.4% מtrypan הכחול בPBS. להוסיף 0.1 מיליליטר של פתרון מניות trypan הכחול עד 1 מיליליטר של תאים. לטעון hemocytometer ולבחון באופן מיידי תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. לספור את מספר התאים כולל ומספר תאי כתמי כחולים.
      תאי קיימא = [1.00 - (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים כולל)] × 100.
    2. כדי לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר של תרבות, השתמש בנוסחא הבאה. זכור לתקן את הגורם לדילול.
      מספר תאי קיימא × 10 × 4 = 1.1 תאים / מיליליטר התרבות
  6. Resuspend סכום שנקבע מראש של תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת mammosphere מלאה בכל טוב של צלחת חסיד 6-גם נמוכה במיוחד. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים / 2 סנטימטר תא בכל טוב. lo שימוש אופציונלי24 גם צלחות מצורפים w תוך זריעת תאים באותו הצפיפות ב 0.5 מיליליטר של תקשורת.
    הערה: אנו ממליצים אופטימיזציה של צפיפות זריעה ושעה של תרבות לכל שורות תאים של עניין.
  7. דגירה 6-גם צלחות נמוך במיוחד קובץ מצורף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5-10 ימים (בהתאם לקו התא ואת גודל mammospheres) מבלי להפריע לצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים .

2. דור של Mammospheres הראשוני מדוגמאות קליניות לסרטן השד האנושי

ניתן להשיג רקמת סרטן השד אנושית מחולים שעברו ניתוח להסרת גידולים בשד: הערה. רקמת חנות על קרח למשך עד 24 שעות בצינורות סטרילי 50 מיליליטר בתקשורת ובתרבות המכילות 100 U / ml פניצילין ו -100 U / ml סטרפטומיצין. בצע את השלבים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית הבאים.

  1. להעביר את המדגם לתוך צלחת פטרי רקמות 100 מ"מ עם נפח קטן של תקשורת. Removדואר רקמת שומן באמצעות מספריים, scapel ופינצטה סטרילית.
  2. להוסיף 2-3 מיליליטר של DMEM / F12 וברר את המדגם לתוך 1 מ"מ 3 חתיכות עם scapel סטרילי או סכין גילוח עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
  3. Resuspend חתיכות רקמה במראש חימם DMEM 10 מיליליטר המכיל אנזימי מפרקי חלבונים (3000 U / collagenase מיליליטר ו -1000 U / hyaluronidase מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס שייקר סיבובי עד שכל שברי הרקמה מתעכלים. בדרך כלל עיכול שלם לוקח בין 1-3 שעות. התאם את זמן עיכול על פי תווים פתולוגית של גידולים. (לדוגמא אדנוקרצינומה השד היא בדרך כלל קשה יותר לעיכול בהשוואה לקרצינומה רִירָנִי שהוא שביר יותר וזקוק לזמן עיכול קצר יותר). להעריך את מידת העיכול בכל שעה וחצי על ידי התבוננות 20 השעיה μl תחת hemocytometer.
  4. לאפשר לברים למשקעים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant בצינור חרוטי 15 מיליליטר פוליפרופילן צנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות ב TEM החדרperature. למזוג בזהירות את תאי supernatant ו resuspend ב 1 - 5 מיליליטר של תקשורת mammosphere.
  5. בצע את השלבים שתוארו לעיל 1.1-1.4 לשורות תאים להשיג וצלחת השעיות תא בודדות. עובר תאים דרך 25 G מזרק מרבי של פי 2 במידת צורך להגביל תאי נזק.

3. Mammosphere יצירת יעיל (%) חישוב

  1. לאחר תקופת התרבות, לספור את mammospheres (יותר מ 40 מיקרומטר) קוטר תחת מיקרוסקופ בהגדלה 40X. תמונה דיגיטלית 5 שדות אקראיים באמצעות מצלמה דיגיטלית במיקרוסקופ אור ולקבוע את גודל mammospheres באמצעות תוכנת הרכישה. השתמש בכל תמונת ניתוח תוכנה.
  2. חישוב יעיל Mammosphere יצירת (% MFE) באמצעות המשוואה הבאה:
    MFE (%) = (# של mammospheres לכל טוב) / (# של תאי זרע בכל טוב) x 100

