פקקת עכבר דגם על עורק ראשי וכלי לפדר מושרה כלוריד Ferric

סיכום

מודל הפקקת המושרה FeCl₃ בעכברים מתואר כאן. מוצגת שיטה לניטור צמיחת פקקת על ידי תצפית מיקרוסקופיה תוך-חיונית על כלי מזנטרי ועל ידי מדידת זרימת דם בעורק הצוואר.

תקציר

פקקת חמורה והשלכותיה האיסכמיות כגון אוטם שריר הלב, תסחיף ריאתי ושבץ מוחי הן בעיות בריאות עולמיות גדולות. פגיעת כלוריד ברזל היא כיום טכניקה מבוססת היטב לגרימת היווצרות פקקת במהירות ובדייקנות בוורידים חשופים או בעורק בקוטר קטן וגדול. מודל זה מילא תפקיד מפתח בחקר הפתופיזיולוגיה של פקקת, בגילוי ותיקוף של תרופות אנטי-טרומבוטיות חדשות ובהבנת מנגנון הפעולה של חומרים חדשים אלה. כאן מוצג היישום של טכניקה זו על כלי מזנטרי ועורק צוואר בעכברים. השיטה מתארת כיצד לסמן לויקוציטים וטסיות דם במחזור בצבע פלואורסצנטי ולהתבונן, במיקרוסקופיה תוך-חיונית על המזנטריה החשופה, בהצטברותם בדופן כלי הדם הפגוע המובילה להיווצרות פקקת. בעורק הצוואר, החסימה הנגרמת מהיווצרות הקריש נמדדת על ידי ניטור זרימת הדם באמצעות בדיקת דופלר.

מבוא

המחקר של המנגנונים מעורבים בהתפתחות פקקת וההערכה האפקטיביות של תרופות אנטי-טרומבוטיים דורש מבוסס היטב מודלים של בעלי חיים ניסיוניים. המודלים של בעלי חיים גדולים היו הראשון שהשתמש בכפי שהם מספקים כלי גדול יותר דומה לבני אדם מאשר מכרסמים ^1. עם זאת, עלות גבוהה, המתקנים הגדולים יותר הנדרשים והקושי בלתמרן אותם מבחינה גנטית חסרונות עיקריים לשימוש בם ובעלי חיים גדולים כיום מוגבלים למחקרים פרה-קליניים מאוחר פעם אחת בדיקות ראשוניות על מכרסמים נתנו תוצאות חד משמעיות ^2. עם זמינות רחבה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן שממזער את כמות התרופות נוגדות נדרשות לבדיקת in vivo, עכברים משמשים בעיקר למחקר פקקת. לכן, מספר דגמים של הפרעות טרומבוטיים פותחו בעכברים ^3.

מודלים פקקת הוקמו רבים לשבש את intimשכבה של קיר הכלי, ואחריו את החשיפה של מטריקס אנדותל המשנה לזרימת הדם וגורמת להיווצרות של קרישי דם ^4. Thrombi יכול לנבוע מהחשיפה של קולגן אשר מפעילה הפעלת טסיות דם ו / או מהחשיפה של גורם רקמות אשר מפעילה את מפל הקרישה ^5. כמה טכניקות אז מועסקות להשיג פגיעת הכלי הראשונית. פייראנג'לי et al. פיתחה מודל הפרעה מכאני עם כלי מייקרו על וריד הירך ^6. Kikushi et al. תאר מודל אשר מורכב בממשל של מתחם תגובתי תמונה (רוז בנגל) שמצטבר בbilayer השומנים של תאי האנדותל ואחרי העירור הספציפי של קיר הכלי של עניין עם אור הירוק (540 ננומטר) ^7. הפגיעה יכולה גם להיגרם על ידי תאורת לייזר דופק קצרה בעוצמה גבוהה ^8. טכניקה נוספת שהוקמה בראשית העורק הראשי של חולדותמורכב ביישום המקומי של כלוריד Ferric (FeCl ₃₎ ^9. במקרה זה, את תוצאות denudation כלי מפני רדיקלים חופשיים הנוצרים על ידי FeCl ₃ שגורמת חמצון של שומנים והרס של תאי האנדותל ^10. הפציעה גורמת ביטוי של מספר מולקולות הידבקות מפעילות הידבקות טסיות דם וצבירה, כמו גם גיוס לויקוציטים. הוכח כי כדוריות דם לבנות, במיוחד נויטרופילים, לשחק תפקיד מכריע בהפעלה של מפל קרישת דם המוביל אל פקקת ^11. שיטה זו מתאימה גם לשחזר את מפל הקרישה; חוקרים חייבים לזכור כי, במודל עכבר זה, פקקת מושרה בדרך כלל בכלי בריאים ואילו פקקת בבני האדם מתרחש בעיקר בלמשל חולה. כלי טרשת עורקים.

