הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

29.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52727

⸱

20 במאי 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Baker Institute for Animal Health, Cornell University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתעדים את השימוש בבדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים פפטידילרגינין דימינאז (PADI), BB-Cl-amidine, על גידול סרטן השד במבחנה.

תקציר

בהתחשב בקשיים האינהרנטיים בחקירת המנגנונים של התקדמות הגידול in vivo, בדיקות מבוססות תאים כגון בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה (להלן בדיקת אגר רכה), המודדת את יכולתם של תאים להתרבות במטריצות מוצקות למחצה, נותרו סימן ההיכר של חקר הסרטן. יתרון מרכזי של טכניקה זו על פני מבחני תרבית תאים דו-שכבתיים או תלת-ממדיים קונבנציונליים הוא החיקוי הקרוב של הסביבה התאית התלת-ממדית לזו הנראית in vivo. חשוב לציין, בדיקת האגר הרך מספקת גם כלי אידיאלי לבדיקה קפדנית של ההשפעות של תרכובות חדשות או תנאי טיפול על התפשטות תאים ונדידתם. בנוסף, בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית של פוטנציאל הטרנספורמציה של התאים בהקשר של הפרעות גנטיות. לאחרונה זיהינו את פפטידילרגינין דימינאז 2 (PADI2) כסמן ביולוגי פוטנציאלי לסרטן השד ומטרה טיפולית. כאן אנו מדגישים את התועלת של בדיקת האגר הרך למחקרים אנטי-סרטניים פרה-קליניים על ידי בדיקת ההשפעות של מעכב PADI, BB-Cl-amidine (BB-CLA), על הגידול של תאים ממוקדים (MCF10DCIS).

מבוא

גם תאים לא מותמרים (נורמליים) וגם תאים שעברו טרנספורמציה יכולים להתרבות בקלות בתרבית חד-שכבתית דו-ממדית. צורה זו של גידול תאים דבקים שונה למדי מזו המתרחשת in vivo שבה, בהיעדר גירוי מיטוגני, תאים אינם מתחלקים לעתים קרובות במהירות בתוך סביבת המיקרו שלהם. מבחן האגר הרך לעומת זאת שונה ממערכות תרבית דו-ממדיות מכיוון שהוא מכמת את הגידול על ידי מדידת יכולתו של התא להתרבות וליצור מושבות בתרחיף בתוך ג'ל אגרוז מוצקלמחצה 1. בסביבה זו, תאים שלא עברו טרנספורמציה אינם מסוגלים להתפשט במהירות בהיעדר עיגון למטריצה החוץ-תאית (ECM) ועוברים אפופטוזיס, תהליך המכונה אנויקיס. לעומת זאת, תאים שעברו טרנספורמציה ממאירה מאבדים את התלות שלהם בעיגון עקב הפעלת מסלולי איתות כגון פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)/Akt ו-Rac/Cdc42/PAK. לכן, תאים אלה מסוגלים לגדול וליצור מושבות בתוך מטריצת אגר רכה חצי מוצקה2.

שימוש נפוץ בבדיקת אגר רך הוא לבדוק אם תרכובות ספציפיות, כגון מעכבי PADI, מסוגלות לדכא את צמיחת הגידול במבחנה. באופן כללי, ספירת מושבות או גדלי מושבות הם קריאות כמותיות מהבדיקה שניתן להשוות בין קבוצות ביקורת וטיפול כדי להעריך את ההבדלים בגידול תאי. לכן, אם מוצאים כי היווצרות מושבה נמצאת בקורלציה הפוכה עם עלייה בריכוז התרופה, ניתן להסיק כי התרופה היא מעכב יעיל של גידול במבחנה. מצד שני, אם התרופה אינה משפיעה על היווצרות המושבה, התרופה אינה במינון המתאים או שהיא אינה מעכבת גידול יעילה. מלבד שימוש בבדיקת אגר רכה לבדיקת ההשפעה האנטי-גידולית של תרופה, ניתן להשתמש בבדיקה זו גם כדי לחקור את הקשר בין גן ספציפי לגידול. לדוגמה, ניתן לטפל בהשפעה של דיכוי ביטוי PADI2 על גידול על ידי טיפול siRNA ספציפי ל-PADI2.

