מאמר שיטה

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

DOI:

10.3791/52835

⸱

2 ביולי 2015

 , 
1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמנו שיטה לעטיפת תאי גזע פלוריפוטנטיים (תאי PS) לכמוסות הידרוג'ל אלגינט באמצעות זרבובית קו-אקסיאלית. זה מונע מהתאים להצטבר יתר על המידה ומגביל את מתח הגזירה שחווים התאים בתרבית השעיה. הטכניקה ישימה לייצור המוני של תאי PS כמו גם למחקר על נישת תאי גזע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים (תאי PS) הם המוקד של מחקר אינטנסיבי בשל תפקידם ברפואה רגנרטיבית ובבדיקת תרופות. עם זאת, פיתוח מערכת תרבית המונית יידרש לשימוש בתאי PS ביישומים אלה. תרבית תרחיף היא שיטת תרבית מבטיחה לייצור המוני של תאי PS, אם כי כמה נושאים כמו שליטה בצבירה והגבלת מתח הגזירה ממדיום התרבות עדיין לא נפתרו. על מנת לפתור בעיות אלה, פיתחנו שיטה של אנקפסולציה של סידן אלגינט (Alg-Ca) באמצעות זרבובית קו-אקסיאלית. שיטה זו יכולה לשלוט בגודל הקפסולות בקלות על ידי הזרמה משותפת של גז N2. קוטר הקפסולה הניתן לשליטה חייב להיות גדול מ-500 מיקרומטר מכיוון שקצב זרימה גבוה מדי של גז N2 גורם לפירוק טיפות ובכך קפסולות בגודל הטרוגני. יתר על כן, ריכוז נמוך של Alg-Na ו-CaCl2 גורם לכמוסות לא כדוריות. למרות שקפסולה של Alg-Ca ללא ציפוי של Alg-PLL מתמוססת בקלות ומאפשרת איסוף תאים, הם יכולים גם לדלוף החוצה מכמוסות חסרות ציפוי Alg-PLL. ואכן, ציפוי אלגינט-PLL יכול למנוע דליפה תאית אך גם קשה לשבור אותו. ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו כדי לחקור את נישת תאי הגזע כמו גם את הייצור ההמוני של תאי PS מכיוון שאנקפסולציה יכולה לשנות את המיקרו-סביבה המקיפה את התאים, כולל המטריצה החוץ-תאית וריכוז הגורמים המופרשים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (תאי iPS) הם כיום מקור למחקר אינטנסיבי בשל תפקידם ברפואה רגנרטיבית. עם זאת, נדרשות כמויות עצומות של תאים להתחדשות רקמות. לדוגמה, כמיליארד תאי לבלב נדרשים לחולה סוכרת מסוג 11. עם זאת, תרבית צלחת קונבנציונלית מסוגלת להשיג רק 1 ×10 5 תאים/ס"מרבוע, ובכך דורשת 1 מ"ר של שטח תרבית כדי להשיג מספיק תאי לבלב שמקורם בתאי גזע לטיפול בחולה סוכרת מסוג 1. פיתוח מערכת לתרבית המונית של תאי גזע פלוריפוטנטיים, כגון מיקרו-נשא2 ותרבית תרחיף נדרש אפוא לרפואה רגנרטיבית. תרבית תרחיף מייצגת שיטה מבטיחה לתרבית המונית אך שליטה בצבירת תאים היא מאתגרת בתרביות השעיה ישירות של תאי iPS אנושיים3. ואכן, תאים תלויים חשופים למתח גזירה, הגורם לנזק לתאים3 או התמיינות4.

מחקר על אנקפסולציה מבוססת הידרוג'ל נערך כדי לפתור בעיות הקשורות לתרבית מתלה. בכמוסות הידרוג'ל, התאים מוגנים מפני זרימת המדיום. דיווחים קודמים תיעדו את השימוש בסוגים שונים של הידרוג'ל, כולל אגרוז5, PEG6 ואלגינט (Alg), לאנקפסולציה תאית. הידרוג'ל Alg-Ca הוא אחד ההידרוג'לים השימושיים ביותר לאנקפסולציה של תאים מכיוון שהידרוג'ל Alg-Ca נוצר מיד לאחר הטלת תמיסת אלגינט לתמיסת CaCl2 ומתעכל בקלות על ידי אנזימים או ריאגנטים כלאטיים.

