מאמר שיטה

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

DOI:

10.3791/52741

⸱

13 ביוני 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Montreal Neurological Institute and Hospital, McGill University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים בדיקת גיאוטקסיס שלילית אופטימלית, זולה ואמינה ב-Drosophila melanogaster כמודל להפרעות ניווניות. בהיותה רגישה יותר לפגמים תנועתיים קלים, בדיקה זו תעזור לסנן אינטראקציות גנטיות פוטנציאליות ומטרות תרופתיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגמי קטר הנובעים מהפרעות ניווניות יכולים להיות סימפטום מאוחר של מחלה, לאחר שנים של ניוון תת-קליני, ואסטרטגיות טיפול טיפוליות וכך הנוכחיות אינן מרפאים. באמצעות השימוש ברצף exome כל, מספר גדל והולך של גנים זוהה לשחק תפקיד בתנועה אנושית. למרות זיהוי גנים אלה, זה לא ידוע כמה גנים אלה הם חיוניים לתפקוד נורמלי קטר. לכן, assay אמין, אשר מנצל אורגניזמים מודל על מנת להבהיר את תפקידם של גנים אלה כדי לזהות מטרות רומן של עניין טיפולי, יש צורך יותר מתמיד. יש לנו תוכנן גרסה רגיש של assay geotaxis השלילית המאפשר לגילוי פגמים קלים יותר מוקדם ויש לו היכולת להעריך ליקויים אלה לאורך זמן. Assay מבוצע בכוס סיים גליל, אשר חתום עם סרט מכשול שעווה. על ידי הגדלת מרחק הסף להיות טיפס ל -17.5 גמ 'ולהגדיל את משך הניסוי 2 דקות שראינו רגישות רבה יותר באיתור בעיות בתפקוד ניידות קלה. Assay הוא עלות אפקטיבי ואינו דורש הכשרה מקיפה כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור. זה עושה את זה טכניקה מעולה לסינון תרופות מועמד במוטציות תסיסנית עם מומי תנועה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות ניווניות הרסניות כגון מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, וparaplegia ספסטי התורשתי מוכרות יותר ויותר. למרבה הצער, רוב ההפרעות ניווניות אלה עדיין ללא טיפולים. השימוש הקליני הנרחב ב, בדיקות גנטיות משוחדת הגנום כגון רצף exome כל הוביל למספר גדל והולך של גנים שמעורבים בהפרעות קטר אנושיות. למרות התקדמות זו, ההתקדמות פתולוגיים ממוקדם לשלבים מאוחרים, נותרת חמקמקה בהפרעות אלה. תסיסנית מספקת אחד עם הכלים הגנטיים ללימוד דרישת גן באופן מרחב ובזמן בשליטה. בנוסף, תסיסנית הוכיחה שימושית בסינון תרופות לתנאי נוירולוגיות כמו פרקינסון 1, אלצהיימר 2, נכות אינטלקטואליות 3,4 ואפילפסיה 5,6 בין יתר. המטרה שלנו הייתה לפתח חסכוניוassay אמין שיאפשר ניתוח תפוקה גבוה שעדיין יהיה רגיש מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בביצועי מנוע.

ישנם מספר מבחני המשמשים לכמת את ההשפעות של מוטציה גנטית ו / או תנאי סביבה על תסיסנית טיפוס התנהגות. רוב מבחני לנצל את הנטייה הטבעית של זבובים לטפס, הידוע בשם geotaxis השלילית, או assay הטיפוס. 7 Benzer הציע בשנת 1967 כי המנגנון נגד זרם המשמש למחקר של Phototaxis יכול לשמש גם כדי ללמוד gravitaxis. מאז, Ganetsky 8 ועוד רבים אחרים 9 -12 שנבנו על assay הראשוני. העיקרון הוא למקם מספר ידוע של זבובים בבקבוקון ולהקיש על הבקבוקון בחריפות נגד משטח קשה, גורם לזבובים ליפול לתחתית של הבקבוקון. כפי שהוא התנהגות מולדת, הזבובים ינסו לטפס לחלק העליון של הבקבוקון, בניגוד לכוח המשיכה. assay זה הוא כמותי וmeasuמיל כמה זבובים טיפס עבר סמן על הבקבוקון במהלך תקופת זמן מוקצב. מדידה של מהירות במקום מספר הכולל של טיפוס זבובים הפכה פרמטר אמין ולראות פגמים במקרים בהם מספר קריטריוני זבובים לא היה משמעותי 13.

