פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

סיכום

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

תקציר

לצד hepatocytes parenchymal, הכבד מכיל תאים שאינם parenchymal (NPC) כלומר תאים Kupffer (KC), תאי אנדותל הכבד (LEC) ותאי stellate הכבד (HSC). דו מימדי (2D) תרבות של hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH) עדיין נחשב "תקן הזהב" במבחנה בדיקות של חילוף החומרים סמים הרעילות. זה ידוע היטב כי monoculture 2D של PHH סובל dedifferentiation ואובדן תפקוד. לאחרונה הודגם כי הכבד NPC למלא תפקיד מרכזי בכבד (patho-) פיזיולוגיה החזקת פונקציות PHH. המחקר הנוכחי מתמקד בשחזור של האדריכלות רקמות in vivo על ידי 3D- ומודלים לתרבות משותפת כדי להתגבר על המגבלות של monocultures 2D. בעבר פרסמנו שיטה לבודדת בתאי כבד אנושיים וחקרתי את התאמתו של תאים אלה לשימושם בתרביות תאים בביולוגיה ניסויית ורפואת ^1. בהתבסס על הריבית הרחבה te זהchnique המטרה של מאמר זה הוא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר רבייה קלה של טכניקה זו.

בתאי כבד אנושיים בודדו מדגימות רקמת הכבד האנושי של התערבויות כירורגיות ידי טכניקה P זלוף שני שלבים EGTA / collagenase. PHH הופרד NPC ידי צנטריפוגה ראשונית ב 50 x ז. צעדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות שמשו להסרת תאים מתים. אוכלוסיות תאים בכבד הפרט בודדו את שבר NPC מועשר באמצעות מאפייני תאים ספציפיים ונהלי מיון תא. לצד בידוד PHH הצלחנו להפריד KC, הבקר ואת HSC לגידול נוסף.

יחדיו, הפרוטוקול המובא מאפשר בידוד של PHH ו NPC באיכות ובכמות גבוהה ממדגם רקמות התורם אחד. הגישה אוכלוסיות תאים בכבד מטוהרים יכול לאפשר יצירה של in vivo כמו li אדםמודלים Ver.

מבוא

רקמת כבד אנושית היא מאוד מורכבת מורכבת משני גופי תאים שונים, תאי parenchymal ותאי הלא parenchymal (NPC). תאי כבד Parenchymal כוללים hepatocytes ו cholangiocytes. Hepatocytes מייצג 60 עד 70% של תאי כבד סכו להסביר את רוב הפונקציות הכבדות מטבולית, למשל, חומצות מרות ומשלים סינתזת גורם, biotransformation ואנרגית מטבוליזם ^2,3.

שבר NPC הקטן מהווה 30-40% של תאים כבדים כוללים. NPC לכלול אוכלוסיות תאים שונות, כלומר תאי Kupffer (KC), תאי אנדותל כבדים (LEC) ותאי stellate הכבדים (HSC). שבריר תא הטרוגנית זו ממלאת תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים של הכבד. בנוסף, NPC להשתתף בתיווך נזק כבד חריפה, למשל, פגיעה בכבד הנגרמת התרופה (דילי) וכן לפציעת כבד כרונית, כגון שחמת ^4.

