Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאנקפסולציה של תאים קטבוליים, הצורכים שומנים לייצור חום ברקמת השומן התוך-בטנית ומגבירים את פיזור האנרגיה בעכברים שמנים.

תקציר

אנקפסולציה התא פותחה כדי ללכוד תאי קיימא בתוך ממברנות חדירות למחצה. Engrafted התאים במארז יכולים להחליף מטבוליטים משקל מולקולריים נמוכים ברקמות של המארח טופל להשיג הישרדות לטווח ארוך. ממברנה חדירה למחצה מאפשרת engrafted תאים במארז, כדי למנוע דחייה על ידי המערכת החיסונית. הליך אנקפסולציה נועד לאפשר שחרור מבוקר של תרכובות ביו, כגון אינסולין, הורמונים אחרים, וציטוקינים. כאן אנו מתארים שיטה לאנקפסולציה של תאי קטבולי, אשר צורכים שומנים לייצור חום ופיזור אנרגיה (thermogenesis) ברקמת השומן תוך-בטני של עכברים שמנים. Encapsulation של תאי קטבולי התרמוגני עשוי להיות פוטנציאל החלים על המניעה וטיפול בהשמנת יתר וסוכרת מסוג 2. יישום אפשרי נוסף של תאי קטבולי עשוי לכלול סילוק רעלים מאלכוהול או מטבוליטים רעילים אחרים ומזהמים סביבתיים.

מבוא

שכיחות גוברת של מחלות כרוניות ¹ עוררה מחקרים על השתלה של אוכלוסיות תאים טיפוליות ^2. תאי גזע Syngenic או אלוגנאית הם סוגי התאים הנפוצים ביותר עבור יישומים אלה ^2. עם זאת, טיפולים אלה אינם מאפשרים שליטה של ​​בידול והגירה של תאי גזע לאחר השתלה ולא יעלו יעיל. השתלה של תאים מהונדסים גנטי עם פונקציות מועילות צופה שיפור הטיפול במחלות רבות. עם זאת, שינויים גנטיים תא מוכרים על ידי המערכת החיסונית של המארח, ולכן, טיפולים אלה מחייבים דיכוי חיסוני ^3. Encapsulation של תאים מייצרים אינסולין פותח על ידי ד"ר ⁴ צ'אנג. הטכניקה מבוססת על אנקפסולציה של תאים בטיפות אלגינט ששקועים בפתרון סידן כלורי. מולקולות אלגינט מורכבות מחומצת mannuronic (M) וguluronic (G) ויכולות להיות מחוברות על ידי Ca ^{2 +}. לאחר gelation, חרוזים מושעים פתרון פולי-L ליזין (PLL). במהלך שלב זה, PLL נקשר לG ו- M במולקולות אלגינט הקובעת קרום של הכמוסה. הנקבוביות של הקרום של הכמוסה יכולה להיות מווסת על ידי שינוי ריכוזי M וPLL, זמן הדגירה, וטמפרטורה. המחייב של PLL גם תלוי בסוג והריכוז של אלגינט. מטריצות אלגינט crosslinked עם Ca ^{2 +} יונים, אינן יציבים בסביבה הפיזיולוגית או בפתרונות חיץ משותפים עם ריכוז גבוה של פוספט ויונים ציטראט. מאגרים אלה יכולים לחלץ Ca ^{2 +} מאלגינט ונוזל הליבה. עיבוי של ליבת אלגינט מספק מרחב בתוך קפסולות לתנועה וצמיחה תאיות. תאים במארז באלגינט polyanionic עם פולי-L ליזין polycationic (APL) הם בלתי חדירים לנוגדנים אבל יש לי זרם של חומרים מזינים וזרימה של רעלים. המאפיינים של APL אלה מאפשרים לטווח הארוך survival של תאים במארז לאחר השתלה למארחים שונים מבחינה גנטית. אליוט et al. דיווח ההישרדות של תפקוד תאי לבלב חזירי במארז במטופל אנושי תשע שנים לאחר ההשתלה ^5.

טכניקות Encapsulation ניתן לסווג למיקרואנקפסולציה (3-800 מיקרומטר) וmacroencapsulation (גדול יותר מ -1,000 מיקרומטר). Microcapsules עמיד יותר מאשר macrocapsules ^6. מאז גילויו על ידי ד"ר צ'אנג ועמיתים בשינה 1964, מיקרואנקפסולציה כבר בשימוש נרחב לאנקפסולציה של תאים אנבוליים ייצור אינסולין, הורמונים אחרים, ומולקולות ביו ^7. טיפולים אלה בפני מספר אתגרים ברקמת המארח כולל סיסטיק ותגובה חיסונית ^8. בתחילה, תופעות לוואים הקשורות לאיכות biopolymers נפתרו. עם זאת, השתלה של תאים אנבוליים עדיין יוזמת תופעות לוואי, כגון סיסטיק, כתוצאה מההורמון overproduction מחוץ לבלוטה מיוחדת.