PADIs הם אנזימים תלויי סידן המשנים חלבונים לאחר תרגום על ידי המרת שאריות ארגינין טעונות חיובית לציטרולין טעון ניטרלי בתהליך המכונה ציטרולינציה או דה-דימינציה3-5. לאחרונה מצאנו כי פפטידילרגינין דימינאז 2 (PADI2) עשוי לתפקד כסמן ביולוגי חדש לסרטן השד וכי מעכבי PADI מייצגים טיפולים מועמדים לסרטן שד בשלב מוקדם6. לדוגמה, הראינו בעבר כי מעכב "פאן-PADI", Cl-אמידין, מדכא את התפשטות תאי סרטן השד באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות וכי המעכב דיכא את הצמיחה של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול6. בדוח זה, אנו מרחיבים את המחקרים הללו, ומדגישים את התועלת של בדיקת האגר הרך, על ידי בדיקת היעילות של מעכב PADI חדש, BB-CLA, בדיכוי הצמיחה של מושבות סרטן השדMCF10DCIS. נציין שהשתמשנו בתאי MCF10DCIS לניסוי זה מכיוון שהם נגזרות אונקוגניות של תאי MCF10A אנושיים שלא עברו טרנספורמציה ומכיוון שהם מכילים רמות גבוהות של חלבון PADI2 במצב יציב8. אנו משערים כי פעילות אנזימטית של PADI2 ממלאת תפקיד מפתח בגידול של קו תאים זה וכי עיכוב פעילות PADI2 בתיווך BB-CLA ידכא את התקדמות הסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה של 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

  1. לתוך בקבוק נקי, יבש 100 מיליליטר זכוכית, להוסיף 0.9 גרם של agarose 2-hydroxyethyl (Agarose VII) ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים.
  2. מיקרוגל את התערובת במשך 15 שניות ועדינות מערבולת. חזור על שלב זה לפחות עוד שלוש פעמים עד שאבקת agarose מתמוססת באופן מלא.
  3. החיטוי הבקבוק המכיל פתרון במשך 15 דקות.
  4. אפשר פתרון agarose להתקרר לRT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון בRT.

2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% Agarose ג'ל

  1. טרום חם 5 מיליליטר ו -10 מיליליטר בטפטפות 37 ° C חממה כמה למנוע agarose לחיזוק בפיפטה בעת טיפול.
  2. חלקית לשחרר את מכסה הבקבוק ומיקרוגל 3% פתרון agarose 2-hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. ואז, בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות. זהירות: היזהרי בעת מתערבלת agaroפתרון se כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר ויכול לגלוש.
  3. אם יש ג'ל השייר המוצק בבקבוק, מיקרוגל לעוד כמה שניות.
  4. שמור את הבקבוק המכיל את פתרון agarose באמבט מים C ° 45 במהלך השלבים הבאים כדי למנוע את פתרון agarose מהגיבוש בטרם עת.
  5. תקשורת MCF10DCIS חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: תקשורת MCF10DCIS מורכבת DMEM / F12, 5% בסרום סוס, 5% סטרפטומיצין פניצילין.
  6. העברה 3 מיליליטר של פתרון agarose 3% באמצעות טפטפות המחוממות מראש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
  7. מייד להוסיף 12 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה ועדינות להפוך את צינור חרוטי לערבב agarose עם התקשורת. נסה לא ליצור בועות כפי שיפריע למושבה ספירה מאוחר יותר.
  8. בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תערובת זו לכל גם צלחת תרבות 6 היטב בלי להרכיב את כל בועות אוויר.
  9. דגירה horizonta צלחת תרבות 6 היטבlly על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
  10. לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה למשך 30 דקות. השכבה התחתונה היא מוכנה לשימוש.

3. הכנת השכבה המכיל הנייד: 0.3% Agarose ג'ל

  1. תאי Trypsinize MCF10DCIS ולדלל אותם לריכוז תא של 4 x 10 4 מיליליטר /.
  2. קח 2 מיליליטר של agarose 3% באמצעות טפטפות מחוממות מראש ולהעביר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
  3. מייד להוסיף 8 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS לצינור חרוטי ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יצירת בועות.
  4. קח 2 מיליליטר של תאי MCF10DCIS (4 x 10 4 / מיליליטר) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
  5. בדילול 1: 1, לערבב את התאים עם agarose 0.6%.
  6. קח 1 מיליליטר של תערובת התא-agarose ועדינות להוסיף על השכבה התחתונה של עמ 'תרבות 6 היטב(2 x 10 4 תאים / מיליליטר) מאוחר.
  7. מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את השכבה העליונה כדי לחזק.
  8. לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.