בשנים האחרונות, hתאי כבד באומן הפכו יותר ויותר חיוני במחקר ופיתוח של בדיקות סמים, פיתוח תרופות וזיהוי הביוכימיים חדשים במחלות כבדות. עבור בדיקות במבחנה monocultures PHH עדיין נחשבים "תקן הזהב" ^5. המגבלה העיקרית של מודלים כבדים homotypic הנוכחיים היא dedifferentiation ואובדן התפקוד של hepatocytes תוך מספר ימים ^4. הקמת טכניקות תרבות 3-ממדי (3D) הוכיחה כי מגבלות אלה ניתן לפצות ^4,6. עם זאת, אפילו טכניקות תרבות 3D מודרניות אינן מסוגלות להציג את כל מצבי hepatotoxic של פעולות ^7. אוכלוסיות NPC חסרות במודלים במבחנה הקיימים נדונות כסיבה אפשרית לאי התאמה זו למצב vivo. הוכח כי תקשורת תאי תאים בין אוכלוסיות תאים בכבד השונות ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס פיסיולוגי אלא גם pathophysiologic מעבד ^8. לכן את תשומת הלב המדעית מתמקדת יותר ויותר על NPC ואינטראקציות תאי התאים שלהם. שימוש ותכליתי במערכות שיתוף תרבות רקמות מהונדסות יכול להיות פתרון עבור הביקוש הרב של מודלים כבדים במבחנת ^8,9 שהן קרובות ככל למצב in vivo ככל האפשר.

כרגע האתגר המרכזי הוא הפיתוח של מודל כבד אנושי סטנדרטי שיתוף תרבות, המכיל חלקים ברורים של PHH ו NPC. כתוצאה מכך, טכניקות לבידוד תאי הכבד הטרוגנית מאוד נדרשות ואלה צריכים להיות מותאמים על מנת לקבל אוכלוסיות תאים טהורות. בעוד פרוטוקולים סטנדרטיים עבור בידוד PHH קיימים ^10, הבידוד הסטנדרטי של NPC אדם עדיין בפיתוח. רוב שפורסמו פרוטוקולי בידוד NPC מבוססים על ניסויים עם תאים שאינם בני אדם ^11,12. רק כמה פרסומים לתאר את תהליך הבידוד של האדם NPC ורוב מכסים רקשיטות הבידוד של תא בודד מקלידים ^11-16. מאפייני התא החשובים ביותר כי כבר רתמו להפרדה סלולרית הם גודל, צפיפות, התנהגות-הקשר, ואת הביטוי של חלבוני פני שטח. על סמך מאפיינים אלה פתחנו פרוטוקול פשוט לבודדים PHH, KC, בקר ואת HSC, אשר פורסם בעבר בביולוגיה ניסויית ורפואת ^1. בגלל העניין הרחב בטכניקה זו, המטרה של מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר לשחזר את הטכניקה יותר בקלות. הפרוטוקול כולל גם שיטות בקרה איכות להערכת תשואה ואת הכדאיות וכן להערכת זיהוי ורמת ניקיון באמצעות immunostainings הספציפי.

פרוטוקול

הערה: כל התאים היו מבודדים מרקמת כבד אנושית הלא tumorous שנקטעה, שנשאר לאחר כריתה חלקית כבדה עם גידולים בכבדים ראשוניים או משניים. הסכמה מדעת של החולים הושגה על פי הקווים המנחים האתיים של השריטה - Universitätsmedizin ברלין.

1. הכנת חומרים ופתרונות

1. לעקר את כל המכשירים ואת החומרים מראש כדי למנוע זיהום חיידקים במהלך תהליך הבידוד.
2. הכן את הפתרונות הנדרשים זלוף של המדגם רקמת הכבד, את תהליך הבידוד של hepatocytes ותאי הכבד הלא parenchymal וטיפוח בתאי כבד אנושיים ראשוניים על פי לוחות 1 ו -2, עם יוצא מן הכלל של פתרון העיכול אשר מוכן טרי לפני השימוש. כל הפתרונות יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ומומלץ להשתמש בהם בתוך 4 שבועות לאחר ההכנה.
3. לְעַקֵרכל הפתרונות באמצעות מסנן העליון 0.22 מיקרומטר הבקבוק.

2. הכנת ציוד זלוף

1. הגדרה לציוד עבור זלוף ועיכול המדגם הכבד הרקמות כפי שמוצג באיור 1 א.
2. כוונו את הטמפרטורה באמבט מים עד 39 ° C על מנת להבטיח פעילות P collagenase אופטימלי במהלך זלוף ועיכול.