כמודל זה הוא פשוט מאוד ליישום, והוא גם יעיל בעכברים, שהוא עכשיו המצב פקקת משמש בעיקרl לבעלי חיים קטנים במחקרי vivo. בנוסף, טכניקה זו מציעה את האפשרות לגרום להיווצרות thrombi במגוון רחב של כלים. כלי יעד יכולים להיות עורקים או ורידים בקוטר גדול (תרדמה, וריד הירך, נבוב) או בקוטר קטן (לפדר, Cremaster) ^12-14. לאחרונה, זה היה בשימוש גם בעורק המוח האמצעי הפרוקסימלי לפתח מודל של שבץ ^15. ההיווצרות פקקת אפשר לראות ישירות על ידי מיקרוסקופ intravital לאחר תיוג הניאון של טסיות דם וכדוריות דם לבנות או פיקוח על ידי מדידת זרימת דם הירידה בבדיקת טמפרטורה או ^12,16,17 בדיקה דופלר. מספר פרמטרים כגון זמן חסימה, זמן היווצרות קריש דם או גודל פקיק יכולים אז להיחקר. ההבדלים הפיסיולוגיים בין כלי חקרו תוצאה בוריאציות משמעותיות בthrombi הושג. לכן, חוקרים בדרך כלל לבחור את כלי היעד על פי הפרמטרים שהם רוצים measuמחדש ו / או המחלה הגדרה שהם רוצים לחקור. בדרך כלל, המודל על העורק הראשי הוא רלוונטי יותר עבור מחקר על atherothrombosis הקשורים לאוטם שריר לב או שבץ ואילו מחקרים על הווריד הנבוב רלוונטיים יותר עבור מחקר על פקקת ורידים עמוקים. הנגישות של כלי השונים גם קובעת את השיטה המשמשת למדידת צמיחת פקיק. לדוגמא, כלי mesenteric קלים לגשת עושה מודל זה גם מתאים לתצפית מיקרוסקופית intravital והמחקר של הדינמיקה של היווצרות קריש דם. עורק התרדמה הוא פחות נגיש אבל גדול יותר מדידות זרימת דם ומאפשרים ומספק מודל מצוין ללמוד פקקת אוטם.

