מאמר שיטה

Microdialysis Probe עיצוב מותאם אישית

DOI:

10.3791/53048

⸱

21 ביולי 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות נמצאות בdemand.In הגדול עבודה זו הרכבה בדיקה הוא הסבירה בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות יש ביקוש גדול לעקוב אחר שינויים פיסיולוגיים, תרופתיים ופתולוגיים בנוזל השדרתי. למרבה הצער, בדיקות מסחריות יקרות לקבוצות מחקר במוסדות ציבור. בעבודה זו, הרכבה בדיקה הוא הסביר בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $. הבדיקה microdialysis מורכבת מקרום polysulfone עם חתך מולקולרי של 30 kDa. בדיקה במבחנה החלמה של חומרים עם משקל מולקולרי שונה (בטווח של 100-1,600 Da) ומאפייני physicochemical שונים בהשוואה. הבדיקה תשואות התאוששות במבחנה של כ -20% לרמת הסוכר בתרכובות קטנות, חומצת החלב, אצטילכולין ו- ATP. החלמה במבחנה לנוירו עם משקל מולקולרי בין 1,000-1,600 סכום דה ל2-6%. וכך, בעוד w המולקולרי גבוה יותרשמונה של נוירו הורידו בערכי התאוששות מבחנה, דיאליזה של תרכובות בטווח הנמוך (עד 500 Da) של משקולות מולקולריות אין השפעה גדולה על במבחנה קצב ההתאוששות. השיטה הנוכחית מאפשרת ניצול של קרום דיאליזה עם ערך חתך אחר וחומר קרום. לכן, יש הרכבה בדיקה מותאמת אישית זה היתרון של גמישות מספיק כדי דיאליזת חומרים במגוון רחב משקל מולקולרי. הנה, אנחנו מציגים בדיקה microdialysis עם אורך חליפין של 2 מ"מ, אשר ישים עבור microdialysis באזורים במוח עכבר וחולדה. עם זאת, ממדים של החללית יכולים בקלות להיות מותאמים לאורכי תמורה גדולים יותר לשימוש בבעלי חיים גדולים יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. במהלך 50 השנים האחרונות, טכניקת microdialysis המינימלית פולשנית שופרה ברציפות להפוך לשיטה מבוססת היטב כדי לפקח על ריכוזים מקומיים של תרכובות משקל מולקולריות קטנות במרחב החוץ תאי. כמעט בכל ביניים נוזל רקמה יכול להיחקר בבעלי חיים לנוע בחופשיות.

Gaddum הציג טכניקת שכיבות למשוך ב -1960. הוא שונה מגישת et al פלדברג. בי tubocurarine היה perfused דרך צינורית המסתיימת בחדר לרוחב ואיסוף השפכים גם באמצעות צינורית 1. Gaddum פיתח את טכניקת דחיפה-המשיכה שבו צינורית המורכבת משתי מחטי פלדה קונצנטריים הושתלה באזורי המוח שונים וperfused ידי פתרון תוך הסרת בו זמנית נוירוטרנסמיטורים שוחררו מהנוירונים המקיפים את הקצה 2. למרבה הצער, Dama רקמהGE נגרמים על ידי הצינורית סביב הקצה מוגבל היישום של שיטה זו. כהתקדמות נוספת של שיטה זו, Bito ועמיתים לעבודה הציגו שיטת שקית דיאליזה שבפתרון שנאסף הופרד מהרקמה הסובבת על ידי קרום דיאליזה. הם מושתלים שק דיאליזה לרקמה התת עורית של צוואר כלב. התוכן של שקית הדיאליזה הוא ללא חלבון ויכול להיות מנותח שבועות רבים לאחר מכן ליונים וחומצות אמינו 3. הפיתוח הבא היה dialytrode, בדיקה microdialysis פרימיטיבית, אשר במקור היה שתוארה על ידי דלגאדו בשנת 1972 4. לבסוף, Ungerstedt ועמיתים שיפרו את העיצוב של חללית microdialysis כך שהוא היה קטן ועקורים פחות רקמה 5.

בדיקה microdialysis קונצנטריים מתנהגת באופן דומה לנימי דם. מערכת perfused ללא הרף על ידי פתרון שמציעה את ההרכב היוני של נוזל הרקמה הסובב תוך חסר אנליטי של עניין. הקרום הדיאליזה דואר נחשף לפתרון או הרקמה החיצוני הוא חדיר למחצה. היא מאפשרת דיפוזיה פסיבית של חומרים לבדיקה לאורך מפל הריכוזים שלהם 6. החדירות תלויה במשתנים רבים כגון משקל מולקולרי, צורה, תשלום ו- pH של המתחם. כמו כן הוא מוגבל בשל תכונות חומר הקרום, נקבובית גודל של הקרום וקצב זרימת 7.