3. זלוף ועיכול מדגם רקמת כבד (1.5 שעות)

1. בחר דגימת רקמה עם הקפסולה של שלמי Glisson מרקמת כבד הכריתה. כאשר חיתוך דגימת רקמה, לנסות לקבל משטח חיתוך קטן עם כלי גלוי טוב. הימנע פעמים איסכמיה חמה על ידי הובלת וטיפול המדגם הכבד רקמות על הקרח עד זלוף.
2. קח את משקל הרקמה בתנאים סטריליים ולמקם המדגם כבד רקמות בצלחת פטרי בזרימת האוויר למינרית. נקו את פני השטח של דגימת רקמה עם רטייה סטרילי מן מחדשmaining דם ולשטוף את סט הצינורית באמצעות שאני זלוף-פתרון 1x על מנת להבטיח כי כל הצינורית הייתה חדירה.
3. השתמש רקמות דבקות לתקן את הזיתים של קנולות בחלק כלי דם גדול. בהתאם לגודל של המדגם כבד רקמות ומספר הכלי על פני השטח, להשתמש צינורית משובצת 3 עד 8 קנולות. בדוק את זלוף ולבדוק דליפות. סגור את כל כלי הדם, אשר להדליף לי 1x זלוף-פתרון ברור, עם דבק רקמות.
4. מניח את מדגם רקמת כבד cannulated לתוך המשפך ביכנר על דיסק המסנן המחורר שלה (איור 1 א).
5. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה peristaltic בין 7.5 מ"ל / דק 'ו 14.6 מ"ל / דקה תלוי במספר קנולות משומשים על התנגדות של רקמת הכבד. התאם את קצב הזרימה בכל פעם על מנת להבטיח כי קיים זלוף נוכחי אבל איטי. Perfuse הרקמה עד הדם המלא סמוק החוצה אבל לפחות 20 דקות. שים את הרקמות הופכות בהיר באזורים עם perfusi הטובעַל.
   הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לצבוט אחד קנולות עם מהדק פלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של שטח על ידי דחיפת ברכות עם מרית נגד הקפסולה הכבד, כדי לייעל את זלוף. שינוי צבע מלא בצהוב בהיר לצבע חום בהיר מציין זלוף טוב.
6. שנה את נוזל זלוף-פתרון העיכול המכיל collagenase P (טבלה 1).
7. לסדר מחדש את ההתקנה (איור 1 א) עבור שלב העיכול. לכן לבצע זרימה מעגלית של פתרון העיכול על פי איור 1B עבור עד 15 דקות.
   הערה: זה קריטי להפסיק זלוף מיד כאשר המדגם הכבד רקמות מתעכל מספיק. עיכול טוב ניתן לצפות, כשאף הרקמה מראה סימן של גמישות לפי הערכה ותחזוקה של דפורמציות כמוסה, כאשר הוא דחף עם מרית.

4. בידוד של hepatocytes (1 hr)

1. Tכד משאבת peristaltic ונח המדגם כבד רקמות בצלחת זכוכית. יש לשטוף את החלק החיצוני של דגימת רקמה עם פתרון-Stop קרים כקרח (טבלה 1). הסר את קנולות מהדגימה כבדת הרקמות. השתמש אזמל כדי לפתוח את המדגם כבד רקמות, על ידי חריטה באמצע האזור שבו קנולות צורפו. שמור על עצמך כי הקפסולה Glisson's נשאר ללא פגע.
2. יש לשטוף את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן לכסות את דגימת הרקמה השלמה עם פתרון-Stop קר כקרח. לנער את הרקמה בעדינות כדי לשחרר את התאים מתוך הרקמה.
3. אסוף את השעית התא ולסנן אותו דרך משפך מבט (משפך פלסטיק מרופד תחבושות) לתוך 50 צינורות פלסטיק מיליליטר. הוסף עוד עצור-פתרון מדגם כבד הרקמה עד נפח סופי של 500 מיליליטר הוא נצרך.
4. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. איסוף supernatant בידוד תא הלא parenchymal מאוחר יותר. שטוף את התא גלול עם PBS (איור 2א).
5. צנטריפוגה השעית התא שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. אסוף את supernatant מחדש להשעות גלולה במדיום דגירה Hepatocyte (לוח 2, תרשים 2B).
6. לקבוע את המספר הסלולרי ואת כדאיות השעית התא וכתוצאה מכך באמצעות מכתים trypan הכחול. לספור את החיים תאים מתים בתא לספור נויבאואר. לחשב את מספר הסלולרי, הכדאיות ואת התשואה של PHH תוך שימוש בנוסחאות להלן.
   