Assay הטיפוס הוכיח שימושי בחקר הפרעות ניווניות רבות, כולל מחלת פרקינסון 14. עם זאת, ציינו כי ליקויי קטר לא יכולים להיות לזיהוי בזמן שבו ניוון של מערכת עצבים נראים כבר במחקרים פתולוגיים 14. לפיכך, שימוש של assay המסורתי עלול להגביל את היכולת ללמוד המוקדמים של היווצרות מחלה בשלבים. המראה של פגמי קטר בשלבים מאוחר יותר של פתולוגיה עשוי לשקף מחלה ההתקדמות שלו הוא מתקדם מדי להצלה שלמה.

זה מעלה בעיה פוטנציאלית עם הרגישות של assay הטיפוס המסורתי. חוסר היכולת הפוטנציאלית של tradiניתן לייחס tional טיפוס assay כדי לזהות פגמי קטר קלים עד הגובה שאליו הזבובים נדרשים לטפס. Assay 15,16 האמצעים המסורתיים מספר הזבובים לטפס בהצלחה מעל לגובה של 2 עד 5 סנטימטר ב 10 עד 20 שניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר על תסיסנית melanogaster היה בעמידה באוניברסיטת הנחיות המחקר של אלברטה.

1. טוס אוסף

  1. לאסוף 20 זבובים באמצעות CO 2 הרדמה (ז) ומקום בבקבוקון אוסף 25 מ"מ x 95 מ"מ המכיל מזון.
  2. בקבוקונים המכילים חנות זבובים אופקית כדי למנוע השמנה זבובים בכל נוזלים שעלולות להצטבר בתחתית הבקבוקון.
  3. דגירה זבובים לפחות 21 שעות על 22 מעלות צלזיוס בלחות של 45% בחממה לכ 15 שעות. הגדר את החממה עם אור שעות 12: מחזור כהה.

Assay 2. טיפוס

  1. למחרת בבוקר, להעביר 20 זבובים מבקבוקון אחד לכוס 250 מיליליטר סיים גליל. לסמן את המיקום של הגליל כדי לשמור אותו קבוע כל יום. השתמש גליל זכוכית אחד לכל גנוטיפ על מנת למנוע זיהום צולב בין גנוטיפים. לשטוף בסוף כל ניסוי וroטייט בין גנוטיפים.
    1. לנהל הניסויים באור הסביבה (או אור אדום אם יש פגם פוטנציאלי בחזון) בטמפרטורה ובלחות של 22 מעלות צלזיוס ו -40% בהתאמה. כדי להימנע מלבלבל קצב היממה, תמיד לבצע ניסויים באותו הזמן של יום.
  2. לאטום את החלק העליון של גליל עם סרט מכשול (סרט שעווה) כדי למנוע את בריחתו של זבובים (איור 2).
  3. הגדר את מצלמת וידאו על חצובה. מצלמה מתמקד בקו 190 מיליליטר של 250 מיליליטר סיימה גליל (17.5 סנטימטרים).
  4. לספור את מספר הזבובים מתים בתחתית של הגליל ובבקבוקוני המזון. רשום את המספר הזה כתמותה.
  5. מאוד קל להקיש על הגליל נגד משטח קצף תא סגור שוב ושוב עם מספיק כוח כדי לעקור את הזבובים למשטח התחתון הפנימי. הקש 5 - 10 פעמים, תוך שימוש ביד השנייה כדי ללחוץ שיא במצלמה.
  6. לחץ על הכפתור "קלט" את המצלמה.
  7. התחל vidאיו הקלטה ומצלמה ברז הגליל שש פעמים בתבנית שאינה קצבית מובהקת.
  8. לנהל כל ניסוי למשך 2 דקות מרגע שזבובי טפח אחרון ולרשום את המספר של זבובים שחצו את הגובה של 17.5 סנטימטר (190 מיליליטר) בכל נקודת זמן שנבחרה (לכמת כל 10 שניות). הערה: מיליליטר סימון על הגליל ישתנה ממודל צילינדר אחד למשנהו בהתאם לקוטר. כדי להימנע משגיאה, למדוד את הגובה על כל גליל בשימוש.
  9. ברגע שהמשפט הסתיים, להיפטר מהזבובים באתנול 95%.
  10. חזור על שלבים 2.1-2.9 עד שכל משכפל נבדקו עם זבובים טריים בכל פעם.
    הערה: למרות 5 משכפל עשוי להיות מספיק עם מוטציה שיש השפעה חזקה על תנועה, 10 חזרות ביולוגיות של 20 זבובים (200 זבובים) מומלץ לזהות הבדלים קטנים יותר.
  11. עם השלמת הניסוי, לשטוף את הגלילים במדיח הכלים במעבדה וO היבש / N לשימוש חוזר.