איורים 1 ו -2 להראות בדיקה microdialysis קונצנטריים. נוזל זלוף נכנס דרך צינורות כניסה לתוך שרוול המתכת, המקיף את סיליקה התמזגה. בתוך שרוול המתכת, זה זרמים למטה לאורך סיליקה התמזגה ומשאיר אותו על הקצה שלה. במרחב שבין קרום הדיאליזה וpolytetrafluoroethylene (PTFE) -tubing (כגון טפלון) נוזל זלוף אז זורם כלפי מעלה. כאן, דיפוזיה של חומרים מרקמות מתרחשת המקיפה את הקרום. Dialysate עוזב את הבדיקה דרך PTFE-צינורות, אשר מחובר לשקע צינורות וניתן לאסוף.

יש טכניקת microdialysis כמה יתרונות יחסי לאחרים בטכניקות vivo. הבדיקה מהווה מחסום פיזי וכתוצאה מכך dialysate אינו מכיל אנזימים או תאים. לכן, אין צורך בטיהור של eluate לפני הניתוח, ולא השפלה האנזימטית של analytes מתרחשת. השפלה חמצוני יכולה להתרחש במהלך המעבר של analytes בצינורות, אבל זה לעתים קרובות ניתן למנוע על ידי הוספת נוגדי חמצון (לדוגמא חומצה אסקורבית) לperfusate. לחלופין, נזק חמצוני לנוירו, למשל, דוכא ביעילות על ידי החלפת הצינור לשקע עם קצה לאסוף dialysate 8. Dialysate ניתן לחקור ישירות עם כמעט כל סוג של שיטה אנליטית ויכול להיות שנאסף analytes מרובה בו זמנית. מערכת זו יכולה לשמש בבעלי חיים ער, וכמעט כל האזורים במוח יכולים להיותבדק. יתר על כן, עירוי של תרופות דרך הבדיקה אפשרי (retrodialysis). עם זאת, יש גם מגבלות של טכניקת microdialysis. הרזולוציה הזמן מעט הנמוכה אינה מספקת מידע בזמן אמת בנוגע לשינויים עצביים. בגלל זה הוא טכניקה פולשנית, השתלת בדיקה גורמת טראומה ניתוחית והרדמה, אשר יכול להשפיע על ריכוזים עצביים, נדרש במהלך שלב זה 7,9,10.

ריכוז המתחם בdialysate כולל רק כמות קטנה של ריכוז המתחם בפועל בנוזל החוץ תאי. לחישוב ריכוז המתחם ידוע בנוזל החוץ תאי, התאוששות היחסית במבחנה יש להיות מחושבת. קביעת ביחס אישי בהחלמת מבחנה לכל בדיקה וכל מתחם היא הכרחית לפני תחילת ניסוי in vivo. לצורך כך, הבדיקה הוא טבל תמיסה המכילהאנליטי של עניין ואילו נוזל זלוף הוא אותו הפתרון החסר אנליטי של עניין. לאחר קביעת ריכוזי מתחם בdialysate, הנתונים אלה יש התייחסו לריכוזם בנוזל המקיף. קביעות התאוששות במבחנה של כמה חומרים יכולות להיות מיושמות בו זמנית 9.

קבוצות מחקר במדעי מוח רבות משתמשות בטכניקת microdialysis לחקור נוירוטרנסמיטורים ומטבוליטים במרחב החוץ תאי של אזורי מוח שונים. לפיכך, בדיקות מסחריות יש ביקוש גדול בסביבת מחקר מדעי המוח. יתרון גדול של בדיקות זמינות מסחרי הוא האמינות הפונקציונלית הגבוהה. ניסיוני ההגדרה לבדיקות מסחריות מבוססת היטב ומאומתים על נוירוטרנסמיטרים ומטבוליטים ידועים רבים. עם זאת, בעוד שציוד microdialysis זמין המסחרית הוא יקר ויש פחות גמישות ביישום 11, בההוא לעבוד הרכבה בדיקה microdialysis מוצגת בפירוט, אשר ניתן להתאים לכל יישום ויכול להיות מיוצר עבור פחות מ 10 $. בדיקה מותאמת אישית זה בדיקה microdialysis קונצנטריים נבדקה לחקירות באזורי מוח שונים 8.