   תשואה (נספר תאים) = תאים נספר x גורם לדילול נפח x של השעיה תא (מ"ל) x 10,000
   
   תשואה (hepatocytes / (מדגם כבד גרם רקמה)) = (תשואה (hepatocytes / (תקשורת מיליליטר)) נפח x של השעית תא (מיליליטר)) / (משקל של מדגם כבד רקמות (ז))
   
   כדאיות (%) = 100% x (מספר תאי חיים) / (מספר תאים כולל)

5. טיהור hepatocytes (1 hr)

הערה: שלב טיהור זו מומלצת, אם את הכדאיותנמוך מ -70%.

1. ביצוע כל הצעדים על הקרח. הכן שיפוע צפיפות 25% על ידי ערבוב פתרון שיפוע צפיפות 5 מ"ל ו 15 מ"ל PBS עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
2. שים מקסימום של 50 תאי Mio בסך הכל מתוך השעית התא העשירה hepatocyte בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת שיפוע צפיפות 25% על מנת להבטיח כי הפרדה ברורה של שני השכבות מושגת (איור 2 ג). שים את הצינורות בזהירות לתוך צנטריפוגות צנטריפוגות ב 1,250 XG, 20 דק ', 4 ° C ללא בלם (איור 2 ד).
3. לשאוב את ההשעיה תא הנותרים ואת התאים המתים שלבי הביניים. בהתאם אחד תכולת השומן עלול גם לשאוב שיפוע-פתרון צפיפות.
   הערה: PHH עם תוכן שומנים נמוך צורה כדורית צפופה ואת שיפוע הצפיפות ניתן aspirated לחלוטין. PHH עם תוכן שומנים גבוה צורה כדורית מפוזרת יותר והרבה תאי קיימא עשוי להישאר פתרון שיפוע צפיפות מעל הגלולה.
4. Re- להשעות את כדורי hepatocyte עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. פינת כדורי, לשטוף שוב עם PBS מחדש להשעות PHH מטוהרים במדיום דגירה Hepatocyte. בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6.

טיפוח 6. hepatocytes

1. הכן את כלי תרבית תאים עבור זריעה של PHH על ידי ציפוי אותם עם תאי מטריקס עבור קולגן זנב חולדה למשל (אני סוג קולגן). כן קולגן עכברוש הזנב לפי הפרוטוקול הוקם על ידי רג'אן et al. ¹⁷
2. לדלל את מניות קולגן עכברוש זנב פתרון 1: 200 ב PBS. העברת 100 μl / ² ס"מ חולדה פתרון הזנב קולגן לתוך תרבות מנות, מטפלת כי כל פני השטח מכוסה. דגירת פלסטיק תרבית תאים עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב את פתרון קולגן זנב חולדה הנותר.
3. Seed 15 x 10 ⁴ hepatocytes / ² ס"מ במדיום Hepatocyte דגירה על תרבות disheשעות מצופות קולגן זנב חולדה. טפחו את התאים חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לפחות שעה 4. לאחר 4 שעות את hepatocytes דבק והמדיום ניתן לשנות.
4. לבצע חקירות תלויות בהגדרת הניסוי. זמן תרבות של 48 שעות מומלץ לאפשר לתאים להתאושש תהליך הבידוד.