כאן, הקמנו תהליך אנקפסולציה יציב של אלגינט עבור תאי iPS באמצעות זרבובית קו-צירית. על ידי שימוש בזרימת גז N2 ליצירת טיפות, ניתן לעטוף תאים בכמוסות אחידות ללא צורך בריאגנטים אחרים כגון שמן. בשיטה זו, קצב הזרימה של N2 והריכוז של CaCl2 ושל אלגינט הם תנאי ההפעלה העיקריים המשפיעים על הגודל, הצורה והאחידות של הכמוסות. דוח זה מדגים את האופטימיזציה של תנאי הפעלה אלה באמצעות מצלמה מהירה ומיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חומרי הכנה

  1. הכן 10 חיץ HEPES מ"מ. התאם את ה- pH 7.0 ב RT ולהוסיף NaCl 0.9%.
  2. הכן 5% פתרון אלגינט ופתרון 10 מ"מ EDTA על ידי ערבוב מלח HEPES שנאגר ערוכים 1.1. התאם את ה- pH 7.0 ב RT.
  3. החיטוי חומרים כימיים (1.1, 1.2) במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
  4. להכין מאכלי 60 מ"מ מצופה ג'לטין שכבתי עם 1.2-2.0 פיברובלסטים עכבר עובריים × 10 6 (MEF) תאים, אשר נחשבים כתאים מזינים על ידי דגירה בתוך DMEM המכיל 10% FBS ES-מוסמך ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר של C mitomycin 90 - 120 דקות.
  5. לשמור על גזע pluripotent עכבר מושרה (iPS) תאים בצלחת עם התאים מזינים בנוכחות 5 מיליליטר הגבוה של גלוקוז DMEM המכיל 20% של ES-המוסמך FBS, 50 מיקרומטר של 2-mercaptoethanol, חומצת אמינו לא חיונית, ואנטיביוטיקה ( 100 / מיליליטר יחידות של פניצילין G נתרן, 100 מיקרוגרם / מיליליטר של סולפט סטרפטומיצין, ו -250 / מיליליטר ng של amphoteriCIN B).
  6. זרע 4 × 5 תאי iPS 10 על צלחת 60 מ"מ מצופה ג'לטין ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשנות את מדיום התרבות בכל יום במהלך דגירה. לאחר 3-4 ימים של תרבות, trypsinize תאי דקות 1 עם 500 μl של 0.05% טריפסין המכיל EDTA 0.02% על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אחרי זה, לנתק את התאים על ידי הקשה על צלחת התרבות עשר פעמים.
  7. להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM עם 10% מהשעית תא צנטריפוגות ES-מוסמכת FBS ואנטיביוטיקה (להלן תאי iPS עכבר ניתוק לתוך תאים בודדים ידי pipetting עם micropipette 1000 μl שלוש פעמים) בשעה 160 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר supernatant ולספור את התאים . בעקבות ספירת תאים, לזרוע תאים שנאספו על צלחת ג'לטין מצופה ו דגירה למשך 30 דקות לבודד את תאי iPS מתאי MEF. לאחר הספירה של התאים (בדרך כלל 1-3 × 10 6 תאים / מנה יכולה להיות שנאספו), reseed 4 × 10 5 תאים iPS עלהצלחת.

2. תא Encapsulation לאלגינט Hydrogel קפסולות

  1. לאסוף את התאים על ידי אותו ההליך מתואר ב1.5 ו -1.6. בעקבות צנטריפוגה 160 × גרם במשך 3 דקות, לשטוף את התא גלולה iPS עם מי מלח HEPES שנאגר שלוש פעמים. לאחר מחדש השעיית התאים בתמיסת מלח HEPES שנאגר, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מיקרומטר תא כדי להסיר אגרגטים גדולים, שעלולים לסתום את החרירים.
  2. מערבבים 2 מיליליטר של השעיה תא בתוך תמיסת מלח HEPES שנאגר ו 3 מיליליטר של 5% פתרון ALG-Na. לבסוף 5 מיליליטר של השעיה תא בתוך 3% פתרון ALG-Na מתקבל. צפיפות תאים היא desirably יותר מ 10 6 תאים / מיליליטר.
  3. לאחר איסוף ההשעיה התא לתוך מזרק 5 מיליליטר, להתקין זרבובית שיתוף צירי (איור 1 א ', ב') על המזרק ולהגדיר אותם על משאבת מזרק. זרימת גז 2 לפלוט N (נמוך מ1 ליטר / דקה) באמצעות המחט החיצונית של נחיר קואקס ולגרש את ההשעיה התא דרך הנחיר הפנימי.
  4. לאסוף טיפות לתוך 250 מיליליטר של 0.5% פתרון CaCl 2 ולהמתין 10 - 20 דקות לgelation תוך ערבוב ב60-90 סל"ד.