המודל פקקת מושרה כלוריד Ferric סיפק התקדמות אדירה בהבנת הפתולוגיה זה. זה כבר נעשה שימוש במחקרים רבים המתמקדים בתפקיד של גורם פון Willebrand בהיווצרות פקקת ^18,19. בשילוב עם מודי גנטייםטכניקות שינוי מקום, זה אפשר זיהוי של גן ספציפי רב המעורב בהפרעות טרומבוטיים. Lamrani et al. למשל הראה כי נוק-בגן JAK2 ^V617F קשור היווצרות מואצת של קריש יציב ^20. ג'אנג et al. חקרו את המשמעות הפיזיולוגית של הקולטן טסיות דם P2Y12 והוכיח כי עכברים הטרנסגניים ביתר במיוחד קולטן זה בטסיות דם בלבד, מוצגים במערך פקיק יותר מהיר ויציב בעורק mesenteric נפצע עם FeCl ₃ ^21. התפקיד המכריע של activator plasminogen רקמות מהסוג (tPA) וactivator האוריקינאז הסוג plasminogen (UPA) בתהליך פירוק הפיברין גם נחקר בשיטה זו ^22. יתר על כן מודל זה גם מספק דרך פשוטה ומדויקת של בדיקת יכולות Fibrinolytic של תרופות רבות רומן in vivo. לדוגמא, וואנג ואח '. השתמש במודל זה עבור האימות פרה דואר של activator plasminogen רקומביננטי רומן הממוקד נגד טסיות הופעלו ^23. שיטה זו אפשרה גם את האימות של חלבונים טיפוליים מבודדים מהרוק של קרציות, עטלפי ערפד, ויתושים או מהארס של נחשים עם זיהוי ספציפי של היעד ^24-27. דוגמאות אלה ממחישות את הרבגוניות של מודל כלוריד Ferric. במאמר זה, נתמקד בשתי שיטות וללמוד פקקת ברזל כלוריד מושרה בשני סוג כלי שונה; כלי mesenteric ועורק הראשי.

פרוטוקול

כל הניסויים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי המחקר הרפואי אלפרד והוועדה חינוך של קריית בעלי החיים אתיקה (E / 1534/2015 / ב '). כל המניפולציות כירורגית בוצעו בהרדמה מלאה והבעלים החיים לא חוו כאב בכל שלב. כל הניסויים המתוארים הנן ללא התאוששות.

1. הכנה

1. חותך רצועות דקות של נייר סינון (1 מ"מ x 2 מ"מ).
2. טרי להכין 2 פתרונות של כלוריד Ferric של 4% (w / v) ו -6% (w / v) מדולל למים ללא יונים. הכן פתרון 6G rhodamine 0.3% ב- PBS, מסונן דרך 0.22 מיקרומטר.
3. חותכי חתיכה קטנה (5 מ"מ x 1 סנטימטר) מהפלסטיק הלבן של עטיפת מזרק.