7. בידוד של תאים בכבד ללא parenchymal (1.5-2 שעות)

1. צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 4.5 ו -4.6) בשעה 72 XG, 5 דקות, 4 ° C לחסל אריתרוציטים ו hepatocytes הנותרים. פינת את supernatants צנטריפוגות אותם פעמיים כדי לקבל שני כדורי תא: 300 XG, 5 דקות, 4 ° C עבור שקיעה של HSC, LEC ובחלקו KC ו -650 XG, 7 דקות, 4 מעלות צלזיוס במשך שקיעה של הנותרים KC.
2. ברכה הן כדורים מחדש להשעות אותם HBSS. כן 25% לבין מפלי צפיפות 50% על ידי פתרון שיפוע צפיפות ערבוב PBS עבור centrif שיפוע צפיפותugation (שיפוע הפתרון צפיפות 25%: 5 מ"ל פתרון מפל צפיפויות 15 מ"ל PBS, פתרון שיפוע צפיפות 50%: 10 מ"ל פתרון מפל צפיפויות 10 מ"ל PBS, ראה איור 2). מניח את פתרון שיפוע צפיפות 25% בזהירות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 50%.
3. שים את ההשעיה NPC בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 25% באופן הפרדה ברורה של שתי שכבות מושגת.
4. צנטריפוגה ההשעיה תא על שיפוע צפיפות 1,800 XG, 20 דק ', 4 ° C ללא בלם (איור 2.2).
5. לשאוב תאים מתים ופסולת תא מהשכבה העליונה. ה NPC ממוקם ביניים בין שכבת שיפוע צפיפות 25% ו -50% (איור 2). אסוף NPC, לשטוף אותם עם HBSS צנטריפוגות ההשעיה תא החלת השלב צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2.).

הפרדת 8. של תאי Kupffer (דבקשלב ההפרדה) (1 hr)

1. בצעו ספירת תאים עבור KC בשבריר NPC כמתואר בשלב 4.6. (לקבלת מראה של KC ההשעיה לראות איור 3B). צנטריפוגה השבר NPC עם הצעד צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2) מחדש להשעות את NPC ב Kupffer תא זריעת בינוני (טבלה 2).
2. זרעים חלק KC המכיל על כלי תרבית תאים פלסטיק בצפיפות של 5 x 10 ⁵ KC / ² ס"מ. דגירת תרבויות KC במשך 20 דקות בתוך חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. KC הראשי לדבוק על פלסטיק תרבית תאים בתוך פרק הזמן קצר (איור 2.3).
3. אסוף את supernatant המכיל אינו דבק NPC, המורכב בעיקר של הבקר ואת HSC. פינה את supernatants להפרדה מאוחרת של בקר (ראה סעיף 9) ו HSC (ראה סעיף 10). שטוף את KC החסיד עם HBSS ולטפח אותם במדיום תרבית תאי Kupffer (לוח 2) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בתוך חממה humidified.

9. הפרדה לתאי אנדותל (1.5 שעות)

1. צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 8.5.) ב 300 XG, 5 דקות, 4 ° C. שטפו את הכדור עם PBS. לאחר צנטריפוגה XG ב 300, 5 דקות, 4 ° C מחדש להשעות את התאים תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל ולבצע ספירת תאים עבור כל התאים הנותרים כמתואר בשלב 4.6.
2. Re- להשעות 1 x 10 ⁷ תאים Mio ב 1 מ"ל תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל, להוסיף 20 μl פתרון חסימת מן-KIT MACS ו -20 μl של חרוזים מיקרו CD31 עבור immunolabeling דגירה ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 4 טמפרטורת ° C (איור 2.4).
3. בקר בנפרד HSC כמתואר בפרוטוקול manufacturer's עבור מערכת מיון התא המופעלת המגנטי MACS (איור 2.5). Elute מגנטית שמר LEC CD31 חיובי, ולהשהות אותם stellate Cell / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2).
4. בצע תא לספור עבור בקר כמתואר בשלב 4.6. בקר זרע בצפיפות של 1.25 x 10 ⁵ תאים / ² סנטימטר בכלי תרבית תאים מצופים קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1). טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור humidified.

