סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational
במאמר זה
סיכום
תקציר
הסחר התוך-תאי של קולטנים הוא אוסף של תהליכים מורכבים ומבוקרים מאוד. סחר בקולטנים מווסת את האיתות ואת תגובת התאים הכוללת לליגנדים והוא עצמו מושפע ממצבים תוך-תאיים וחוץ-תאיים, כולל איתות המושרה על ידי ליגנד. מותאם לשימוש עם תאים מתורבתים מצופים חד-שכבתיים, אך ניתן להרחבה לפרוסות רקמה צפות חופשיות, פרוטוקול זה משתמש בתיוג חיסוני וניתוח קו-לוקליזציה כדי לעקוב אחר שינויים בסחר בקולטנים תוך תאיים בעקבות התערבויות כרוניות/ממושכות ואקוטיות, כולל טיפול תרופתי אקסוגני. לאחר טיפול תרופתי, התאים מקבלים תווית חיסונית כפולה עבור הקולטן ועבור סמנים עבור התאים התוך-תאיים המעניינים. לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית רציפה כדי ללכוד פוטומיקרוגרפים דו-ערוציים של תאים בודדים, אשר נתונים לניתוח קו-לוקליזציה ממוחשב כדי להניב ציוני קו-לוקליזציה כמותיים. ציונים אלה מנורמלים כדי לאפשר איגום של שכפולים בלתי תלויים לפני ניתוח סטטיסטי. ניתן גם לעבד פוטומיקרוגרפים מייצגים כדי ליצור איורים להמחשה. כאן, אנו מתארים טכניקה רבת עוצמה וגמישה להערכה כמותית של סחר מושרה בקולטנים.
מבוא
קולטנים, במיוחד קולטני חלבון G בשילוב (GPCRs), באופן שיגרתי נסחרים intracellularly, ומתא השטח 1. תהליכי complexly מתוזמרים ופיקוח הדוק אלה מכתיבים משלים קולט זמין של התאים ולהסדיר את פעילות קולטן זמנית, הפחתת רגישות, וresensitization 2-4. חשוב לציין, תהליכים אלה מגיבים לסביבות סלולריות כוללים פעילות קולט תוצאת משימוש בסמים או חוסר פעילות. כלומר, הפעולות של ligands בקולטנים יכולות לשנות סחר תאיים של קולטנים אלה, ובכך לשנות את היענות תא. באופן זה, ligands החיצוני להפעיל עוד יותר השפעות על תפקוד תא, אפילו מעבר למפלי שליח למפעיל קלאסיים 5,6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול זה הוא רחב תואם עם מודלים שונים מצופה monolayer תא / רקמת תרבות, משטרי טיפול תרופתי, ומטרות תיוג. כך בשימוש בפועל, פרמטרים ספציפיים רבים ישתנו בהתאם לעיצוב ניסיוני. כאן, אזכור של הפרמטרים המוגדרים על ידי משתמש אלה הם גנרי. תנאי דוגמא, כפי שכדי להשיג את תוצאות הנציג, כלולים בכתב נטוי.
1. פתרונות
- הכן חיץ כביסה ידי ערבוב 0.1M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ"מ) ותמיסת מלח 0.05% Polysorbate 20; pH 7.4 ב RT.
- הכן חי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בטכניקה זו, ניתן לכמת שינויים בסחר בהודעת הפנמת קולטן הבאים שני טיפולים תרופתיים כרוניים / ממושכים וחריפים. לאחר טיפולים תרופתיים, קיבעון, ותיוג, photomicrographs שני ערוצים ברזולוציה גבוהה נלכדים של כל תא של עניין. נציג תמונות עשויות להיות משולבות עם colocalization כוזב בצבע כדי ליצור דמויות המחשה (איור 1). ניתוח colocalizational שלאחר מכן, כפי שתואר, תניב תוצאות כמותיות של colocalization יעד היעד (למשל סמן קולט-תא,). נתונים אלה עשויים לשמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש לנו מותאם פרוטוקול זה לניתוח תרבויות העיקריות של נוירונים גנגליון שורש הגבי בוגרים (תאי עצב תחושתיים ראשוניים). גם זה יכול לשמש, עם שינוי קטן או לא, לתאים בתרבית מצופה monolayer רחב. ניתוח colocalizational ניתן גם בחתכי רקמה והכנות אחרות כגון 11, לעומת זאת רכיבי הטיפול התרופתי וקיבוע רקמה / הכנה לא יהיו מתאימים.
של עניין, יכולות לשמש גם שיטות ICC הציגו כאן, עם קיבוע מתאים והכנת רקמה, לבצע אימונוהיסט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מCIHR (MOP394808) וקנדה מחקר קתדרה לCMCEWO היה הנמען של מלגת פוסט-בוגר מNSERC.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| נתרן כלורי | סיגמא אולדריץ' | S9888-500G | |
| טווין 20 | פישר סיינטיפיק | BP337-500 | |
| חומצה הידרוכלורית | סיגמא אולדריץ' | 258148 | |
| אלבומין מסרום בקר | סיגמא אולדריץ' | A7906-100G | |
| ג'לטין מדגי מים קרים עור | סיגמא אולדריץ' | G7041-100G | |
| קורנינג קוסטאר תרבית תאים צלחות: 24 בארות | פישר סיינטיפיק | 720084 | |
| 12 מעגל כיסוי מיקרוסקופ זכוכית | פישר סיינטיפיק | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא אולדריץ' | S9638-500G | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי | סיגמא אולדריץ' | S9763-500G | |
| פרפורמלדהיד | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 מלקחיים - סטנדרטי/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| ארנב נגד DOR | MyBioSource | MBS316175 | בשימוש ב-1:1,500 |
| נוגדן נגד Rab5 עכבר | Sigma Aldrich | R7904 | בשימוש ב-1:750 |
| נוגדן נגד Rab11 עכבר | Millipore | 05-853 | בשימוש ב-1:500 |
| נוגדן נגד LAMP1 עז | סנטה קרוז | SC8098 | בשימוש ב-1:750 |
| נוגדן נגד ארנב חמור Alexa 488 נוגדן מצומד | Life Technologies | A-21206 | בשימוש ב-1:200 עד 1:2,000 |
| נוגדן נגד עכבר עז Alexa 594 נוגדן מצומד | Life Technologies | A-11005 | בשימוש ב-1:200 עד 1:2,000 |
| חמור נגד עזים Alexa 594 נוגדן מצומד | Life Technologies | A-11058 | בשימוש ב-1:200 עד 1:2,000 |
מקורות
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. T....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