בהחלמת בדיקה מבחנה של חומרים עם משקל מולקולרי שונה (טווח של 100-1,600 Da) ועם מאפייני physicochemical שונים בהשוואה. התאוששות נחישות במבחנה של גלוקוז, חומצת החלב ואצטילכולין עם משקל מולקולרי פחות מ -200 דא, ATP עם משקל מולקולרי של כ -500 דה ואנגיוטנסין II נוירו, חומר P וסומטוסטטין עם משקל מולקולרי מעל 1,000 דה מבוצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PTFE-צינורות הכנה

  1. לקצר PTFE-צינורות לתוך חתיכת 2.5 סנטימטר. השתמש בנייר בקנה מידה להעריך ממדים פיזיים. (ראה איור 3 א)
  2. חותך סוף אחד בזווית כדי להקל על חיבור של צינורות חשמל. (ראה איור 3 א)
  3. PTFE-צינורות לחספס על ידי שימוש בנייר הזכוכית כדי לאפשר דבקות של דבק אפוקסי.

2. הכנה התמזגו סיליקה

  1. לקצר סיליקה התמזגה לתוך חתיכת 2.25 סנטימטר. (ראה איור 3 א)

3. הכנסת סיליקה התמזגו לתוך PTFE-צינורות

  1. הכנס צינורית G 30 לסיבים החלולים PTFE לנקב אותו במרחק של 1 סנטימטר מהקצה השטוח. לכופף את PTFE-צינורות כדי לפשט את התהליך. (ראה איור 3 ב)
  2. הכנס את סיליקה התמזגה לתוך PTFE-צינורות באמצעות הצינורית כמו הדרכה. (ראה איור 3 ג)
  3. הוצא בעדינות את הצינורית ולאבטח את סיליקה התמזגה. (ראה3D איור)
  4. סיליקה התמזגה אמורה להקרין 5 מ"מ בסוף השטוח. (ראה איור 3E)
  5. דבק סיליקה התמזגה במקום באתר לנקב על ידי דבק cyanoacrylate ולאפשר לו להקשיח במשך הלילה. (ראה איור 3E)

4. אפוקסי דבק הכנה (שני רכיבי דבק)

  1. הוסף 30 חלקי מקשה צהובה ל -70 חלקים של דבק אפוקסי שחור על ידי עזרה של מחט דקה ומערבבים אותו בעדינות. זה ישירות מוכן לשימוש.

5. מריחת ממברנה (כל צעדים נוספים יש לבצע מתחת למיקרוסקופ ונייר בקנה מידה המשמש להערכת ממדים פיסיים)

  1. משוך את קרום polysulfone על סיליקה התמזגה בזהירות, ואז למשוך את הקרום לPTFE-צינורות ולהתאים את הקרום 5.5 מ"מ באמצעות אזמל חד. (ראה איור 3F)
  2. להגדיר נקודה על קרום סימון עם עט דק להגדיר את אורך החליפין של 2 מ"ממהקצה של הקרום.
  3. למרוח כמות קטנה של דבק אפוקסי כדי לכסות את הקצה של הקרום בעזרת מחט דקה. (ראה איור 3G)
  4. סגור את משותף בין קרום הדיאליזה וPTFE סיבים על ידי עזרה של אותה מחט דקה המשמשת בשלב 5.3) עם דבק אפוקסי. (ראה איור 3G)
  5. הוסף מספיק דבק אפוקסי על הממברנה עד לנקודת הסימון כדי להבטיח אורך חליפין של 2 מ"מ. לאפשר לו להקשיח במשך הלילה. (ראה איור 3G) לפני קביעת אורך החליפין, הקרום הוא 5.5 מ"מ. לאחר החלת דבק אפוקסי על הקרום, רק 2 מ"מ של הקרום זמין עבור דיפוזיה.

6. יישום שרוול המתכת

  1. חותך מחט 25 G לחתיכות שרוול מתכת 1 סנטימטר על ידי עזרה של צבת כיפוף.
  2. משוך את שרוול מתכת 1 סנטימטר (25 G) על החלק הנותר של סיליקה התמזגה. שרוול המתכת מאוחר יותר מאפשר חיבור של צינורות היניקה עם microdiaהבדיקה תמוגה. (ראה איור 3H)
  3. לאטום משותף בין שרוול המתכת וPTFE-צינורות עם דבק אפוקסי שנותר. לאפשר לו להקשיח לפחות 24 שעות. (ראה איור 3i)
  4. מריחת דבק חם סביב ההסתעפות של החללית לקיבוע וייצוב נוספים.
    הערה: הנפח הפנימי הכניסה של החללית היא 0.045 μl והנפח הפנימי לשקע הוא 2.5 μl. לכן, עם קצב זרימה של μl 1 / דקה, זה לוקח כ 2.5 דקות לאחר חיבור צינור הכניסה להתחיל האוסף של dialysate. עם הפרוטוקול הנוכחי, הליך ההרכבה הבדיקה מניב בדיקות microdialysis כי הם 95% אמינות.