בעשורים האחרונים, השמנת יתר וסוכרת מהסוג 2 הגיעה לממדי מגיפה ^9. יותר מ -30% מאנשים בוגרים בעולם סובלים מעודף משקל והשמנת יתר ^10. היווצרות מוגברת תוך-בטני (IAB) שומן מגבירה שכיחות של דלקת כרונית ומקדמת סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם, סוגי סרטן מסוימים, ותחלואות אחרות ^11-13. כמה שורות של ראיות מצביעים על כך פתוגנזה הקשורים שומן IAB ניתן נמנעה על ידי תאי שומן ספציפיים. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השתלה של תאי שומן תת עורי לאזור IAB יכול לשפר את חילוף חומרים וירידת התנגדות השמנה ואינסולין במכרסמים בvivo ^14. הפחתה אפקטיבית של התנגדות השמנה והאינסולין נקשרה עם adipocytes התרמוגני מסוגלים מתפוגג אנרגיה בצורה של חום ^15,16. שינוי התרמוגני של adipocytes יכול להיות מושגת על ידי transfection היציבשל גנים המשתתפים בשחרר פרוטון המיטוכונדריה, כגון החלבון שחרר 1 (Ucp1) או של גנים המסדירים ביטוי של Ucp1 וגנים התרמוגני אחרים ^15,16. המחקרים האחרונים שלנו הראו כי המחסור בA1 אלדהיד דהידרוגנז 1 (Aldh1a1) מוביל לשיפוץ התרמוגני של שומן IAB שמפחית השמנת יתר ועמידות לאינסולין בעכברים אלה ^17,18. יש לציין, אנקפסולציה של התרמוגני Aldh1a1 הלקוי (Aldh1a1 - / -) preadipocytes מתווכת אותו אפקט טיפולי בשומן IAB בעכברים שמנים מסוג בר, מציעה הזדמנויות טיפוליות חדשות לטיפול בשומן IAB ^18. בהגדרות ניסוי, תאים במארז מאפשרים לחוקרים ללמוד השפעות של אוכלוסיות תאים ספציפיות בעלות אופן יעיל ^19. כאן אנו דנים בשיטה של ​​אנקפסולציה של שורת תאי קטבולי התרמוגני והמעבדה שלו ויישום טיפולי במודל עכבר של השמנת יתר. הפרוטוקול מתאר tשלבי HREE לייצור microcapsule (איור 1): ההיווצרות של microbeads אלגינט (איור 1 א), ההיווצרות של פולי-L ליזין polycationic (PLL) קרומים על פני השטח של microbeads (איור 1), והסרת ליבות אלגינט (איור 1 ג).

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת מדינת אוהיו. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי פרוטוקול IACUC. כל הנהלים בוצעו תחת ממשלת רמת הבטיחות הביולוגית 2 עם זרימה למינרית. עקבנו אחרי כל דרישות הבטיחות סטנדרטית ונהלים. טכניקת מיקרואנקפסולציה להכנת microcapsules שבוצעה כמתואר ^{17, 18.}

1. תכשירים מחומרים

1. הכן 10 מיליליטר של 2% פתרון אלגינט נתרן במלח autoclaved פיסיולוגי (0.9% NaCl במים). הכן 0.05% פתרון PLL במלח פיסיולוגי. הכן את הפתרונות הללו ביום שלפני ומערבבים הלילה. סנן את הפתרונות עם 0.22 מיקרומטר סינון לפני השימוש.
2. הכן נתרן ציטרט 50 מ"מ ו- 100 מ"מ CaCl ₂ בפתרונות NaCl 0.9% וחיטוים.
3. החיטוי כל הפתרונות, מחטים, אלקטרודות, וכוסות. ביסודיות מחטים נקיות עם חוטים כדי למנוע סתימה.
4. לקבוע את הכמות המתאימה של תאים לשימוש עבור הכמוסות (102 microcapsules נחוץ לכל ² סנטימטר של כן ויש כ -500 תאים לכל כמוסה ^18). השתמש 1 מיליליטר של אלגינט נתרן לשני מיליון תאים.
5. הכן 'פיברובלסטים צמיחה בינוני "עגל בסרום המכיל 10%, ו- 100 U / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין בסוכר גבוה (גלוקוז 4,500 מ"ג / ליטר) הבינוני של הנשר השתנה Dulbecco (DMEM).
   1. הכן "בידול בינוני אני 'המכיל 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, dexamethasone 1 מיקרומטר, 0.5 xanthine 3-isobutyl-1-מתיל מ"מ, ו 100 U / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין בDMEM.
   2. הכן 10% בסרום 'בידול בינוני השני' מכיל שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, ו 100 U / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין בDMEM.
6. הכן מאגר תמוגה המכיל לוח מעכבי פרוטאז אחד לכל 10 מיליליטר חיץ Assay הרדיו-Immunoprecipitation (RIמאגר הרשות הפלסטינית).