2. גיבוש לפדר עורקיק פקיק נצפה על ידי מיקרוסקופית Intravital

1. שוקל 10-12 שבועות גבר בן C57Bl / 6 עכבר סוג בר ולהרדים בהתאם בתערובת של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) למרות שזריקת intraperitoneal. צג עומק ההרדמה על ידי תגובה לבוהן, זנב ו / או קמצוץ עור, תגובתיות מקמצוץ של קרנית וpalpebral, והיעדר תנועת שפם. במידת צורך, להזריק מנה שנייה של קטמין (50 מ"ג / קילוגרם) כדי לשמור על הרדמה של בעלי החיים. החל משחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. מניחים את העכבר בצלחת פטרי קטנה מונחת על כרית חימום המותאמת עד 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: למרות הזרקת IP עלולה לגרום לכאב לבעלי החיים, את משך הזמן של חוסר נוחות זה יהיה (פחות מ -3 שניות) מינימליות. כאב ואי נוחות כרוכה בזריקות יהיו ממוזערות באמצעות כוח אדם מנוסה ומוסמך וגודל מתאים מחט (25 G). בעקבות כל הנהלים, להרדים את כל בעלי החיים באמצעות מנת יתר של קטמין ו xylazine אחריו נקע בצוואר רחם.
2. לבצע חתך קו האמצע בטן של כ 3 סנטימטר בעור ולחתוך את הצפק בזהירות.
3. מקם את העכבר בצד של חיית המחמדצלחת רי, בעדינות exteriorize המעיים שלה והתפשט בזהירות לפדר עם 2 ניצני כותנה להביא כלי מתאים לפני השטח של צלחת פטרי. ייבש היטב עם מגב עדין.
   הערה: כדי להגביל את תנועתם של כלי mesenteric, papaverine ניתן להשתמש כדי לעכב תנועה פריסטלטית מעיים.
4. משרים את הזנב של העכבר במים חמים כדי להרחיב את כלי להזריק 30 μl של Rhodamine 6G (0.3%) לוריד הזנב של העכבר עם מזרק 29 G לתייג לויקוציטים וטסיות דם.
5. מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ הפוכה ולהתמקד בעורקיק נבחר באמצעות ערוץ השדה הבהיר.
6. משרים להקה של נייר סינון עם 6% (w נ /) ברזל כלוריד (III) ולהחיל את נייר הסינון על עורקיק עם שני מלקחיים; הראשון להחזיק את נייר הסינון, השני אחת ללחץ אותו בעדינות על השטח של עניין. שים לב היווצרות קריש דם בראשון 10 שניות הבאות בתצהיר של נייר הסינון.
   הערה: זה די commעל לפגוע בנימי הדם זעירה המוקפת והדיוק של התצהיר של נייר הסינון והלחץ בעדינות לכן חשוב להגביל את הנושא הזה.
7. שים לב היווצרות קרישי דם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ערוץ TRITC: עירור שיא 557 ננומטר, ננומטר פליטת 576 שיא), דרך נייר הסינון. שימו לב לויקוציטים במחזור וטסיות דם שנלקחו 6G Rhodamine וצבירתם לפקיק לכן קל לזהות.
8. קח את נייר סינון מלאחר 1 דקות של חשיפה לברזל כלוריד (III) ותמשיך לעקוב אחר ההיווצרות של קרישי הדם. לשטוף את הכלי עם PBS.
9. להתבונן ולהקליט את היצירה הדינמית של פקיק מודגש עם התיוג של טסיות דם וכדוריות דם לבנות עם 6G Rhodamine. ללכוד התמונות ולמדוד את הגודל של פקיק. תמונות במסמך שהוצג התקבלו עם מיקרוסקופ intravital הפוך, אם כי 4X אובייקטיבי, בערוץ הקרינה TRITC.
10. Following את כל ההליכים, להרדימו באמצעות מנת יתר של קטמין ו xylazine אחריו נקע בצוואר רחם.

היווצרות פקיק עורקי התרדמה 3. הוערכה על ידי מדידת מהירות זרימת דם

1. שוקל 10-12 שבועות גבר בן C57Bl / 6 עכבר ולהרדים בהתאם בתערובת של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) למרות שזריקת intraperitoneal. החל משחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
2. תקן את העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה באמצעות סרט דביק על רגליים, על כרית חימום המותאמת עד 37 מעלות צלזיוס.
3. הפוך כרית קטנה ממגב אחד והדבק אותה מתחת לראש של העכבר כדי לרומם את הראש מעט. השתמש לולאת חוט עם מלקחיים לניתץ החוטם (להשתמש שיניים העליונות). זה יחשוף את האזור של עורק התרדמה לגישה קלה.
4. בצע חתך עמוק 5 מ"מ קטן של העור ישירות מתחת ללסת, עד לעצם החזה.
5. לנתח את הפאScia ולבודד בר או עורק תרדמה משותפת שמאל או ימין מעל הסתעפות.
6. להציג בזהירות פינצטה ב- בין העורק והעצב להפריד ביניהם. נא לא להפריע העצב פועל קרוב לעורק והימנע מלגעת יותר מדי של עורק התרדמה או כך גורם נזק לכלי השיט. לבודד את החלק של 5 מ"מ לפחות של העורק.
7. ייבש את האזור של העורק כראוי עם מגבים כדי למנוע את זה בכל נוזל מפריע לFeCl _3.
8. שים את חתיכת הפלסטיק הלבנה הקטנה מתחת לחלק המבודד של הראש הנפוץ כל כך ₃ FeCl לא לספוג ברקמות הסובבות. לשם כך, השתמש במלקחיים שני להביא פיסה לראשונה ואז לאט לאט להחליק את נייר הפלסטיק מתחת לעורק.
9. משרים פיסת נייר סינון עם 4% (w / v) או 6% (w / v) כלוריד Ferric ולמקם אותו בכל רחבי העורק.
10. לאחר 3 דקות חשיפה, תוריד את נייר הסינון, לשטוף עם PBS ולייבש את האזור wמגבי ה- i.
11. מניחים את זרימת דופלר הבדיקה סביב האונייה באזור הפגוע ולהתחיל להקליט את השינויים בזרימה. בתרדמה המשותפת הבריא של עכברים בוגרים, הזרימה היא בדרך כלל סביב 1 מיליליטר / דקה. זהירות! קשר של החללית עם כלוריד Ferric יפגע בדיקה לכן יש להימנע מכל מגע. הנתונים במסמך זה מוצג התקבלו עם מטר Transonic מערכת בע"מ זרימה, מודול perivascular TS420 מצויד בזרימת בדיקה דופלר ננו 0.5 PBS.
    הערה: הריכוז של כלוריד Ferric יכול לשנות את קינטיקה של היווצרות קרישי דם וכתוצאה מכך פעמים חסימה שונות. לפיכך, חשיפה ל6% (w / v) כלוריד Ferric נותן חסימה מהר יותר מאשר חשיפה ל4% (w / v) כלוריד Ferric.
12. בעקבות כל הנהלים, להרדים את כל בעלי החיים באמצעות מנת יתר של קטמין ו xylazine אחריו נקע בצוואר רחם ולנקות את הבדיקה דופלר בזהירות.