7. ביצוע ניסויים שחזור חוץ גופית ב

  1. טובלים את הבדיקה עם חתך של 30 kDa ואורך חליפין של 2 מ"מ לפתרון מניות המורכב מaCSF מכיל גלוקוז 1 מ"מ וחומצת חלב 1 מ"מ ו, בניסוי נפרד, לCSF המכיל 100ATP ננומטר ו -100 ננומטר אצטילכולין.
  2. Perfuse הבדיקות עם aCSF. הגדר קצב זרימה לμl / דקה 1 ולבצע ניסויים בטמפרטורת חדר (22 מעלות צלזיוס). לאפשר הבדיקות לאזן עבור שעה 1 בפתרון המניות, ולאסוף הדגימות כל 30 דקות לאחר מכן ולאחסן ב -80 ° C עד מדידה.
  3. לחישוב החזרים במבחנה, להשוות את הריכוזים של analytes בdialysates עם ריכוזי אנליטי הידועים בפתרון המניות. הגעה תוצאות באחוזים של ריכוז חומר בdialysate לעומת פתרון מניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבדיקה microdialysis מחוייט קונצנטריים מורכבת מקרום polysulfone עם חתך מולקולרי של 30 kDa. ההרכבה הבדיקה מתוארת באיור 3.

זה הציג התאוששות במבחנה לגלוקוז מטבוליטים אנרגיה הקטנה (180.16 Da) וחומצת החלב (112.06 Da) של 19.10 ± 1.2% ושל 21.2 ± 1.6%, בהתאמה. לאצטילכולין הטעון חיובי עם משקל מולקולרי של 181.66 דא, זה הראה במבחנה התאוששות ערך של 22.6 ± 1.4%. ATP עם משקל מולקולרי של 551.6...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מראה הרכבה בדיקה למופת. ממדי קוטר פנימיים וחיצוניים נכונים שכדי לצפות מקרוב לצינורות (OD 1.6 מ"מ; מזהה 350 מיקרומטר), סיליקה התמזגה (OD 105 מיקרומטר; מזהה 40 מיקרומטר) וקרום דיאליזה (OD 245 מיקרומטר; מזהה 210 מיקרומטר). כמו כן, חשוב לשמור על מרחב שבין הקרום וסיליקה התמזגה של (105 מיקרומטר) ובין הקרום וצינורות (105 מיקרומטר) גם כן. אם הערכים שונים, לחץ בבדיקה יכול לעלות ולגרום לדליפה של הקרום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אסירי תודה לג' ברקה (SunChrom GmbH, פרידריכסדורף, גרמניה) על תמיכתו ועל אספקת דבק האפוקסי. יתר על כן, המחברים מודים ל-Fresenius Medical Care (באד הומבורג, גרמניה) על אספקת מסנן המודיה-נימי FXCorDiax. המימון הושג מאוניברסיטת גתה בפרנקפורט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דבק אפוקסיSunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, גרמניה     
מזהה סיליקה התמזגה 40 ומיקרו; m OD 105 ומיקרו; מצימר-כרומטוגרפיה, מנהיים, גרמניהאמנות. מס': 6.040105
קרום פוליסולפון (מסנן המודיאליזה FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, באד הומבורג, גרמניהREF: דבק
(Pattex® פלסטיק דבק-על)Henkel AG&Co. KGaA, Dü סלדורף, גרמניה
צינורות טפלון 1.6 x 0.35 מ"מSunChrom® GmbH, פרידברג, גרמניהאמנות. מס': 969-195.219
אזמל (Feather® להב כירורגי מס' 10)pfm medical ag, קלן, גרמניהאמנות. מס' 07310
מיקרוסקופMEIJI Techno EMZ-8TR
צינורית 30 גרם x 11 אינץ' (0.3 x 25 מ"מ)   Sterican® ZB.Braun Melsungen AG, Melsungen, גרמניהREF: 9324500
25 G x 11/2 אינץ' (0.5 x 40 מ"מ) צינורית 100 Sterican®B.Braun Melsungen AG, Melsungen, גרמניהREF: 9186166
עט משובח (Stabilo point 88 fine 0.4)Schwan-STABILO Schwanhä uß er GmbH & Co. KGArt. מס': 88/36
דבק חם  (מקלות דבק ULTRA Power x 11 מ"מ)שטיינל&רג; GmbH, Herzebrock-Clarholz, גרמניהאמנות. מס': נייר זכוכית 4007841046910
P60 230 x 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, גרמניהמספר קטלוגי: 2608605397
ציאנקרילט F00001593

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Custom Microdialysis ProbePolysulfone MembranePTFE TubingFused SilicaEpoxy GlueMetal SleeveIn Vitro RecoveryMolecular Weight CutoffExchange LengthNeuropeptide Detection

מאמרים קשורים