ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

גם תאים לא מותמרים (נורמליים) וגם תאים שעברו טרנספורמציה יכולים להתרבות בקלות בתרבית חד-שכבתית דו-ממדית. צורה זו של גידול תאים דבקים שונה למדי מזו המתרחשת in vivo שבה, בהיעדר גירוי מיטוגני, תאים אינם מתחלקים לעתים קרובות במהירות בתוך סביבת המיקרו שלהם. מבחן האגר הרך לעומת זאת שונה ממערכות תרבית דו-ממדיות מכיוון שהוא מכמת את הגידול על ידי מדידת יכולתו של התא להתרבות וליצור מושבות בתרחיף בתוך ג'ל אגרוז מוצק^{למחצה 1}. בסביבה זו, תאים שלא עברו טרנספורמציה אינם מסוגלים להתפשט במהירות בהיעדר עיגון למטריצה החוץ-תאית (ECM) ועוברים אפופטוזיס, תהליך המכונה אנויקיס. לעומת זאת, תאים שעברו טרנספורמציה ממאירה מאבדים את התלות שלהם בעיגון עקב הפעלת מסלולי איתות כגון פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)/Akt ו-Rac/Cdc42/PAK. לכן, תאים אלה מסוגלים לגדול וליצור מושבות בתוך מטריצת אגר רכה חצי מוצקה².

שימוש נפוץ בבדיקת אגר רך הוא לבדוק אם תרכובות ספציפיות, כגון מעכבי PADI, מסוגלות לדכא את צמיחת הגידול במבחנה. באופן כללי, ספירת מושבות או גדלי מושבות הם קריאות כמותיות מהבדיקה שניתן להשוות בין קבוצות ביקורת וטיפול כדי להעריך את ההבדלים בגידול תאי. לכן, אם מוצאים כי היווצרות מושבה נמצאת בקורלציה הפוכה עם עלייה בריכוז התרופה, ניתן להסיק כי התרופה היא מעכב יעיל של גידול במבחנה. מצד שני, אם התרופה אינה משפיעה על היווצרות המושבה, התרופה אינה במינון המתאים או שהיא אינה מעכבת גידול יעילה. מלבד שימוש בבדיקת אגר רכה לבדיקת ההשפעה האנטי-גידולית של תרופה, ניתן להשתמש בבדיקה זו גם כדי לחקור את הקשר בין גן ספציפי לגידול. לדוגמה, ניתן לטפל בהשפעה של דיכוי ביטוי PADI2 על גידול על ידי טיפול siRNA ספציפי ל-PADI2.

PADIs הם אנזימים תלויי סידן המשנים חלבונים לאחר תרגום על ידי המרת שאריות ארגינין טעונות חיובית לציטרולין טעון ניטרלי בתהליך המכונה ציטרולינציה או דה-דימינציה^3-5. לאחרונה מצאנו כי פפטידילרגינין דימינאז 2 (PADI2) עשוי לתפקד כסמן ביולוגי חדש לסרטן השד וכי מעכבי PADI מייצגים טיפולים מועמדים לסרטן שד בשלב מוקדם⁶. לדוגמה, הראינו בעבר כי מעכב "פאן-PADI", Cl-אמידין, מדכא את התפשטות תאי סרטן השד באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות וכי המעכב דיכא את הצמיחה של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול⁶. בדוח זה, אנו מרחיבים את המחקרים הללו, ומדגישים את התועלת של בדיקת האגר הרך, על ידי בדיקת היעילות של מעכב PADI חדש, BB-CLA, בדיכוי הצמיחה של מושבות סרטן השד^MCF10DCIS. נציין שהשתמשנו בתאי MCF10DCIS לניסוי זה מכיוון שהם נגזרות אונקוגניות של תאי MCF10A אנושיים שלא עברו טרנספורמציה ומכיוון שהם מכילים רמות גבוהות של חלבון PADI2 במצב יציב⁸. אנו משערים כי פעילות אנזימטית של PADI2 ממלאת תפקיד מפתח בגידול של קו תאים זה וכי עיכוב פעילות PADI2 בתיווך BB-CLA ידכא את התקדמות הסרטן.

1. הכנה של 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

1. לתוך בקבוק נקי, יבש 100 מיליליטר זכוכית, להוסיף 0.9 גרם של agarose 2-hydroxyethyl (Agarose VII) ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים.
2. מיקרוגל את התערובת במשך 15 שניות ועדינות מערבולת. חזור על שלב זה לפחות עוד שלוש פעמים עד שאבקת agarose מתמוססת באופן מלא.
3. החיטוי הבקבוק המכיל פתרון במשך 15 דקות.
4. אפשר פתרון agarose להתקרר לRT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון בRT.