2. אלגינט microbeads הכנה (איור 1 א)

1. הסר בינוני ישנה מבקבוק תרבית תאים. יש לשטוף את תאים עם 10 מיליליטר של PBS. להביא תאים בתרחיף עם 0.25% טריפסין EDTA (2 מ"ל לכל בקבוק T175 מחוברות אחת).
2. ספירת תאים בתרחיף תאים באמצעות hemocytometer. השתמש 10 מיליליטר aliquot מהשעית התא ולספור תאים על פי הוראות יצרן. צנטריפוגה התאים שנותרו במדיום צנטריפוגה ב 480 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
3. להשעות את התא גלולה באלגינט נתרן כמתואר בשלב 1.4. מעבירים את פתרון אלגינט תאי נתרן למזרק 5 מיליליטר.
4. הסר בועות אוויר בפתרון, להוסיף מחט 23-מד ולהפוך את המזרק כדי ליצור כיס 1 מיליליטר של אוויר.
5. מניחים כוס קטנה (180 מיליליטר) מכילה 144 מיליליטר של 100 מ"מ CaCl ₂ פתרון מתחת לזרבובית המחט של הנרתיק-. צרף את האלקטרודה לנרתיק-עם approxim הקצהately 2.5 סנטימטרים מעל פני השטח של פתרון 100 מ"מ CaCl _2.
6. מניחים בחוזקה את המזרק המכיל את פתרון אלגינט תאי נתרן במשאבת המזרק. צרף את צינור הגומי לפתיחה של המזרק. לדחוף את הבוכנה עד פתרון אלגינט תאי נתרן נכנס באמצע הצינור. התאם את המתח 5.4 וולט. הגדר את קוטר 12.06 מ"מ על משאבת המזרק. התאם את המהירות עד 3 מיליליטר / שעה. התחל המשאבה. הפעל את הנרתיק-ולשמור על המתח של 5.4 וולט.
7. סגור את החלון של מכסה המנוע ולהימנע מכל רעידות מיותרות עד סוף היווצרות microbeads אלגינט. אחרי הכל הפתרון עובר דרך המחט, לחזק microbeads הכדור בצורה אלגינט בפתרון ₂ 100 מ"מ CaCl במשך 20 דקות נוספות לפני הציפוי עם PLL.

3. microbeads ציפוי עם PLL (איור 1)

1. הסר את הכוס המכילה microbeads הכדור בצורה אלגינט תאי נתרן ולהעביר microb אלהEADS לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הסר CaCl ₂ פתרון מגלולת microbead.
2. שטוף את microbeads הכדור בצורה אלגינט התאים על ידי הוספת 30 מיליליטר של 0.9% NaCl. נער את הצינור ביד בעדינות. הסר 0.9% NaCl עם 25 מיליליטר פיפטה לאחר microbeads שזרז על ידי כוח הכבידה. חזור על שתי פעמים יותר עבור הסכום כולל של 3 שוטף.
3. השתמש 10 מיליליטר של 0.05% פתרון PLL לכל 1 מיליליטר של תמיסת נתרן אלגינט. הוסף את PLL 0.05% ומערבולת ב1,000 סיבובים לדקים 'במשך 10 דקות.
   הערה: בדרך כלל, 10 דקות מספיקות לציפוי PLL.
4. לאחר מעיל PLL נוצר, להסיר את פתרון PLL ולשטוף את הכמוסות 3 פעמים כמתואר ב3.2.

4. ההסרה של אלגינט Core (איור 1 ג)

1. להוסיף 30 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטרט 50 מ"מ. חכה 5 דקות או עד שכל אלגינט נתרן נמס. לשטוף כמוסות שלוש פעמים כמתואר בשלב 3.1.1.
2. הסר את 0.9% NaCl, להוסיף 20 מיליליטר של מדיום התרבות לשפופרת 50 מיליליטרולהעביר את כל הכמוסות המכילות את התאים לבקבוק תרבית תאים. לטפל בתאים במארז בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים ^18.

