מאמר שיטה

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

DOI:

10.3791/52975

⸱

4 באוגוסט 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות קולט יגנד קרום לתווך רבים תפקודים תאיים. קינטיקה כריכה ואיתות במורד הזרם מופעלת על ידי אינטראקציות מולקולריות אלה צפויים מושפעות מהסביבה המכנית שבו מתקיים מחייב ואיתות. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי כוח מכאני יכול לווסת הכרת אנטיגן על ידי ומפעילה של קולט T-cell (TCR). זה התאפשר על ידי טכנולוגיה חדשה שפיתחנו ובדיקת כוח biomembrane הקרינה termed (fBFP), המשלבת כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש בתאי דם אולטרה רך אנושיים אדומים כחיישן רגיש הכוח, טכניקות מעקב הדמיה מצלמה במהירות גבוהה וזמן אמת, fBFP הוא של ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 ננומטר ו~ 0.5 msec ב כוח, רזולוציה מרחב ובזמן. עם fBFP, אפשר למדוד בדיוק קינטיקה יחידה קולט ליגנד מחייבת לפי תקנת כוח וקאל תאיים בו זמנית תמונה מופעלת מחייבתcium איתות על תא חי בודד. טכנולוגיה חדשה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה אחרת קרום קולט ליגנד ואיתות בתאים אחרים לפי תקנה מכאנית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא אל תא ותא אל תאית מטריצת הידבקות (ECM) מתווכת על ידי מחייב בין קולטני תא שטח, חלבוני ECM, ו / או שומנים 1. כריכה מאפשרת לתאים כדי ליצור מבנים פונקציונליים 1, כמו גם להכיר, לתקשר, ומגיבים לסביבה 1-3. בניגוד לחלבונים מסיסים (למשל, ציטוקינים וגורמי גדילה) לאגד שמשלושה ממדים (3D) בשלב נוזל על קולטני תא השטח, קולטני הידבקות התא ליצור קשרים עם ligands שלהם על פני פער junctional צר לגשר שני משטחים מנוגדים המגבילים מולקולרי דיפוזיה בממשק שני ממדים (2D) 4-7. בניגוד לקינטיקה 3D הנמדדים בדרך כלל על ידי מבחני מסורתיים מחייבים (לדוגמא, תהודת plasmon פני השטח או SPR), יש לי קינטיקה 2D ל לכמת עם טכניקות מיוחדות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 8-10, תא זרימת 11,12, micropipette 13,14, אופטיפינצטה 15 ובדיקת כוח biomembrane (BFP) 16-21.

יותר מאשר רק לספק הצמדה פיזית ללכידות סלולריות, מולקולות הידבקות הן מרכיב עיקרי במכונות האיתות לתא כדי לתקשר עם סביבתו. יש כבר התעניינות גוברת בהבנה כיצד אירוסין יגנד של מולקולות הדבקה יוזם איתות וכיצד האות הראשונית transduced בתוך התא תאיים. באופן אינטואיטיבי, מאפיינים של קולט ליגנד מחייב יכול להשפיע על האותות שהיא גורמת. עם זאת, קשה לנתח יחסים מכניסטית בין האינטראקציה תאית ואירועי איתות תאיים באמצעות הרכב מסורתי של מבחני ביוכימיים בגלל המגבלות שלהם רבות, לדוגמא, רזולוציה של זמן עני וחוסר ברזולוציה מרחבית המלא. קיימים שיטות שתאפשרנה לשני (קולטן ליגנד 2D מחייב קינטיקה) biophysical ותצפיות ביוכימי (איתות) בשידור חיתאים כוללים מצעים של קשיחות מתכונן 22, מערכי עמוד אלסטומר 23 והתקני תא זרימה / microfluidic משולבים עם יכולת הקרינה 24-26. עם זאת, קריאות של איתות והקולט ליגנד המחייב יש לקבל בנפרד (לרוב על ידי שיטות שונות), ולכן קשה לנתח את יחסי זמן ומרחב של מאפייני קשר עם אירועי איתות.

BFP הקונבנציונלי הוא ספקטרוסקופיה כוח רגישה עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal 17. היא משתמשת בתא גמיש דם אדום (RBC) כחיישן כוח, המאפשרת מדידה של קינטיקה מולקולה בודדת 2D, תכונות מכאניות ושינויי קונפורמציה 14,16,19-21,27-29. BFP מבוסס הדמיה ניאון (fBFP) קורלציה קינטיקה מחייבת קולט ליגנד עם איתות התא-מופעל מחייב בקנה מידת מולקולה בודדת. עם ההגדרה הזאת, בפעילויות איתות תא אתר בהקשר של mechani המשטחגירוי קאל נצפה בתאי T 27. FBFP הוא תכליתי ויכול לשמש למחקרים של הידבקות תא ואיתות בתיווכו של מולקולות אחרות בתאים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר האנושי גאורגיה מכון טכנולוגי.

