מאמר שיטה

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

DOI:

10.3791/52975

⸱

4 באוגוסט 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות קולט יגנד קרום לתווך רבים תפקודים תאיים. קינטיקה כריכה ואיתות במורד הזרם מופעלת על ידי אינטראקציות מולקולריות אלה צפויים מושפעות מהסביבה המכנית שבו מתקיים מחייב ואיתות. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי כוח מכאני יכול לווסת הכרת אנטיגן על ידי ומפעילה של קולט T-cell (TCR). זה התאפשר על ידי טכנולוגיה חדשה שפיתחנו ובדיקת כוח biomembrane הקרינה termed (fBFP), המשלבת כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש בתאי דם אולטרה רך אנושיים אדומים כחיישן רגיש הכוח, טכניקות מעקב הדמיה מצלמה במהירות גבוהה וזמן אמת, fBFP הוא של ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 ננומטר ו~ 0.5 msec ב כוח, רזולוציה מרחב ובזמן. עם fBFP, אפשר למדוד בדיוק קינטיקה יחידה קולט ליגנד מחייבת לפי תקנת כוח וקאל תאיים בו זמנית תמונה מופעלת מחייבתcium איתות על תא חי בודד. טכנולוגיה חדשה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה אחרת קרום קולט ליגנד ואיתות בתאים אחרים לפי תקנה מכאנית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא אל תא ותא אל תאית מטריצת הידבקות (ECM) מתווכת על ידי מחייב בין קולטני תא שטח, חלבוני ECM, ו / או שומנים 1. כריכה מאפשרת לתאים כדי ליצור מבנים פונקציונליים 1, כמו גם להכיר, לתקשר, ומגיבים לסביבה 1-3. בניגוד לחלבונים מסיסים (למשל, ציטוקינים וגורמי גדילה) לאגד שמשלושה ממדים (3D) בשלב נוזל על קולטני תא השטח, קולטני הידבקות התא ליצור קשרים עם ligands שלהם על פני פער junctional צר לגשר שני משטחים מנוגדים המגבילים מולקולרי דיפוזיה בממשק שני ממדים (2D) 4-7. בניגוד לקינטיקה 3D הנמדדים בדרך כלל על ידי מבחני מסורתיים מחייבים (לדוגמא, תהודת plasmon פני השטח או SPR), יש לי קינ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר האנושי גאורגיה מכון טכנולוגי.

1. בידוד RBCs האדם, biotinylation וosmolarity התאמה

הערה: שלב 1.1 צריכה להתבצע על ידי איש מקצוע כגון אחות רפואית מיומן, עם מועצה לביקורת מוסדית אישרה פרוטוקול.