תוצאות

תצפית הניאון המיקרוסקופית Intravital של לפדר תגלה ההצטברות של Rhodamine 6G כותרת טסיות דם וכדוריות דם לבנות לאורך קיר הכלי נפגע FeCl _3. ההיווצרות ההדרגתית של פקיק חלקי מנוטרת בכלי 200 מיקרומטר לפדר (איור 1). פקיק מופיע לאט וברור לזיהוי אחרי דקות הראשונות של חשיפה לFeCl ₃ (איור 1, t = 60 שניות). 40 שניות לאחר הסרת נייר הסינון ספוג עם FeCl _3, פקקת במהירות התקדמות וסוף סוף נוכחי על הקיר של כל סעיף הכלי נצפה (א...

דיון

המודל פקקת כלוריד מושרה הברזל הוא כלי מחקר מעולה. כפי שניתן לראות במחקר זה, זה מאוד קל ליישום וכאשר משתמש בו בשילוב עם מיקרוסקופיה intravital או flowmeter דופלר, הוא מספק ניטור בזמן אמת טוב של היווצרות קריש דם. התאמת חשיפת הזמן והריכוז של FeCl _3, היא מציעה גם את האפשרות לייצר thrombi או שאינו אוטם או אוטם.

עם זאת, שיטה זו יש גם כמה מגבלות. בעורק התרדמה, החסרון העיקרי הוא שלמרות יעילות ניתן לשנות את זמן...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נייר כרומטוגרפיה	Whatman GE Healthcare	3030917
ברזל (III) כלוריד 40% (w/v)	VWR	24212.298
רודמין 6G	Sigma	R4127
מיקרוסקופ הפוך	Olympus	IX81
מצלמה דיגיטלית בשחור-לבן	אולימפוס	XM10
מד זרימה דופלר	טרנסוניק	TS420
בדיקת זרימה ננו-דופלר	טרנסוניק	0.5 PBS
קטמין	הוספירה	0409-2051-05
קסילזין (רמפון)	באייר	75313
צלחת פטרי	Sarstedt	82.1472
מזרק אינסולין (29 גרם)	עדינים במיוחד	326103
כותנה	BSN רפואי	211827A
Dynek dysilk תפרים	Dynek Pty Ltd	CS30100
מאגר פוספט של Dulbecco (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
כרית חימום	קירשנר	T60

BD אפליקטורים מלח