1. בידוד RBCs האדם, biotinylation וosmolarity התאמה

הערה: שלב 1.1 צריכה להתבצע על ידי איש מקצוע כגון אחות רפואית מיומן, עם מועצה לביקורת מוסדית אישרה פרוטוקול.

  1. להשיג 8-10 μl (טיפה אחת) של דם מאצבע זין ולהוסיף 1 מיליליטר של קרבונט / החיץ ביקרבונט (הטבלה 1 ו -2). בעדינות מערבולת או פיפטה התערובת ו צנטריפוגות 1 דקות ב 900 x גרם. בטל supernatant ולשטוף פעם נוספת.
  2. בכוס קטנה שוקל 3.5-4 מ"ג של מקשר יוטין-PEG3500-NHS (טבלת 1). לפזר אותו בקרבונט / החיץ ביקרבונט לעשות מ"ג / מיליליטר הריכוז הסופי 3.
  3. מערבבים 171 μl של קרבונט / חיץ ביקרבונט, 10 μl של חבילת RBC ו1,049 μl שלביוטין-PEG3500-NHS פתרון מקשר ולדגור על RT למשך 30 דקות. שטוף את RBC פעם אחת עם קרבונט / חיץ ביקרבונט ולאחר מכן פעמיים עם חיץ N2-5% (טבלת 1 ו -2).
  4. בינתיים, למקם את בקבוק מקשר עם כובע רופף בייבוש ואקום זכוכית מלא desiccants בתחתית והוואקום במשך 5 דקות, ולמלא את הייבוש עם ארגון. להדק את הכובע ולקחת את הבקבוק. לאטום את הבקבוק עם סרט פרפין פלסטיק (טבלת 1), למקם אותו לתוך מיכל המלא בdesiccants בתחתית והחנות ב-20 ° C.
    הערה: הצעדים שכרוכים בשימוש במקשר יוטין-PEG3500-NHS, כולל 1.2-1.4 (פרט לדגירה ולשטוף ב1.3), צריכה להתבצע מהר ככל האפשר.
  5. לדלל nystatin לN2-5 חיץ% לעשות ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם / מיליליטר. לערבב 5 μl של RBC biotinylated עם 71.4 μl של nystatin (טבלת 1) פתרון דגירה במשך שעה 1 ב0 ו# 176; ג. לשטוף פעמיים עם חיץ N2-5% וחנות עם N2-5 חיץ% BSA + 0.5% (טבלת 1) במקרר (4 מעלות צלזיוס).

2. זכוכית ביד Silanization

  1. ניקוי של פני שטח ביד
    1. שוקל 50 מ"ג של אבקת חרוזי זכוכית ומחדש להשעות אותם ב 500 μl מים DI.
    2. מערבבים 0.5 מיליליטר של 30% H 2 O 2 (טבלה 1) עם 9.5 מיליליטר של מים די בכוס 50 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של 4 OH NH מרוכז (טבלת 1) ולהביא את הפתרון הזה לדוד על צלחת חמה .
    3. הוסף את חרוזי זכוכית לפתרון הרתיחה וממשיך להרתיח במשך 5 דקות נוספות. מערבולת בעדינות את הפתרון כל דקות.
    4. לאחר הרתיחה, להעביר ~ 5 מיליליטר של השעיה חרוז חמה זה לתוך צינור 15 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות ועליון עם מים RT DI. צנטריפוגה ב 3500 XG במשך 5 דקות, להסיר ולסלק supernatant.
    5. העבר 5 מיליליטר נוסף של השעיה חרוז חמה ולהוסיף לחרוזים שטפו, ראש עם יותר מים DI, מערבב היטב, וצנטריפוגות שוב. חזור על תהליך זה עד כ -50 מיליליטר המים DI משמש, אשר יהיו כולל של 4 עד 5 פעמים בכביסה.
    6. מעבירים את ההשעיה חרוז לתוך בקבוקון 1 מיליליטר. שטיפת חרוזים עם מתנול (טבלת 1) על ידי צנטריפוגה ב17,000 XG במשך 5 דקות במשך 3 פעמים, ולבסוף חוזר מחדש להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של 100% מתנול.
  2. משטח חרוז Thiolation
    1. לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להוסיף 45.6 מיליליטר של מתנול, 0.4 מיליליטר של חומצה אצטית (טבלת 1), 1.85 מיליליטר של מים DI, 1.15 מיליליטר של 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (טבלת 1) ו -1 מיליליטר חרוזים השעיה ערוכים 2.1, אז לדגור על RT עבור 3 שעות.
    2. לאחר התגובה, להסיר את כל המגיבים על ידי שטיפת פעם אחת עם מתנול הטרי, ומחדש להשעות את חרוזים לתוך 500 μl של מתנול. באופן שווה לחלק השעיה חרוז זכוכית מרוכזת זה לסט של 20 בקבוקוני זכוכית יבשים ונקיים עםפקקי הברגה. להתנדף ממתנול באמצעות סילון של ארגון יבש ולסובב לאט את הבקבוקונים כדי להפוך את השכבה דקה של חרוזים יבשים בצדדים של כל בקבוקון.
    3. מניחים את הבקבוקונים של חרוזים לתנור מחומם מראש ייבוש ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להוציא ובמהירות למקם את הכובע (ים) באופן רופף על. מניחים את הבקבוקונים בייבוש ואקום זכוכית מלאים desiccants בתחתית וואקום הייבוש עם משאבת ואקום עד מקוררת.
    4. לטהר את הייבוש בשואב אבק עם ארגון יבש להביא הייבוש ללחץ האטמוספרי רגיל. הסר את מכסה תא ייבוש ומחדש במהירות להדק את הכובע (ים) על הבקבוקון. לאטום את צלוחיות עם סרט פרפין פלסטיק ולאחסן אותם בRT בתיבת אחסון חשוך ויבשה.
    5. על שימוש מיידי, לקחת בקבוקון אחד של חרוזים יבשים ולשטוף פעם עם חיץ פוספט (לוחות 1 ו -2), מחדש להשעות לתוך 50 μl של חיץ וחנות פוספט ב 4 מעלות צלזיוס. הכנת חרוז מרוכזת זה תיקרא לכ" חרוזים MPTMS "בשלבים הבאים.
      הערה: עם אחסון נאות, חרוזים MPTMS יכולים להישאר פונקציונליים לעד שלושה חודשים.