2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% Agarose ג'ל

1. טרום חם 5 מיליליטר ו -10 מיליליטר בטפטפות 37 ° C חממה כמה למנוע agarose לחיזוק בפיפטה בעת טיפול.
2. חלקית לשחרר את מכסה הבקבוק ומיקרוגל 3% פתרון agarose 2-hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. ואז, בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות. זהירות: היזהרי בעת מתערבלת agaroפתרון se כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר ויכול לגלוש.
3. אם יש ג'ל השייר המוצק בבקבוק, מיקרוגל לעוד כמה שניות.
4. שמור את הבקבוק המכיל את פתרון agarose באמבט מים C ° 45 במהלך השלבים הבאים כדי למנוע את פתרון agarose מהגיבוש בטרם עת.
5. תקשורת MCF10DCIS חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: תקשורת MCF10DCIS מורכבת DMEM / F12, 5% בסרום סוס, 5% סטרפטומיצין פניצילין.
6. העברה 3 מיליליטר של פתרון agarose 3% באמצעות טפטפות המחוממות מראש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
7. מייד להוסיף 12 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה ועדינות להפוך את צינור חרוטי לערבב agarose עם התקשורת. נסה לא ליצור בועות כפי שיפריע למושבה ספירה מאוחר יותר.
8. בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תערובת זו לכל גם צלחת תרבות 6 היטב בלי להרכיב את כל בועות אוויר.
9. דגירה horizonta צלחת תרבות 6 היטבlly על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
10. לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה למשך 30 דקות. השכבה התחתונה היא מוכנה לשימוש.

3. הכנת השכבה המכיל הנייד: 0.3% Agarose ג'ל

1. תאי Trypsinize MCF10DCIS ולדלל אותם לריכוז תא של 4 x 10 ⁴ מיליליטר /.
2. קח 2 מיליליטר של agarose 3% באמצעות טפטפות מחוממות מראש ולהעביר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
3. מייד להוסיף 8 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS לצינור חרוטי ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יצירת בועות.
4. קח 2 מיליליטר של תאי MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / מיליליטר) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
5. בדילול 1: 1, לערבב את התאים עם agarose 0.6%.
6. קח 1 מיליליטר של תערובת התא-agarose ועדינות להוסיף על השכבה התחתונה של עמ 'תרבות 6 היטב(2 x 10 ⁴ תאים / מיליליטר) מאוחר.
7. מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את השכבה העליונה כדי לחזק.
8. לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.

4. הכנת שכבת המזין: 0.3% Agarose ג'ל

1. מיקרוגל 3% פתרון agarose 2-Hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. מערבולת בעדינות את הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות.
2. לאזן את בקבוק פתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
3. לחמם את תקשורת MCF10DCIS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
4. מערבבים 1 מיליליטר של 3% פתרון agarose עם 9 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יוצר בועות אוויר.
5. פנק את התערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
6. בעדינות להוסיף 1 מיליליטר של תערובת זו (בלי למינג בועות) לבאר כל צלחת תרבות 6 היטב המכילה את החלק התחתון ושכבות רכות.
7. מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
8. לאחר שכבת המזין מתמצקת, למקם את הצלחת לתוך 37 ° C חממה.
9. חזור שבועי הליך זה על ידי האכלה כיסה 1 מיליליטר של 0.3% פתרון agarose / בינוניים / טיפול על שכבת המזין הקיימת כדי לחדש את התאים עם תקשורת חדשה עד הקמת מושבה הוא ציין. הערה: אגר בשכבות הרכות ומזין היא רכה מאוד, ולכן, חומרים מזינים הגיעו משכבת ​​המזין יהיו מוכנים לפזר את השכבה המכיל תא כדי להגיע לתאים.

5. איסוף נתונים

1. לאחר 2.5 שבועות של צמיחת תאים באגרו הרך, לספור את מספר המושבות בכל טוב באמצעות מיקרוסקופ אור. כדי להקל על כימות, להדפיס רשת על שקיפות ולצרף את הרשת ל6-גם צלחת לסיוע באיתור שבו התאים נמצאים בספירה. מאז גודל מושבה (כלכמת ידי הקוטר של כל מושבה) ישתנה, להגדיר מראש גודל מושבה התייחסות כדי לקבוע אילו מושבות יהיה כבש. לדוגמא, כוללים גדלי מושבה של 70 מיקרומטר או גדולים יותר בניתוח הנתונים.
2. אחסן את הדגימות ב 4 ° C כדי למנוע היווצרות מושבה נוספת ולספירת עתיד. חותם את צלחת תרבות 6 היטב עם Parafilm כדי למנוע את ג'לי מהתייבשות.

