כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעירוי מוח סטריאוטקסי ישיר של עמילואיד-בטא. מתודולוגיה זו מספקת מודל עכבר in vivo חלופי לטיפול בהשפעות קצרות הטווח של עמילואיד-בטא על נוירונים במוח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלת אלצהיימר היא מחלה ניוונית של מערכת עצבים המשפיעה על הזדקנות האוכלוסייה. תכונת נוירו מפתח של המחלה היא ייצור היתר של עמילואיד-ביתא והתצהיר של לוחות עמילואיד-ביתא באזורים במוח של האנשים הנגועים. לאורך שנות מדענים יצרו מודלים עכבר מחלת אלצהיימר רבים המנסים לשכפל את הפתולוגיה עמילואיד-ביתא. למרבה הצער, המודלים העכבר רק באופן סלקטיבי לחקות את תכונות המחלה. מוות עצבי, השפעה בולטת במוחם של החולים במחלת האלצהיימר, חסר ניכר בעכברים אלו. לפיכך, אנו ואחרים מועסקים שיטה של יציקת ישירות מינים מסיסים oligomeric של עמילואיד-ביתא - צורות של עמילואיד-ביתא שהוכחו כרעילים ביותר לתאי עצב - stereotaxically לתוך המוח. בדוח זה אנו מנצלים זכר C57BL / 6J לתעד טכניקה ניתוחית זו של הגדלת רמות עמילואיד-ביתא באזור במוח בחר.יעד עירוי הוא gyrus המשונן של ההיפוקמפוס בגלל מבנה המוח הזה, יחד עם המוח הקדמי הבסיסי שמחובר על ידי מעגל כולינרגית, מייצג את אחד מהאזורים של ניוון במחלה. התוצאות של הרמת עמילואיד-ביתא ברכס המשונן באמצעות עירוי stereotaxic לחשוף עלייה באובדן תא עצב ברכס המשונן בתוך השבוע 1, בעוד שיש עלייה במקביל במוות של תאים ואובדן תא עצב כולינרגית באיבר האנכי של הלהקה האלכסונית של ברוקה של המוח הקדמי הבסיסי. תופעות אלה נצפו עד 2 שבועות. הנתונים שלנו מצביעים על כך שמודל עירוי עמילואיד-ביתא הנוכחי מספק מודל עכבר חלופי לטיפול במות נוירון ספציפי אזור בבסיס לטווח קצר. היתרון של מודל זה הוא שעמילואיד-ביתא יכול להיות מורם באופן מרחב ובזמן.
מבוא
פיקדונות עמילואיד פלאק, אשר מורכבים של עמילואיד-ביתא (Aβ 1-42), הם תכונה מרכזית של הפתולוגיה של מחלת אלצהיימר (AD). מחקרים רבים הראו כי רמות גבוהות או רעילות של Aβ oligomeric רקומביננטי 1-42 לעורר מוות עצבי, ניוון הסינפטי, אובדן וחוסר תפקוד; וכן את גירעונות למידה וזיכרון 1-4. אזורים במוח המושפעים כוללים את ההיפוקמפוס, קליפת המוח, ומבנים קורטיקליים כגון המוח הקדמי הבסיסי ו5,6 האמיגדלה. נכון להיום, יש מודלים עכבר מהונדסים מרובים המנסים לדמות את הפתולוגיה Aβ 1-42 של הספירה. בהתאם לזן בעלי חיים אלה להוכיח להיות שימושיים בבדיקה פתולוגית תכונות נבחרות של הספירה. למרבה הצער, למעט ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הניסויים בבעלי החיים, מוסדי והנחיות הלאומיות לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה היו במעקב.
1. הכינו מכשירי ניתוח ופתרונות לניתוח
- החיטוי כל מכשירי ניתוח הנירוסטה.
- הכן אתנול 70% על ידי דילול אתנול מוחלט 200 הוכחה עם deionized מים כיתה מולקולרית סטרילי מזוקק.