3. חרוז Functionalization

  1. קוולנטית ציפוי חלבונים בחרוזים
    1. קח נפח מסוים (למשל, μl 2.5) של מניית החלבון ולערבב עם נפח שווה של קרבונט / חיץ ביקרבונט לעשות פתרון 1.
      הערה: הנפח תלוי בריכוז המניות וצפיפות האתר הסופי הרצויה של החלבון על פני השטח חרוזים.
    2. בכוס קטנה שוקל 2-3 מ"ג מקשר MAL-PEG3500-NHS (טבלת 1) ולפזר אותו עם קרבונט / חיץ ביקרבונט להגיע ריכוז סופי של .231 מ"ג / מיליליטר.
    3. לערבב 1 פתרון עם נפח שווה של פתרון מקשר מוכן ב3.1.2. דגירה את התערובת על RT למשך 30 דקות כדי להפוך את הפתרון 2.
    4. בינתיים, למקם את בקבוק מקשר עם כובע רופף בF ייבוש ואקום זכוכיתilled עם desiccants בתחתית והוואקום במשך 5 דקות, ולמלא את הייבוש עם ארגון. להדק את הכובע ולקחת את הבקבוק. לאטום את הבקבוק עם סרט פרפין פלסטיק, למקם אותו לתוך מיכל המלא בdesiccants בתחתית והחנות ב-20 ° C.
      הערה: הצעדים שכרוכים בשימוש במקשר MAL-PEG3500-NHS, כולל 3.1.2-3.1.4 (פרט לדגירה ב3.1.3), צריך להיות מושלם מהר ככל האפשר.
    5. לערבב 5 μl של חרוזים MPTMS עם פתרון 2 ולהוסיף למאגר פוספט (טבלה 1) כדי להפוך את נפח סופי של 250 μl.
    6. דגירה חרוזים הלילה בשעה RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ומחדש להשעות לשל חיץ וחנות פוספט 100 μl על 4 מעלות צלזיוס.
  2. חלבון הכנת חרוזים / streptavidin (SA) מצופים
    1. עקוב פרוטוקול 3.1.1-3.1.4.
    2. לערבב 5 μl של חרוזים MPTMS עם פתרון 2 ו -5 μl של 4 מ"ג / מיליליטר streptavidin-Maleimide (SA-MAL) (טבלת 1פתרון) ולאחר מכן להוסיף למאגר פוספט לעשות נפח סופי של 250 μl.
    3. דגירה חרוזים הלילה בשעה RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ולבסוף מחדש להשעות לשל חיץ וחנות פוספט 100 μl על 4 מעלות צלזיוס.
  3. ציפוי streptavidin על חרוזי זכוכית
    1. לערבב 5 μl של חרוזים MPTMS עם 5 μl של 4 מ"ג פתרון / מיליליטר SA ולהוסיף 140 μl של חיץ פוספט.
    2. דגירה חרוזים הלילה בשעה RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ומחדש להשעות לתוך 50 μl של חיץ וחנות פוספט ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. ציפוי חרוזים SA מצופה עם חלבון Biotinylated
    1. לערבב 5 μl של חרוזים SA מצופים בחלבון (נפח בהתאם לצפיפות הציפוי הרצויה) ולהוסיף למאגר פוספט לעשות הנפח הסופי להיות 100 μl.
    2. דגירה את תערובת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס או במשך 3 שעות ב RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ומחדש להשעות לתוך 50 ph μlosphate חיץ ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

4. תא הכנה

הערה: כדי לטהר את התאים, בצע את פרוטוקולי טיהור תא סטנדרטיים המתאימים לסוג של תאים בשימוש, למשל תאי T 27 או שורות תאים מסוימות 21,29.