3. ניתוח

  1. Analyקטעי וידאו של כל ze לטוס משפט. כל 10 שניות, לרשום את המספר הכולל של זבובים שעוברים את קו היעד.
    1. אם זבוב מטפס בחזרה למטה או נופל שיא שעפים כ-1 ו, לספור את הזבוב הבא לחצות את קו היעד אותו המספר כמו הזבוב שטיפס בחזרה למטה או נפל. לדוגמא, אם זבוב ה -15 נופל מתחת לקו המטרה, הזבוב הבא לחצות את הקו (ה -16 לטוס) נחשב זבוב ה -15 ולא ה -16.
  2. להפחית את התמותה מהמספר הכולל של זבובים (20) כדי להשיג את מספר הזבובים שנותרו במשפט. בכל נקודת זמן, לקבל את החלק היחסי של זבובים מעל קו היעד.
  3. עלילה כל אחוז בכל נקודת זמן (ראה איור 3).
  4. לנתח את הביצועים בנקודת נתונים 120 שניות ולבצע מבחן t תלמיד כאשר 2 קבוצות נמצאות או ANOVA ופוסט-מבחן להשוואות מרובות (עם שינוי Bonferroni למתוכנן וTukey לשיתוף בלתי מתוכנןmparisons). קולמוגורוב-סמירנוב בדיקות 17 גם מתבצע על מנת לוודא תקינות ושונות שווה אלא גם להשוות את ההפצות של קבוצת המוטציה לשליטה.
  5. על מנת להציג את הנתונים על הזדקנות, עלילה אחוז של זבובים לטפס ב 120 שניות עם זבובים בגילים שונים (2 ימים, שבוע 1, 2 שבועות) כדי לראות אם יש גירעון מתקדם (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפוס הוא התנהגות חזקה ושחזור. ואכן, זבובים בר-סוג ישנים יום אחד להגיע לביצועי מרחק יעד הטיפוס במהירות (25 - 30 שניות). זבובים מוטנטים להציג מגוון של ביצועים בין מתון (או מאוחר) כדי להשלים חוסר יכולת לטפס ליעד. אנו להמחיש זאת כאן עם שני אללים מוטציה שונים. הראשון הוא אלל חמור של spastin הגן שנגרם על ידי מחיקה של גן spastin (ספא 5.75) 18 מלאה. בקו הזה (ספא 5.75 עם TM6b) יום אחד זבובים ישנים לא להגיע לביצועי טיפוס WT גם לאחר 2 דקות. קו מוטציה זה מציג עם מומים ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסיסנית כבר הוכיחה להיות מודל מצוין ב1,2 המחלה 14 ותנאים ניווניות אחרים של פרקינסון. בנוסף לכלים הגנטיים הזמינים בדרוזופילה, הגנום שלו הוא שמור ביותר לגנים מעורבים בהפרעות נוירולוגיות 19. כניסתו של שיטות הגנום רחבות סינון גנטי (כוללים רצף exome שלם) עשויה להמשיך ולספק רשימה גדולה יותר של גנים הקשורים להפרעות מועמד תנועה אנושיות. פיתוח טיפולים לתנאים אלה יחייב מודלים של בעלי חיים כדי להגדיל את ההבנה של פתולוגיה מעורבת בשלבים המוקדמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענק צוות של המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR) לד"ר בולדוק (CO-PI) ולד"ר גיא רולו (PI). אנו רוצים להודות לד"ר אוקסנה סוכוברסקי, לד"ר קתרין טוד, לחברי מועדון הזבובים של אוניברסיטת אלברטה ולד"ר קלייטון דיקסון על העזרה בפיתוח השיטה והניתוח הסטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דרוזופילההמניות נבחרות בהתאם לניסויים. הטמפרטורה והלחות בחדר ובחממה חייבות להיות מבוקרות ועקביות כדי למנוע מהזבובים להיות סטטיים מדי או רטובים מדי.
מצלמתכל מצלמת וידיאו דיגיטלית תתאים. ודא שהם יכולים להתמקד באובייקט קרוב.
צילינדר בוגרKimble20028Wדגמים שונים של צילינדר מדורג עשויים להיות בעלי קוטר שונה. לכן חובה למדוד את הגובה.
מחשבכל דגם יעשה. השתמשנו במחשב כדי לעקוב אחר הטיפוס של הזבובים ולרשום את מספר הזבובים בכל נקודת זמן.
מניות וידאו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
  3. Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
  4. McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
  5. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
  6. Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
  7. Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
  8. Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  10. Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
  11. Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
  12. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  13. Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
  14. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  15. Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799(2011).
  16. Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
  17. Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
  18. Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429(2004).
  19. Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
  20. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Climbing AssayDrosophila ModelNeurodegenerative DisordersNegative GeotaxisVideo AnalysisGlass Graduated CylinderWax Barrier FilmFly MortalityTime Point RecordingCandidate Drug Screening

מאמרים קשורים