3. טיפול באלגינט קפסולות (אופציונאלי)

  1. דגירה כמוסות ALG-Ca ב0.05% (w / v) פתרון פולי-L ליזין (PLL) במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לאחר שטיפת הכמוסות עם מי מלח HEPES שנאגר, דגירתם בDMEM המכיל 10% FBS כדי לנטרל את המטען החשמלי על פני השטח שלהם. לנצל אותם ככמוסות מצופים (איור 1 ג).
  3. דגירה הכמוסות במלח HEPES שנאגר המכיל 10 mM EDTA במשך 5 דקות. הכמוסות טופל EDTA מנוצלות ככמוסות חלולות (איור 1 ג).

4. תאי תרבות ואיסוף בקפסולות אלגינט

  1. דגירה התאים במארז ב 75 סל"ד עם רעד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2במשך 10 ימים.
  2. לאסוף דגירה הכמוסות ב 10 מ"מ EDTA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. איסוף תאים מכמוסות אלגינט ללא טיפול PLL על ידי צנטריפוגה בז × 1,000 3 דקות.
  3. אם מטופלים כמוסות אלגינט עם PLL, לשבור את קרום ALG-PLL ידי pipetting למעלה ולמטה כעשר פעמים עם מחט מחוברת למזרק ו צנטריפוגות זה ב 1000 - 5000 × גרם במשך 5 דקות. קוטר מחט צריך להיות נמוך יותר מגודל כמוסה ו -25 G מחטים (260 מיקרומטר) משמשות בניסוי זה (600 מיקרומטר)
  4. לאחר צנטריפוגה, לאסוף תא גלולה לחלוטין מקרומי ALG-PLL שבור אם אתה רוצה לאסוף דגימות ה- mRNA מהתאים. קרומי ALG-PLL נותרו אולי למנוע טיהור mRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול 2.5, פתרון אלגינט גורש יוצר צורה כדורית מייד לאחר הגירוש (איור 2 א - ח). אם ההשעיה הוא גורש עם קצב זרימה N 2 נמוך יותר מאשר 1 ליטר / דקה, גודל הטיפות הוא אחיד (איור ט 2). עם זאת, אם את זרימת N 2 היא גבוהה יותר מאשר 1 ליטר / דקה, הטיפה מתפרקת (איור 2G, החציים לבן) ואת גודל הטיפות הופך הטרוגנית (איור י 2). לאור זאת, קשה להכין טיפות קטנות מ -500 מיקרומטר שימוש בשיטה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבות Encapsulation ניתן להשוות עם תרבויות השעיה ישירות. תרבות השעיה היא שיטה פשוטה כדי להשיג כמויות גדולות של תאי גזע pluripotent מאשר שיטות אנקפסולציה. עם זאת, השליטה הצבירה של תאים בתרבית השעיה היא עדיין מאתגרת. בשיטת אנקפסולציה, צבירה סלולרית מוגבלת בכמוסות וניתן לשלוט ולכן גם. פרסום קודם הראה כי תאי Encapsulated יצרו אגרגטים בגודל אחיד, ואילו גושי תאים גדולים הופיעו בתרבות חופשית השעיה 7. יתר על כן, דו"ח קודם הוכיח כי תסיסה חזקה גורמת למוות תאי בתרבויות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט S-Innovation של סוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית (JST), התוכנית לתארים מתקדמים למנהיגים בחדשנות בחיים (GPLLI) של אוניברסיטת טוקיו, ומלגת מחקר למדענים צעירים של האגודה היפנית לקידום המדע. אנו מודים ל-nac Image Technology Inc. על צילום סרטים באמצעות מצלמה מהירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיברובלסטים של עובר עכברCell BiolabsSNL 76/7
תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי עכברRIKEN Bio מרכז ספיגהiPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM גלוקוז גבוהGIBCO11995
ES מוסמך  FBSGIBCO16141079
אנטיבקטריאלי אנטיבקטריאליGIBCO15240
חומצת אמינו לא חיוניתGIBCO11140
2-מרקפטואתנולGIBCO21985-023
ESGRO לוקמיה גורם מעכבMerck MilliporeESG1107
טריפסין/EDTAGIBCO25300
26 גרם/16 גרם מחטHoshiseido
10 מ"ל מזרקTERUMOSS-10ESZ
נתרן  כלורידוואקו191-01665
HEPESSIGMAH4034
נתרן אלגינטוואקו194-09955
סידן כלורידוואקו039-00475
פולי-L-ליזין (MW = 15,000 - 30,000)SIGMAP7890
EDTADOJINDO345-01865
משאבת סילינג'AS ONE
מיקרוסקופאולימפוסIX71
מיקרוסקופLeicaDM IRB
מצלמת Hispeednac טכנולוגיית תמונהMemrecam HX-3

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
  2. Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
  3. Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
  4. Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
  5. Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
  6. Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
  7. Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
  8. Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
  9. Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
  10. Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
  11. Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
  12. Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
  13. Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
  14. Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LEDTA

מאמרים קשורים