  1. לניסויי fBFP, פעם ההשעיה התא מוכנה, להוסיף Fura2-AM (טבלת 1) מומס DMSO להשעית התא להגיע לריכוז סופי של 2 מיקרומטר, דגירה במשך 30 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף פעם אחת. שמור השעיה תא טעון fluorescently זה בחושך עד לשימוש.

5. הכנה לMicropipettes ולשכה סלולארי

  1. הכנת Micropipettes
    1. צינורות לחתוך נימי זכוכית ארוכות (טבלה 1) עם חותך זכוכית לחתיכות קצרות של כ 3 אינץ 'באורך. חתיכת הר אחד על חולץ micropipette (טבלת 1), לחץ על "משוך" אבלטון, כך שאמצע הנימים יהיה מחומם על ידי המכונה והנימים תהיה משך בשני הקצוות כדי להפוך את שתי נימים עם טיפים חדים (micropipettes גלם).
      הערה: על ידי ביצוע הנחיות המוצר, המורפולוגיה הרצויה של פיפטה הגלם יש 6-8 להתחדד מ"מ ו.1-.5 מיקרומטר קצה.
    2. הר פיפטה גלם על בעל פיפטה של פורג micropipette (טבלת 1). חום כדי להמס את כדור הזכוכית בכבשן. הכנס את הקצה של פיפטה הגלם בתוך כדור הזכוכית. להתקרר כדור הזכוכית ולמשוך את פיפטה הגלם לשבור אותו מבחוץ ולהשאיר טיפ שלה בתוך המרחב. חזור על תהליך זה עד פתח הקצה הרצוי מתקבל.
      הערה: דוגמאות לקוטר פנימי קצה micropipette: 2.0-2.4 מיקרומטר לRBC, ~ 1.5 מיקרומטר לחרוז, ~ 2-4 מיקרומטר לתא T ו-7 מיקרומטר לתא hybridoma.
  2. בניית הלשכה סלולארי
    הערה: תא התא בנוי על הבסיס של מטורף-ביתבעל דואר קאמרי, אשר מורכב משני חלקים של ריבועי מתכת (נחושת / אלומיניום) וידית המקשרת אותם יחד (1D איור).
  3. לחתוך coverslip x 22 מ"מ x 0.2 מ"מ 40 מ"מ באמצעות חותך זכוכית לשני חלקי 40 מ"מ x 11 מ"מ x 0.2 מ"מ (coverslip 1 ו -2). coverslip דבק 1 על ידי גריז לצד העליון של בעל התא באופן שבו מגשר בין שני ריבועי המתכת, ובאופן דומה coverslip דבק 2 לצד התחתון, אשר יהווה תא תא מקביל coverslip (1D איור).
  4. השתמש פיפטה להזריק 200 μl של חיץ ניסיוני בין שני coverslips. ודא החיץ מייחס לשני coverslips. בעדינות לסובב ולנער את התא כדי לאפשר לחיץ לגעת בשני הקצוות של החדר.
  5. להזריק בזהירות שמן מינרלים לשני הצדדים של חדר איגוף אזור החיץ הניסיוני ובכך חתם את החיץ מהאוויר הפתוח. הזרק השעיות של חרוזים בדיקה (לדוגמא, חרוזים מצופים pMHC), תאי דם אדומים ומטרות(לדוגמא, תאי T) באזורים העליונים, אמצעי ותחתונים של אזור חיץ בהתאמה.