4. Passaging הסידורי של Mammospheres להערכה של התחדשות עצמית

  1. פיפטה מדיה המכילה mammospheres מכל טוב לתוך צינור 15 מיליליטר. לשטוף את הבארות עם PBS ולהוסיף לתקשורת שנאסף. צנטריפוגה ב 115 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של 0.5% EDTA טריפסין / 0.2% מראש חימם. דגירה במשך 2-3 דקות.
  3. הוסף 500 μl של FCS לנטרל טריפסין. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וגלול גלולים בתקשורת של mammospheres, pipetting עד 100 μl ולמטה כדי disaggregate תחומים.
  4. ספירת תאים עם hemocytometer ולקבוע אם תאים בתרחיף תא בודד. אם לא תעבור דרך 25 G מזרק עד 3 פעמים כדי להשיג תאים בודדים. זרעי התאים לתוך צלחת אולטרה חדשה נמוכה מצורף 6-גם באותו הצפיפות בשימוש בדור העיקרי.
  5. לאחר 5-10 ימים, לספור תחומים> 40 מיקרומטר ולחשב את יעילות יוצרי תחום שימוש בנוסחא דווחה בעבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מדגמים שונים או אלה נתון לטיפולים שונים עשויים להשתנות במספר mammospheres> 40 מיקרומטר היוצרים לאחר נרמול לתאים ראשוניים שנזרעו. לחשב את יעילות mammosphere להרכיב (MFE) עבור כל טיפול גדל בשלושה עותקים. זה מאפשר ניסויים עם צפיפות זריעה שונה להשוואה. הנתונים מוצגים הטוב ביותר בגרף עמודות, באופן אידיאלי עם בקרות חיוביות ושליליות, ובו מוצגות סטיית התקן פני הבארות בשלושה עותקים. באופן עקבי להעביר תאים חסיד לתוך צלחות שאינן חסיד במפגש בין 60-80%. ספירת תאים זהירה היא חיונית לכימות במ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הערכה מוצלחת של mammospheres הראשוני והמשני מסתמכת על תאים שמצופים בצפיפויות נמוכות מספיק שmammospheres צורה משיבוטים אחד, עם צבירת תחום מינימאלית. עם זאת בצפיפויות נמוכות מדי, מעט מדי mammospheres עלול להיווצר להבחין את ההשפעות של טיפולים סטטיסטיים. צפיפות זריעה צריכה להיות מותאמת לשורת תאים כל שימוש שכן הם יכולים להשתנות במידה ניכרת ביעילות תחום יצירתם (אלה מבטאים E-cadherin הנמוך עלולים להיווצר תרבויות mammosphere טווח פחות יציבים וקצרות 18). שלב אופטימיזציה זו צריך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים שיכול להיתפס כפוגע בחוסר משוא הפנים של מאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקיסרי BRC, המכון הלאומי לחקר בריאות, והפעולה נגד הסרטן עם אזכור מיוחד להילארי קרפט וסר דאגלס מאיירס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM/F12LonzaCC-3151
2 מ"מ L-גלוטמיןSigma AldrichG8540
100 U/ml פניצילין & סטרפטומיציןסיגמא אולדריץ'P4083
20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF)סיגמא אולדריץ'E9644
20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF)R& D systems233-FB-025
1x תוסף B27Invitrogen17504-044
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Thermo Scientific12399902
0.5% טריפסין/0.2% EDTAסיגמא אולדריץ'59418C
סרום עגל עובריFirst Link בריטניה02-00-850
טריפן כחולסיגמא אולדריץ'93595
צלחות 6 בארות חיבור נמוכותקורנינגCLS3814
קולגנאז סוג 1Aסיגמא אולדריץ'C9891
HyaluronidaseSigma AldrichH3506
סכיני גילוח סטרילייםפישר סיינטיפיק12443170
אזמל סטריליפישר סיינטיפיק11758353
מיקרו-דיסקציה סטרילית מספרייםSigma AldrichS3146

מקורות

  1. Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
  2. Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
  4. Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
  5. Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
  6. Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  7. Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
  8. Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
  9. Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).
  10. Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  11. Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  14. Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
  15. Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
  16. Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
  17. Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209(2011).
  18. Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281(2013).
  19. Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
  20. Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
  21. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  22. Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
  23. Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע של סרטן השדבחירת CD44 CD24תרחיף תאים בודדיםיעילות יצירת ספירותפלטות בעלות הידבקות נמוכהמיון תאים מופעל פלואורסצנציהפרוטוקול עיכול רקמותניתוח מעברים סדרתייםספירת תאים חיוניים
Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.