- צרף את מחט G 29 למזרק המילטון. נקה את הפנים של מזרק המילטון ומחט על ידי ציור ומים ולהוציא שוב ושוב nanopure דקו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השיטה הנוכחית של הכנת Aβ 1-42 oligomeric רקומביננטי האנושי מניבה מיני oligomeric מסיסים בהיקף של מונומרים, הדימרים, trimers, וtetramers (איור 1 א). מינים אלה נמוכים משקל מולקולרי Aβ 1-42, אבל לא את הסיבים ושלטים, הוכחו בהגדרות רבות להיות רעיל ביותר לתאי עצב 1,4,9,17-19. כדי לקבוע אם או לא oligomeric Aβ 1-42 גורם למוות תאי עצב במוח העכבר Aβ 1-42 (4 μl של 100 מיקרומטר פתרון מניות) היה החדיר לתוך DG של ההיפוקמפוס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי להשיג הזרקת Aβ 1-42 מוצלחת הנסיין או המנתח חייב: 1) להשתמש בטכניקה האספטי; 2) בצורה נכונה לזהות את האזור במוח של עניין עם קואורדינטות מדויקות; 3) להיות מסוגל לאבטח את העכבר כראוי במסגרת stereotaxic עם המוח המפולס בציר AP וML; 4) יש את היכולת להפעיל את micromanipulator עם דיוק; 5) להבטיח טיפול שלאחר ניתוח נכון. אם הם אחרי השלבים העיקריים אלה העכבר צריך לשרוד את הניתוח ללא זיהום הנצפה.
בקנה אחד עם מח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ להעניק NS081333 (לCMT), NIRG-10-171,721 אלצהיימר מענק האיגוד והמכון הלאומי לבריאות נפש מענק MH096702 (לUH), ומכון לאומי להזדקנות במימון מחקר מחלת אלצהיימר מרכז בAG008702 מענק טייס אוניברסיטת קולומביה (לYYJ וJB).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 מ"ג קטמין לכל 1 ק"ג בעל חיים |
| קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) | Henry Schein Medical | לא זמין 10 | מ"ג קסילזין לכל 1 ק"ג בעל חיים |
| בופרנקס (0.3 מ"ג/מ"ל) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 מ"ג בופרנקס לכל 1 ק"ג בעל חיים |
| A&BETA; <תת>1-42 | דיוויד טפלו/UCLA | לא זמין | 100 μ M; עמילואיד זה שימש במאמר |
| Aβ 1-42 | Bachem | H-1368 | ניתן להשתמש במקום עמילואיד ממעבדת Teplow |
| Aβ <תת>1-42 | אמריקאי פפטיד | 62-0-80B | יכול לשמש במקום עמילואיד ממעבדת Teplow |
| Scrambled Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-46B | יכול לשמש כפפטיד בקרה להשוואת Aβ 1-42 |
| נוגדן NU4 (נוגדן עמילואיד אוליגומרי) | מתנה מוויליאם קליין/נורת'ווסטרן ארה"ב. | לא זמין | 1:2,000 דילול |
| נוגדן אנטי עמילואיד אוליגומרי (ארנב רב-שבטי) | EMD Millipore | AB9234 | עשוי לשמש במקום Nu4; צריך להיבדק על ידי משתמש הקצה |
| נוגדן 6E10 (עכבר חד שבטי) (נוגדן עמילואיד) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 דילול |
| נוגדן ChAT (עז פוליקלונלית) | Millipore | AB144P | 1:100 דילול |
| DeadEnd מערכת TUNEL פלואורומטרית | Promega | G3250 | עקוב אחר הוראות היצרן עבור השתמש |
| ב-Prolong Gold Antifade Reagent עם DAPI | Invitrogen | P36935 | השתמש בעת החלקת כיסוי שקופיות |
| פלואורוגולד | פלואורוכרום, LLC | לא זמין | 2% תמיסה |
| אתנול מוחלט (200 הוכחה) | Fisher Scientific | BP2818-4 | להכנת 70% אתנול לחיטוי וחיטוי |
| Novex 10-20% טריצ'ין ג'ל | Life Technologies | EC6625BOX | להפרדת A&BETA; 1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | להפעלת 10-20% ג'ל טריצ'ין |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | להעברת 10-20% ג'ל טריצ'ין |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | לשיפור Aβ אות 1-42; עקוב אחר פרוטוקול היצרן |