6. ניסוי BFP

figure-protocol-1
תמונת סקירה של מערכת חומרת fBFP הרכבה fBFP (): איור 1.. ציור סכמטי של מערכת חומרת fBFP (B). המערכת הכפולה-פקה "DC2" (כתום) על שהמצלמה במהירות גבוהה (הכחולה) ומצלמה הקרינה (לבן) היו רכובים (C). הבמה מיקרוסקופ שמתאים את עצמו תא ניסוי ושלוש מערכות המניפולציה micropipette (ד '). (E ו- F) micrographs של הגדרת BFP בתא ניסוי. (R הנמוך (E) Micropipettes הרכבה מראה פיפטה הבדיקה (משמאל), פיפטה היעד (ימנית עליון) ופיפטה עוזרight). מיקום חרוז (F) Probe. חרוז בדיקה היה שהופעל על ידי פיפטה עוזר ומחובר לשיא RBC ליצירת בדיקה כוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הפעל מיקרוסקופ (טבלת 1) ומקור אור. מניחים את החדר לבמה מיקרוסקופ העיקרי (איור 1 א, ד).
  2. התקן את כל שלושת micropipettes של BFP (1D איור משמאל:. בדיקה, כדי לתפוס RBC, מימין: יעד, כדי לתפוס את תא או חרוז, ימין למטה: עוזר, כדי לתפוס את חרוז).
    1. השתמש מיקרו הזרקה (טבלה 1) למילוי micropipette עם חיץ ניסיוני. קח את בעל פיפטה (טבלת 1) ולהחזיק אותו במקום נמוך יותר כדי לאפשר לטפטוף מים מהקצה. במהירות להכניס את micropipette לתוך קצה בעל ולוודא שאין בועות אוויר נכנס micropipetteבמהלך ההכנסה. הדק את בורג בעל.
    2. הר כל בעל פיפטה על מיקרו-מניפולטור המקביל שלה. לדחוף את micropipette לקראת קאמרי כך שהעצות שלהם להיכנס לאזור החיץ קאמרי. להתאים את המיקום של micropipette ולמצוא אותם תחת מיקרוסקופ שדה ראייה.
  3. לנוע שלב קאמרי בעל כדי למצוא את המושבות של שלושה אלמנטים (RBCs, מטרות וחרוזי בדיקה) אחד על אחד. להתאים את המיקום של micropipette המקביל על ידי סיבוב הכפתורים של מניפולטורים לתת טיפ של תא אחד / חרוז גישת micropipette. לשאוב את התא / חרוז על ידי התאמת הלחץ בתוך micropipette המקביל. כל שלושה micropipettes יהיה ללכוד האלמנטים המקביל שלהם.
  4. לנוע שלב קאמרי בעל למצוא שטח פתוח הרחק מהמושבות של האלמנטים שהוחדרו בי הניסוי יבוצע. לעבור את המצב החזותי מיקרוסקופ כדי להמחיש את התמונה על compתכנית uter על מסך המחשב. להעביר את כל שלושת אלמנטים על הטיפים פיפטה לתוך שדה הראייה של התכנית.
  5. יישר את חרוז הבדיקה וRBC, ולתמרן את חרוז הבדיקה לשיא של RBC בזהירות, בקצרה לפגוע חרוז על RBC ועדינות לחזור. התאם את הלחץ של micropipette עוזר לפוצץ בעדינות חרוז משם, כך שהוא יישאר דבוק על RBC השיא (איור 1F). להתרחק micropipette העוזר וליישר את היעד וחרוז בדיקה (איור 2 א).

figure-protocol-2
איור 2:. תכנית BFP ומחזור הבדיקה שלה () וידאו-מיקרוסקופ מתאר בדיקה כוח (משמאל) ויעד תא T (מימין) להישאף על ידי החללית שלהם בהתאמה pipettes.The הנייחת כוח מורכב של RBC נפוח ומצורף חרוז נושאות יגנד. קולט נושאותT-cell (יעד) הוא רכוב על piezotranslator מיושר הפוך לבדיקה. ההחזר על ההשקעה מצויינים בירוק. גשש הקצה מסומן בקו כחול. הכנס מתאר את יגנד (pMHC, צד חרוז) וקולט (TCR, צד T-cell) זוג על שני המשטחים המנוגדים באזור המסומן בכתום. פרופיל עוצמת קצה חרוז ב( א) (ב). אזור ROI ב-direction x הוא להתוות כx -axis (במספר הפיקסלים) ועוצמת האור (בערך סולם אפור) בממוצע על ידי binning 30 פיקסלים לאורך -direction y. (ג) הסטייה של RBC ואת עמדתו של חרוז והיעד (T-cell) במחזור בדיקה של assay כוח המהדק. קווים מקווקווים האנכיים ואופקיים לציין את מיקום אפס הכוח של קודקוד RBC וכמובן הזמן, בהתאמה. גשש קו קצה עיוות RBC מוצג בכחול בכל לוח. אותו עדיין פחות צעדים שאומצו בתדירות הידבקותassay (שחסר את הצעדים של "מהדק" ו- "לנתק") וassay תנודות תרמית (שחסר את הצעד של "לנתק").

  1. בתכנית, בחלון שדה הראייה להשתמש בכלים בתכנית כדי למדוד את רדיוס בהתאמה של micropipette הבדיקה (עמ 'R), RBC (R 0), שטח המגע העגול בין RBC וחרוז בדיקה (ג R) , המאפשר ההערכה של קבוע הקפיץ של RBC (k) על ידי המשוואה הבאה 17,30,
    figure-protocol-3

    כאשר p Δ הוא לחץ השאיפה בקצה פיפטה הבדיקה.