  1. להשיג 8-10 μl (טיפה אחת) של דם מאצבע זין ולהוסיף 1 מיליליטר של קרבונט / החיץ ביקרבונט (הטבלה 1 ו -2). בעדינות מערבולת או פי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת BFP הייתה חלוץ ידי המעבדה אוונס בשינה 1995 17. כלי picoforce זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי למדוד אינטראקציות של חלבונים משותקים על משטחים, כדי לנתח את קינטיקה דו-ממדית של מולקולות הדבקת אינטראקציה עם ligands 16,19,20, 30, למדוד גמישות מולקולרית 21,29, וכדי לקבוע קונפורמציה החלבון משתנה 21. לfBFP, סט נוסף של מכשירים הקשורים לעלית הקרינה עם מערכת התוכנה המתאימה (טבלת 1) מתווסף (איור 1 א - ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסוי מוצלח fBFP כרוך כמה שיקולים קריטיים. ראשית, לחישוב הכוח להיות אמין, micropipette, RBC, וחרוז הבדיקה צריך להיות מיושר כקרוב לקואקסיאלי ככל האפשר. ההשלכה של RBC בתוך פיפטה צריכה להיות על אחד קוטר פיפטה הבדיקה כך שהחיכוך בין RBC ופיפטה הוא זניח. לRBC האנושי טיפוסי, קוטר פיפטה האופטימלי הוא 2.0-2.4 מיקרומטר, אשר מניב הטוב ביותר בכושר של משוואת 1 17,30. שנית, על מנת להבטיח מדידות בassay כוח המהדק וassay תנודות התרמית הן בעיקר לקשרים יחידים, תדירות הידבקות של מתחת 20% י.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים הקשורים למאמר זה ולפיתוח טכנולוגיית fBFP במעבדת Zhu נתמכו על ידי מענקי NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 ו-TW008753. אנו מודים לאוון אוונס על המצאת הכלי הניסיוני המעצים הזה, ולחברי מעבדת אוונס, אנדרו לאונג, קוג'י קינושיטה, ווסלי וונג וקן הלבורסן, על שעזרו לנו לבנות את ה-BFP. אנו מודים גם לחברי מעבדת ג'ו אחרים, פאנג קונג, צ'נגהאו גה וקאיטאו לי, על עזרתם בפיתוח המכשור.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט (NaH2PO4 • H2O)Sigma-AldrichS9638הכנת מאגר פוספט
Anhy. נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907הכנת מאגר פוספט
נתרן פחמתי (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127הכנת בופר קרבונט/ביקרבונט
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761קרבונט/ביקרבונט הכנת חיץ
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ'S7653הכנת חיץ N2-5%
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ'P9541N2-5% הכנת חיץ
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5% הכנת חיץ
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389N2-5% הכנת חיץ
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1פונקציונליזציה של חרוזים
ביוטין-PEG3500-NHSJenKemA5026-1ביוטינילציה של RBC
ניסטטיןSigma-AldrichN6261התאמת אוסמולריות RBC
אמוניום הידרוקסיד (NH4OH)Sigma-AldrichA-6899חרוז זכוכית סילניזציה
מתנולBDH67-56-1סילאניזציה של חרוזי זכוכית
30% מי חמצן (H2O2)J. T. BarkerJan-86סילאניזציה של חרוזי זכוכית
חומצה אצטית (קרחון)Sigma-AldrichARK2183סילאניזציה של חרוזי זכוכית
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)Uct Specialties, LLC4420-74-0פונקציונאליות חרוזי זכוכית
בורוסיליקט חרוזי זכוכיתטכנולוגיית חלקיקים Distrilab9002פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
Streptavidin− MaleimideSigma-AldrichS9415פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
BSASigma-AldrichA0336ליגנד פונקציונליזציה
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201טעינת צבע סידן פלואורסצנטי תוך תאי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2650טעינת צבע סידן פלואורסצנטי תוך תאית
חרוזי Quantibrite PEBD Biosciences340495כימות צפיפות
זרימה ציטומטרBD BiosciencesBD LSR IIכימות צפיפות
צינור נימי 0.7-1.0 מ"מ x 30 אינץ'Kimble Chase46485-1מיקרופיפטה עושה
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםP-97מיקרופיפטה עושה
פיפטה מיקרו-כוחNarishigeMF-900מיקרופיפטה ייצור
שמן מינרליפישר מדעיBP2629-1מכלול תא
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתפישר מדעי12-544-Gמכלול תא
מיקרו-מזרקמכשירים מדויקים עולמייםMF34G-5מכלול תא
1 מ"ל מזרקBD מכלול תא309602
מחזיק מיקרופיפטהNarishigeHI-7מכלול תא
חלקים מכניים ומתאמים בעיצוב ביתי באמצעות עיבוד CNC. מכשיר ביופיזיקהכל החלקים מותאמים אישית על פי עיצובי ה-CAD.מערכת BFP
מיקרוסקופ (TiE הפוך)מערכת NikonMEA53100BFP
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 מ"מ, Spg)מצלמתמערכת Nikon MRH00401 BFP
, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3 אינץ' CCD, מונו-GraftekImaging02-2020Cמערכת BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3 אינץ', C-Mount, 1280 x 960, מונו., CCD, 12 סיביות ADCGraftek Imaging02-2185ABFP מערכת
בדיקה תת-מיקרונית ידנית עם שלט רחוק ברזולוציה גבוההמערכת Karl SussPH400BFP
שולחן נגד רעידות (5 'x 3')מערכת TMC77049089BFP
שלב תרגום ידני תלת מימדניופורט462-XYZ-M
תוכנת CAD תלת מימדיתשל SolidWorks SOLIDWORKS Corp.גרסה 2012 מערכת SP5BFP
תוכנת LabVIEWמכשירים לאומייםגרסה 2009מערכת BFP, תוכנית BFP
שלב תרגום פייזו תלת מימדPhysik InstrumenteM-105.3Pמערכת BFP
אקוטור פיזו ליניאריPhysik InstrumenteP-753.1CDמערכת BFP
Micromanagerגרסה 1.4מערכת fBFP, פלואורסצנטי תוכנית הדמיה
מצלמת כפולה (DC-2)מערכת פוטומטריה77054724fBFP
מסנן פליטת מצלמה כפולה (T565LPXR)פוטומטריהמערכת 77054725 fBFP
מצלמת פלואורסצנטיHamamatsuORCA-R2 C10600-10Bמערכת fBFP
סרט פרפין מפלסטיק (Parafilm)Bemis Company, IncPM996איטום בקבוקים
קרבונט/ בופר ביקרבונט (pH 8.5)8.4 גרם/ליטר נתרן פחמתי (Na2CO3), 10.6 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט (NaHCO3)
בופר פוספט (pH 6.5-6.8)27.6 גרם/ליטר NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H<תת>2O), 28.4 גרם/ליטר אנהי. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4)
N2-5% buffer (pH 7.2)20.77 גרם/ליטר אשלגן כלורי (KCl), 2.38 גרם/ליטר נתרן כלורי (NaCl), 0.13 גרם/ליטר אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4), 0.71 גרם/ליטר אנהי. נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4), 9.70 גרם/ליטר סוכרוז
מכשיר ייצור תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fluorescence Biomembrane Force ProbeReceptor ligand KineticsIntracellular Calcium SignalingSingle Cell AnalysisForce SpectroscopyFluorescence MicroscopyRed Blood Cell Force SensorT cell Receptor BindingMechanical Force RegulationMicro Pipette Manipulation

מאמרים קשורים