Assay הקמת המושבה אגר הרך יכול לשמש למגוון רחב של יישומים המתעדים את tumorigenicity של תאים סרטניים. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שמטריצת חצי מוצקה סלקטיבי מעדיפה את הצמיחה של תאים שיכולים להתרבות באופן עצמאי מעגן-. תכונה זו היא בעיקר הפגינה תאים סרטניים אך לא בתאים נורמלים. אנחנו בעיקר להשתמש בטכניקה זו כדי לבדוק את היעילות של עיכוב צמיחת גידול על ידי תרופות ולבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר או דלדול של הגנים שלנו של עניין, כוללים גני PADI, בtumorigenicity של תאי סרטן השד. כאן, אנו הערכנו את ההשפעה של BB-CLA על עיכוב סרטני של תאי MCF10DCIS ביתר-PADI2 (איור 1 ו -2).

התוצאות מראות שBB-CLA מעכב את ההיווצרות של מושבות תאים שמקורם MCF10DCIS באופן משמעותי. איור 3 מראה כי, בנוכחות מעכב PADI t, כאן הייתה ירידה בשני גודל הקמת המושבה ומושבה בהשוואה לשליטת DMSO. [הערה:. BB-CLA פורקה ב DMSO ובכך, DMSO שימש כביקורת] הגודל של מושבות לBB-CLA טופל תאי MCF10DCIS היו בעיקר בטווח של 20 עד 100 מיקרומטר בעוד הגודל של מושבות לDMSO שליטה הציגה מגוון רחב יותר של 70 מיקרומטר עד 150 לאחר 2.5 שבועות של צמיחה.

מושבות גדולות יותר מ -70 מיקרומטר נספרו וניתחו (איור 4). היה ממוצע של 3536 מושבות בשליטת DMSO ואילו רק 1,967 מושבות ראו בקבוצה שטופלה BB-CLA לאחר 2.5 שבועות של תרבות אגר רכה. זה מייצג ירידה של 44% בהקמת המושבה הממוצעת בנוכחות 1 מיקרומטר BB-CLA, המצביע על עיכוב משמעותי סרטני של תאי סרטן השד (תאי MCF10DCIS) על ידי מעכב PADI.

טען / 52,727 / 52727fig1.jpg "/>
איור 1. מבנה הכימי של BB-CLA.

איור 2. סכמטי סקירה כללית של הפרוטוקול עבור assay כינונה רך אגר מושבה. גם כל תרבות צלחות 6-גם הייתה מצופה ראשון עם 0.6% agarose ג'ל (שכבה תחתונה). תערובת agarose ג'ל 0.3% המכילה את תאי MCF10DCIS וגם מעכב BB-CLA (1 מיקרומטר) או DMSO (שליטה) הייתה אז שכבות על גבי ג'ל 0.6%. פעם בשבוע, 0.3% תערובת agarose ג'ל (המכיל BB-CLA) נוספה על גבי השכבה הרכה. לאחר 2 עד 4 שבועות, הקמת מושבה נצפתה ונספרה לניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. תמונות איור של הקמת מושבה בתאי MCF10DCIS טופל BB-CLA. תאי MCF10DCIS גדלו באגרו רך בנוכחות (1 מיקרומטר BB-CLA) או העדר BB-CLA (0 מיקרומטר DMSO). לאחר 2.5 שבועות, מושבות היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה לתמונות בהגדלה נמוכות ומיקרוסקופ אור לתמונות בהגדלה גבוהה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. כימות MCF10DCIS מושבה מספר התאים לאחר BB-CLA הטיפול. MCF10DCIS גדלו באגרו רך בריכוזים שונים של BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO), או 1 מיקרומטר BB-CLA). לאחר 2.5 שבועות, ה גדולה מושבות בודדות70 מיקרומטר נספר. ניסויים חוזרים ונשנים 4 פעמים (n = 4). המובהקות הסטטיסטיות של הבדל ספירת תאים הכולל בין דגימות בקרה וטיפול נקבעו על ידי מבחן t שני מדגם (* p <0.005).

למחברים אין מה לחשוף.