4. הכנת שכבת המזין: 0.3% Agarose ג'ל

  1. מיקרוגל 3% פתרון agarose 2-Hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. מערבולת בעדינות את הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות.
  2. לאזן את בקבוק פתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
  3. לחמם את תקשורת MCF10DCIS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  4. מערבבים 1 מיליליטר של 3% פתרון agarose עם 9 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יוצר בועות אוויר.
  5. פנק את התערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
  6. בעדינות להוסיף 1 מיליליטר של תערובת זו (בלי למינג בועות) לבאר כל צלחת תרבות 6 היטב המכילה את החלק התחתון ושכבות רכות.
  7. מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
  8. לאחר שכבת המזין מתמצקת, למקם את הצלחת לתוך 37 ° C חממה.
  9. חזור שבועי הליך זה על ידי האכלה כיסה 1 מיליליטר של 0.3% פתרון agarose / בינוניים / טיפול על שכבת המזין הקיימת כדי לחדש את התאים עם תקשורת חדשה עד הקמת מושבה הוא ציין. הערה: אגר בשכבות הרכות ומזין היא רכה מאוד, ולכן, חומרים מזינים הגיעו משכבת ​​המזין יהיו מוכנים לפזר את השכבה המכיל תא כדי להגיע לתאים.

5. איסוף נתונים

  1. לאחר 2.5 שבועות של צמיחת תאים באגרו הרך, לספור את מספר המושבות בכל טוב באמצעות מיקרוסקופ אור. כדי להקל על כימות, להדפיס רשת על שקיפות ולצרף את הרשת ל6-גם צלחת לסיוע באיתור שבו התאים נמצאים בספירה. מאז גודל מושבה (כלכמת ידי הקוטר של כל מושבה) ישתנה, להגדיר מראש גודל מושבה התייחסות כדי לקבוע אילו מושבות יהיה כבש. לדוגמא, כוללים גדלי מושבה של 70 מיקרומטר או גדולים יותר בניתוח הנתונים.
  2. אחסן את הדגימות ב 4 ° C כדי למנוע היווצרות מושבה נוספת ולספירת עתיד. חותם את צלחת תרבות 6 היטב עם Parafilm כדי למנוע את ג'לי מהתייבשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Assay הקמת המושבה אגר הרך יכול לשמש למגוון רחב של יישומים המתעדים את tumorigenicity של תאים סרטניים. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שמטריצת חצי מוצקה סלקטיבי מעדיפה את הצמיחה של תאים שיכולים להתרבות באופן עצמאי מעגן-. תכונה זו היא בעיקר הפגינה תאים סרטניים אך לא בתאים נורמלים. אנחנו בעיקר להשתמש בטכניקה זו כדי לבדוק את היעילות של עיכוב צמיחת גידול על ידי תרופות ולבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר או דלדול של הגנים שלנו של עניין, כוללים גני PADI, בtumorigenicity של תאי סרטן השד. כאן, אנו הער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קצב היווצרות מושבה באגרה רך משתנה בהתאם לסוג התא 9. לכן, מספר התאים להתחיל עם צריך להיות מותאם ובהתאם. מגוון התחלה הציע הוא בין 5 x 02-01 אוקטובר x 10 4 תאים לכל גם באמצעות צלחת 6 היטב. בנוסף, גודל מושבה משתנה בהתאם לקצב הצמיחה של כל תא. לכן, יש צורך בחתך מוגדר מראש לגודל מושבה כדי להוסיף הערות מושבות בודדות עבור ניתוחים כמותיים במורד הזרם. כאן, מושבות גדולות יותר מ -70 מיקרומטר היו לכמת כדי למנוע הכללה של תאים מתרבים שאינם נגזרים מהציפוי הראשוני. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה לד"ר ריצ'רד סריון, ד"ר מארק אנטוניאק וקלי סאליבן מאוניברסיטת קורנל, על מתן ייעוץ טכני, ולד"ר ג'רלינד ואן דה וול, אוניברסיטת קורנל, על שיתוף המיקרוסקופ ההפוך Olympus CKX41 שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Zeiss AxiopotCarl Zeiss מיקרוסקופיה1021859251
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסCKX41
DMEM/F-12Lonza BioWhittaker12-719F
HyClone Donor Horsene SerumFisher ScientificSH30074.03
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140-122
2-הידרוקסיאתילאגרוז: סוג VII, טמפרטורת ג'ל נמוכהסיגמא-אולדריץ'39346-81-1

מקורות

  1. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
  2. Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
  3. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
  4. Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
  5. Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343(2012).
  6. McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500(2012).
  7. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
  8. Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
  9. Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
  10. Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
  11. Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PADI2BB Cl amidineMCF10DCIS
ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.