    הערה: נובע מהחוק של הוק שהכח המחייב, F, ניתן לכמת על ידי המוצר של קבוע קפיץ ועקירה של חרוז הבדיקה (ד), כלומר, F = ד (איור 2 ג).
  2. הזן את קבוע קפיץ RBC הרצוי לתכנית (עיין סעיף פרוטוקול 6.6. קבוע הקפיץ מוגדר בדרך כלל ברמה של 0.25 או 0.3 PN / ננומטר עבור assay assay תדירות כוח המהדק וההידבקות וPN 0.1 / ננומטר עבור assay התנודות התרמי) , שיחזור לחץ שאיפה נדרשת ביחידה של סנטימטר של מים. התאם את הגובה של מיכל המים שמקשר לפיפטה של ​​החללית עד שיגיע ללחץ aspirating הנדרש.
  3. צייר קו אופקי על פני שיא RBC, אשר יניב עקומה בחלון הסמוך המציין את הבהירות (ערך סולם אפור) של כל פיקסל לאורך הקו הזה. גרור את קו הסף להיות כבמחצית העומק של העקומה (איור 2 א, ב).
    הערה: נקודת המינימום על עקומת הבהירות מתחת לקו הסף מציינת את המיקום של גבול חרוז, ובכך מינימום מקומי רק אחת מותר. אם שניים או מינימום מקומי יותר נמצאים בהווה, זהמציין את התמונה היא לא אופטימלית (כנראה עקב היותו מחוץ לפוקוס התמונה, או יישור לקוי בין חרוז הבדיקה וRBC).
  4. בחר את המצב הרצוי ניסוי: assay תנודות תרמיות, assay תדירות הידבקות או assay כוח מהדק. הגדר את הפרמטרים כרצויים (למשל, = שניות כוח הפגיעה = 15 PN, שיעור טעינה = 1,000 / s PN, זמן מגע 1, מהדק כוח = 20 PN (עבור assay מהדק כוח), וכו ').
    1. לחץ על "התחל", המאפשר לתכנית להעביר את פיפטה היעד ולנסוע ליעד ובמתוך קשר עם החללית (ראה סעיף נציג תוצאות לפרטים נוספים). איסוף הנתונים יבוצע במקביל, אשר מתעד את המיקום של חרוז הבדיקה בזמן אמת. לעצור את התכנית על ידי לחיצה על הכפתור "הניסוי עצור", בו בזמן חלון יקפוץ החוצה כדי לאפשר לשמור את הנתונים שנרכשו.

7. הקרינה BFP ניסוי (fBFP)

  1. כדי להשתמש בfluoreפונקצית סצנה של מערכת BFP, להפעיל את מקור אור העירור (טבלת 1) והמצלמה הקרינה (טבלת 1), אשר נשלטים על ידי תכנית נפרדת (טבלה 1). בתכנית, בחר את הפרמטרים להדמית הקרינה, כוללים רווח, חשיפה, ערוצי עירור (במקרה זה, 340 ננומטר ו 380 ננומטר אור), וכו '. בצע את כל ההכנות בפרוטוקול ניסוי BFP, כולל יישור הבדיקה והיעד, אשר יאפשר להדמיה של תמונת הניאון חי תא המטרה נרגשת 340 ננומטר או 380 ננומטר עירור אור.
  2. השתמש בכלי חתך בערך סעיף התחום שבו התא יישאר במהלך כל תקופת ההקלטה.
    הערה: בשל השימוש של מחזור גישת מגע-נסיגה, התא יהיה לנוע קדימה ואחורה שוב ושוב, ובכך האזור מחולק הוא הרבה יותר גדול מהתא עצמו.
  3. לחץ על "שיא" כדי לאפשר 340 ננומטרד 380 ננומטר אור לרגש לסירוגין הצבע תאיים הקרינה (Fura2), וזוג מתאים תמונות הקרינה יירשם לסירוגין אחת לשנייה. במקביל לחץ על "התחל" בתכנית להתחיל את ניסוי BFP לאינטראקציה מולקולרית ניתוח והניסוי ההדמיה הקרינה לעקוב אחר איתות סידן תוך תאי. המערכת תפיק קובץ נתונים גולמי לקולטן ליגנד המחייב (ראה איור 6 א להלן) וסדרה של תמונות ניאון בפורמט .tiff לאותות סידן.

ניתוח נתונים 8.