| Protran BA79 קרום ספיגת ניטרוצלולוזה, 0.1 μ m | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | להעברת 10-20% ג'ל טריצ'ין |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus להפעלת 10-20% ג'ל טריצ'ין |
| ג'ל עיניים GenTeal Lubricant Eye | Gel Novartis | אינו זמין | לשמירה על לחות עיני העכבר במהלך הניתוח; ניתן למצוא בחנויות בתי המרקחת המקומיות |
| [header] | |||
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | אינו זמין | לשמירה על לחות עיני העכבר במהלך הניתוח; ניתן למצוא בחנויות בתי מרקחת מקומיות; ניתן להשתמש במקום GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | לחיטוי וחיטוי |
| מרית עגולה/מחודדת | VWR | 82027-490 | לפתיחת פה |
| של בעלי חיים בולדוג סרפינס מהדקים (עמום הלסת 9X1.6 מ"מ; אורך 28 מ"מ) | כלי מדע עדינים | 18050-28 | אופציונלי; לשמירה על עור הקרקפת מרוחק במהלך ההזרקה |
| מספריים עדינים ישרים (קצה חיתוך 25 מ"מ; אורך 11.5 ס"מ) | כלי מדע עדינים | 14060-11 | לחיתוך קרקפת |
| #3 ידית אזמל | כלי מדע עדינים | 10003-12 | |
| #11 להב כירורגי | כלים מדעיים עדינים | 10011-00 | לביצוע חתך בקרקפת |
| מלקחיים דפוס סטנדרטי לסטודנטים (קצה עמעם. 2.5x1.5 מ"מ; אורך 11.5 ס"מ) | Fine Science Tools | 91100-12 | להחזקת קרקפת סגורה במהלך תפירה |
| ערכת גוזם משולבת | Kent Scientific | CL9990-1201 | לגילוח שיער |
| T/Pump מחזור מים חמים | קנט סיינטיפיק | TP-700 | להתחממות בעלי חיים במהלך ניתוח |
| כרית מלחמה ניתנת להפעלה (5 אינץ' x 10 אינץ') | קנט סיינטיפיק | TPZ-0510FEA | להצמדתו למחזור המים החמים T/Pump כדי לחמם את החיה במהלך הניתוח |
| מקדחה מיקרו אלחוטית | 58610 | השתמש בקוצי פלדה 0.8 מ"מ כדי לקדוח חורים במעבדת הגולגולת | |
| מכשיר סטריאוטקסי סטנדרטי עם עכבר & מתאם עכברוש יילודים | 51615 | ||
| רק עבור עכבר סטריאוטקסי | מכשיר סטולינג | 51730 | יכול להשתמש בזה במקום סטולינג חתול. #51615 |
| מזרק סטריאוטקסי מובהק | 53311 | ||
| מעקר חרוזי זכוכית יבשה | 50287 | לעיקור מכשירי נירוסטה | |
| וילון כירורגי סטרילי (18 אינץ' x 26 אינץ') | Stoelting | 50981 | |
| מזרק המילטון 50 מ"ל, דגם 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | להזרקת מוח; השתמש במזרקים שונים לתמיסות שונות |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | לחיבור למזרק המילטון להזרקת מוח |
| 1 מ"ל BD מזרקי טוברקולין | VWR | BD309659 | למתן הרדמה ומי מלח |
| 30 גרם מחט (0.5 אינץ') | VWR | BD305106 | למתן הרדמה ומי מלח |
| סולם סדרת CS אלקטרוני נייד (Ohaus) | VWR | 65500-202 | לשקילת בעלי חיים לקביעת מינון הרדמה |
| פלטה חמה (צלחת עליונה עמעמת 7.25x7.25 אינץ') | VWR | 47751-148 | לחימום בעלי חיים לאחר ניתוח |
| חיתוך תפר משי Sofsilk C-1 3/8, 12 מ"מ | Covidien | S1173 | לסגירת |
| פצע דבק רקמות Vetbond (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | אופציונלי: לסיוע בסגירת פצעים; יש להשתמש עם תפרים. |
| אפליקטורים סטריליים עם פיר עץ כותנה | פישר מדעי | 22-029-488 | לניקוי וייבוש פצע כירורגי |
| פישרברנד סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק | 12-550-15 | לאיסוף חלקי מוח |
| VWR מיקרו כיסוי זכוכית 24 X 50 מ"מ | VWR | 48393241 | להרכבת שקופיות מיקרוסקופ |
| Thermo Scientific Nalgene מזרק מסנן 0.2 μ m | Fisher Scientific | 194-2520 | לעיקור תמיסת מלח |
| סמני עור סטריליים עם קצה כפול של Viscot | Medical Medline | VIS1422SRL91 | לסימון קואורדינטות על הגולגולת |
מקורות
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