5. ביישומים חוץ גופית לחקר אינטראקציות xenograft ותא מארח או קינטיקה של פליטת המטבוליט / זרימה בין תאים (איור 2)

1. תאי מארח תרבות ב -24 בצלחת גם עד ומחוברות לשיתוף תרבויות. השתמש ב'פיברובלסטים הצמיחה בינוני "לpreadipocytes culturing.
2. ההעברה microcapsules ל -24 תאי מארח מחוברות צלחת המכילה גם. להוסיף microcapsules להשיג monolayer (102 microcapsules / ² סנטימטר של היטב).
3. לגרום לבידול מראש adipocyte עם הבידול בינוני I. כל שעה 48, מדיה שינוי לבידול בינוני השני במשך שישה ימים. תאי Lyse חיץ Ripa. השתמש 50 מיקרוגרם לכל חלבון מצב לנתח ביטוי חלבון באמצעות כתם מערבי.

6. בVivo הבקשה לtreatmאף אוזן גרון של השמנת יתר (איור 3)

1. מערבבים isoflurane% 4 עם חמצן לאינדוקציה של ההרדמה isoflurane ו -2% עם חמצן לתחזוקה של הרדמה. לאשר עומק הרדמה נאות על ידי צביטת הבוהן.
   1. החל משחה אנטי גירוד בעיניים כדי להגן על הקרניות מהתייבשות.
2. להשתמש בתאים במארז שמתויגים באופן קבוע עם חלבון הקרינה מלאכותי, כגון חלבון ירוק הקרינה (GFP).
3. השתמש במזרק 3 מיליליטר ומחט 20 מד להזריק תאים במארז.
   1. להזריק 0.5 x 10 ⁶ תאים תלויים ב0.2 מיליליטר של PBS לכל תחנת שומן IAB שממוקמת באזור intraperitoneal בין בלוטת מין וכליות, כפי שמוצג באיור 3. השתמשו בכרך זה של PBS ומספר תא לעכברים עם משקל ממוצע של 40 גרם. התאם את מספר נייד ונפח בעכברים שיש לי משקל שונה או לקביעת השפעות תלוית מינון.

תוצאות

איור 1 מראה כי בכל שלב של ייצור microbeads יכול להיות נשלט מתחת למיקרוסקופ. איור 2A מראה כיצד התרבות משותפת adipocytes עם monolayer של תאים במארז. איור 2 היא דוגמא מייצגת של מחקר כמותי באמצעות adipocyte / שיתוף תרבויות microcapsules ש תוארו בסעיף 5. Lysates של adipocytes נותחו באמצעות כתם מערבי. תאים במארז לא נותחו בניסוי זה. ATGL הראשוני ונוגדני β-אקטין שמשו בדילול 1: 1,000. היחס של ATGL ל- β אקטין מוצג SD ממוצע כשלושה ניסויים בל...

דיון

שיטות שונות שימשו כדי לתמצת תאים, כולל ייבוש, חול, ותחליב ^19. בשיטה זו, נמתחים חרוזים אלגינט באמצעות מחט, אז מצופים PLL וליבת אלגינט תפורק כדי להשלים את אנקפסולציה. למרות ששיטה זו הייתה בשימוש כבר שנים, היווצרות של חרוזים עם הגודל הרצוי וצורה כדורית היא עדיין מאתגרת. הגודל של הכמוסות תלוי מאוד בצמיגות של פתרון אלגינט נתרן, קוטר מכבש ואת המרחק בין קצה המחט ופתרון CaCl ₂ ^20. הקצר יותר את המרחק בין קצה המחט ואת פני השטח של CaCl פתרון _2, חרו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשיר אנקפסולציה (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	ללא
משאבת מזרק מדעית KD	KD מדעי	780100Y	ללא
מיקרוסקופ אולימפוס	Olympus Optical	IX70-S8F2	ללא
נתרן אלגינט	סיגמא	MKBP8122V	ללא
פולי-L-ליזין הידרוברומיד (PLL)	Sigma	020M5006V	ללא
סידן כלורי	סיגמא	SLBJ2662V	ללא
נתרן ציטראט tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	ללא
נתרן כלורי	סיגמא	SLBD2595V	ללא
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	ללא
נוגדן ראשוני ATGL (מארנב)	איתות תאים	2138S	ללא
נוגדן משני (אנטי ארנב)	LI-COR	926-68071	ללא
מאגר בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) Boston	BioProducts	D25Y6Z	ללא
פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS)	סיגמא RNBD2893		ללא
טריפסין	גיבקו	25200-056	ללא
קורטיזון 10 משחה נגד גירוד	קורטיזון 10	C4029138	ללא
נשר שונה של דולבקו (DMEM)	Gibco	11965-092	ללא
סרום עגל יילוד (CS)	Sigma	N4762	ללא
סרום בקר עוברי (FBS)	Sigma	F4135	ללא
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX)	Sigma	I0516	ללא
דקסמתזון	Sigma	D4902	ללא
אינסולין (בקר)	Sigma	I5879	ללא
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז	Roche	4693159001	None

סרום