  1. ניתוח נתונים BFP
    1. ניתוח נתונים עבור assay תדירות הידבקות
      1. רצף לבדוק אות של כל מחזור "כוח לעומת זמן" ופשוט להקליט שמחזורים להכיל אירוע הידבקות ואילו לא, ולסכם להניב תדירות הידבקות ממוצעת.
      2. לאסוף כוח הקרע של כל אירוע הידבקות, שהוא ערך השיא של הכוח באופן ליניארי ramped לפני קשר קרע. לאחר איסוף כמות מספקת של כוחות הקרע במגוון של שיעורי רמפה, לגזור את חלוקת כוח קרע בכל שיעור רמפה שממנו הכוח תלוי מחוץ לשיעור של ניתוק קולט יגנד נגזר באמצעות ניתוח ספקטרוסקופיה כוח דינמי 18,31.
    2. ניתוח נתונים עבור assay תנודות תרמית
      1. רצף לבדוק את אות שלב ההידוק של כל מחזור, שסביר להניח מכיל אירועי אג"ח עמותה וניתוק מרובים. השתמש ברמת שלב הידוק תרמית התנודות (סטיית התקן הממוצעת של מרווח הזזה של 70 נקודות זמן רציפות של עמדת חרוז) ב" הכוח לעומת זמן "אות כמדריך להבחין אירועי אג"ח עמותה וניתוק, מאז קשר היווצרות מתאימה לירידה בתנודתיות התרמית.
      2. לייעד את המרווח מהאג"ח מיידי של דיסוציאציה (כאשר יסתנודות mal קורות חיים לרמה נורמלית) למיידיים של היווצרות הקשר הבאה כזמן המתנה, ולייעד את משך הקשר מהקשר שלה לניתוק כקשר לכל החיים, ששניהם שנאספו במהלך בדיקת נתונים. לחשב את זמן ההמתנה הממוצע וממוצע קשר לכל החיים, שבהתאמה משקפת את הגומלין של שיעור ובכי חוץ-שיעור מתחת לאפס-כוח 16,30.
    3. ניתוח נתונים עבור assay כוח המהדק
      1. פרמטרים תיעוד של כל אירועי החיים כוללים כוח הממוצע ואג"ח חיים עם מספר הרצף, כמו גם את זמן ההתחלה וזמן הסיום, אשר יאפשר אחד לצייר עקומת חיים מצטברת (למשל, איור 6 ג, עקומה צהובה).
      2. לאסוף כמות מספקת של אירועי חיים תחת מגוון של כוחות. קבוצתם לפחי כוח שונים, אשר תפיק חיים ממוצע בכל סל כוח, ולגמרי להניב "חיים ממוצע לעומת. עקומת כוח "(איור 4).
  2. ניתוח ההדמיה נתוני הקרינה סידן
    1. התאם את עוצמת הסף עד תמונות הקרינה להראות קווי המתאר ברורים של התא בשני ערוצי 340 ננומטר ו 380 ננומטר ללא רעשי רקע (איור 5 א ', ב'). לאחר מכן תסקור את מסגרת אות Ca 2 + תאית על ידי מסגרת עם מציין את רמת האינטנסיביות (איור 6) פסאודו-צבע, אשר נגזר על בסיס יחס העצמה של 340 ננומטר / 380 ננומטר, כדי ליצור "עוצמת Ca 2 + מנורמלת לעומת . עקומת זמן "(איור 6 ג). השתמש בתמונות הקרינה פסאודו-צבע כדי לייצר סרט המציג את רמת הקרינה שנייה על ידי שני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת BFP הייתה חלוץ ידי המעבדה אוונס בשינה 1995 17. כלי picoforce זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי למדוד אינטראקציות של חלבונים משותקים על משטחים, כדי לנתח את קינטיקה דו-ממדית של מולקולות הדבקת אינטראקציה עם ligands 16,19,20, 30, למדוד גמישות מולקולרית 21,29, וכדי לקבוע קונפורמציה החלבון משתנה 21. לfBFP, סט נוסף של מכשירים הקשורים לעלית הקרינה עם מערכת התוכנה המתאימה (טבלת 1) מתווסף (איור 1 א - ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסוי מוצלח fBFP כרוך כמה שיקולים קריטיים. ראשית, לחישוב הכוח להיות אמין, micropipette, RBC, וחרוז הבדיקה צריך להיות מיושר כקרוב לקואקסיאלי ככל האפשר. ההשלכה של RBC בתוך פיפטה צריכה להיות על אחד קוטר פיפטה הבדיקה כך שהחיכוך בין RBC ופיפטה הוא זניח. לRBC האנושי טיפוסי, קוטר פיפטה האופטימלי הוא 2.0-2.4 מיקרומטר, אשר מניב הטוב ביותר בכושר של משוואת 1 17,30. שנית, על מנת להבטיח מדידות בassay כוח המהדק וassay תנודות התרמית הן בעיקר לקשרים יחידים, תדירות הידבקות של מתחת 20% י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים הקשורים למאמר זה ולפיתוח טכנולוגיית fBFP במעבדת Zhu נתמכו על ידי מענקי NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 ו-TW008753. אנו מודים לאוון אוונס על המצאת הכלי הניסיוני המעצים הזה, ולחברי מעבדת אוונס, אנדרו לאונג, קוג'י קינושיטה, ווסלי וונג וקן הלבורסן, על שעזרו לנו לבנות את ה-BFP. אנו מודים גם לחברי מעבדת ג'ו אחרים, פאנג קונג, צ'נגהאו גה וקאיטאו לי, על עזרתם בפיתוח המכשור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט (NaH2PO4 • H2O)Sigma-AldrichS9638הכנת מאגר פוספט
Anhy. נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907הכנת מאגר פוספט
נתרן פחמתי (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127הכנת בופר קרבונט/ביקרבונט
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761קרבונט/ביקרבונט הכנת חיץ
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ'S7653הכנת חיץ N2-5%
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ'P9541N2-5% הכנת חיץ
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5% הכנת חיץ
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389N2-5% הכנת חיץ
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1פונקציונליזציה של חרוזים
ביוטין-PEG3500-NHSJenKemA5026-1ביוטינילציה של RBC
ניסטטיןSigma-AldrichN6261התאמת אוסמולריות RBC
אמוניום הידרוקסיד (NH4OH)Sigma-AldrichA-6899חרוז זכוכית סילניזציה
מתנולBDH67-56-1סילאניזציה של חרוזי זכוכית
30% מי חמצן (H2O2)J. T. BarkerJan-86סילאניזציה של חרוזי זכוכית
חומצה אצטית (קרחון)Sigma-AldrichARK2183סילאניזציה של חרוזי זכוכית
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)Uct Specialties, LLC4420-74-0פונקציונאליות חרוזי זכוכית
בורוסיליקט חרוזי זכוכיתטכנולוגיית חלקיקים Distrilab9002פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
Streptavidin− MaleimideSigma-AldrichS9415פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
BSASigma-AldrichA0336ליגנד פונקציונליזציה
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201טעינת צבע סידן פלואורסצנטי תוך תאי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2650טעינת צבע סידן פלואורסצנטי תוך תאית
חרוזי Quantibrite PEBD Biosciences340495כימות צפיפות
זרימה ציטומטרBD BiosciencesBD LSR IIכימות צפיפות
צינור נימי 0.7-1.0 מ"מ x 30 אינץ'Kimble Chase46485-1מיקרופיפטה עושה
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםP-97מיקרופיפטה עושה
פיפטה מיקרו-כוחNarishigeMF-900מיקרופיפטה ייצור
שמן מינרליפישר מדעיBP2629-1מכלול תא
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתפישר מדעי12-544-Gמכלול תא
מיקרו-מזרקמכשירים מדויקים עולמייםMF34G-5מכלול תא
1 מ"ל מזרקBD מכלול תא309602
מחזיק מיקרופיפטהNarishigeHI-7מכלול תא
חלקים מכניים ומתאמים בעיצוב ביתי באמצעות עיבוד CNC. מכשיר ביופיזיקהכל החלקים מותאמים אישית על פי עיצובי ה-CAD.מערכת BFP
מיקרוסקופ (TiE הפוך)מערכת NikonMEA53100BFP
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 מ"מ, Spg)מצלמתמערכת Nikon MRH00401 BFP
, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3 אינץ' CCD, מונו-GraftekImaging02-2020Cמערכת BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3 אינץ', C-Mount, 1280 x 960, מונו., CCD, 12 סיביות ADCGraftek Imaging02-2185ABFP מערכת
בדיקה תת-מיקרונית ידנית עם שלט רחוק ברזולוציה גבוההמערכת Karl SussPH400BFP
שולחן נגד רעידות (5 'x 3')מערכת TMC77049089BFP
שלב תרגום ידני תלת מימדניופורט462-XYZ-M
תוכנת CAD תלת מימדיתשל SolidWorks SOLIDWORKS Corp.גרסה 2012 מערכת SP5BFP
תוכנת LabVIEWמכשירים לאומייםגרסה 2009מערכת BFP, תוכנית BFP
שלב תרגום פייזו תלת מימדPhysik InstrumenteM-105.3Pמערכת BFP
אקוטור פיזו ליניאריPhysik InstrumenteP-753.1CDמערכת BFP
Micromanagerגרסה 1.4מערכת fBFP, פלואורסצנטי תוכנית הדמיה
מצלמת כפולה (DC-2)מערכת פוטומטריה77054724fBFP
מסנן פליטת מצלמה כפולה (T565LPXR)פוטומטריהמערכת 77054725 fBFP
מצלמת פלואורסצנטיHamamatsuORCA-R2 C10600-10Bמערכת fBFP
סרט פרפין מפלסטיק (Parafilm)Bemis Company, IncPM996איטום בקבוקים
קרבונט/ בופר ביקרבונט (pH 8.5)8.4 גרם/ליטר נתרן פחמתי (Na2CO3), 10.6 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט (NaHCO3)
בופר פוספט (pH 6.5-6.8)27.6 גרם/ליטר NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H<תת>2O), 28.4 גרם/ליטר אנהי. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4)
N2-5% buffer (pH 7.2)20.77 גרם/ליטר אשלגן כלורי (KCl), 2.38 גרם/ליטר נתרן כלורי (NaCl), 0.13 גרם/ליטר אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4), 0.71 גרם/ליטר אנהי. נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4), 9.70 גרם/ליטר סוכרוז
מכשיר ייצור תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  3. Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
  4. Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86(2012).
  5. Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
  6. Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
  7. Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005(2012).
  8. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  9. Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
  10. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
  11. Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
  12. Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
  13. Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
  14. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
  15. Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
  16. Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
  17. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
  18. Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
  19. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
  20. Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
  21. Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
  22. Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
  23. Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
  24. Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
  25. Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
  26. Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157(2012).
  27. Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
  28. Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
  29. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886(2014).
  30. Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
  31. Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
  32. Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fluorescence Biomembrane Force ProbeReceptor ligand KineticsIntracellular Calcium SignalingSingle Cell AnalysisForce SpectroscopyFluorescence MicroscopyRed Blood Cell Force SensorT cell Receptor BindingMechanical Force RegulationMicro Pipette Manipulation

מאמרים קשורים