10. הפרדת תאי stellate (0.5 שעות)

1. HSC ללא תווית להעביר את עמודת ההפרדה במהלך הליך MACS. אסוף את שבריר HSC (ראה שלב 9.5, איור 2.5). בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6.
2. HSC זרע עם צפיפות של 5 x 10 ⁴ תאים / ² ס"מ בכלי תרבית תאים מצופה קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1) ב תא stellate / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2) ולטפח אותם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור humidified.

טבלה 1: זלוף פתרון בידוד.

תקשורת ותרבות ובידוד: טבלה 2.

תוצאות

ההפרדה לתוך חלק parenchymal ולא parenchymal, באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות כהליך לנקות בשילוב עם השימוש של נכסים היצמדות MACS מובילה לבידוד PHH ו NPC מוצלח. PHH ו NPC ניתן לבודד באיכות ובכמות גבוהות. איור 1 מציג את התקנת נציג וציוד זלוף והעיכול כבדים. 10% FCS נוספה P collagenase המכיל זלוף - הפתרון השני להפחית פעילות חלבונים של פרוטאזות וכדי לייצב פעילות P collagenase בתמורה. בזמנים עיכול ארוך יותר מכך נדרש לבידוד NPC ניתן ליישם א...

דיון

הפרוטוקול שפורסם מתאר טכניקה לבודדת PHH הטהור NPC, כלומר KC, HSC ו בקר, בו זמנית באיכות גבוהה וטוהרים מאותה דגימת רקמת כבד אנושית. רוב הפרסומים העוסקים isolations תא כבד מכסים רק אחד מאותם אוכלוסיות תאי ^18-20 ונהלי בידוד מבוצעים עם רקמה אנושית הם נדיר (נבדק על ידי Damm et al.) ^21. התאמת שיטות הוקמו עם רקמה מן החי (למשל, חולדה כבדה) כדי כבד אנושי חשף מספר הבדלים במאפייני תא בין בעלי חי אוכלוסיות תאים אנושיים. הקמת שיטת בידוד תא כבד המכסה את א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ציוד כללי
PIPETBOY	פיפטות אפנדורף
מיקרוסקופ	אפנדורף
	אולימפוס
CO2-incubator	קלסר
Lamin Air	Heraeus
צנטריפוגה Varifuge 3.0R	Heraeus
כוס שתן	Sarstedt	2041101
מזרק פרפוזור 50 מ"ל	B.Braun	12F0482022
מסנן בקבוק עליון	Nalgene	1058787
Falcon 50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן	BD Biosciences	352070
פלקון 15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן	BD Biosciences	352096
צלחת תרבית רקמות	BD Biosciences		533047 24 בארות
פיפטות סרולוגיות	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 מ"ל, 10 מ"ל, 5 מ"ל
קצות פיפטות	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l, 1,000 ומיקרו; l
Name	Company	Catalog Number	>Comments
>Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic
תרמוסטט	מד pH לאודה
שוט קשקשים עדינים	Sartorius
stand
Bü chner משפך	Haldenwanger
פלסטיק משפך
סיליקון צינור
צינורית עם קצות
זכוכית צלחת
מלקחיים
אזמל	נוצה	12068760
Neubauer ספירה תא	לידה
	Costar
וילון כירורגי	Charité Universitä tsmedizin ברלין	A2013027
דחיסת	Fuhrmann	40013331
כפפות כירורגיות סטריליות	Gammex PF	1203441104
דבק רקמות	B. Braun	1050052
בקבוק זכוכית	VWR
קולגנאז P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	ביוכרום	L6145	צפיפות 1.124 גרם/מ"ל
Hank' s BSS	PAA	H00911-3938
דולבקו' s PBS	PAA	H15 - 002	ללא מ"ג/Ca
פלסטיפור		13CKP151
אלבומין	סיגמא-אולדריץ'	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
>Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	גלוקוז נמוך (1 גרם/ליטר) (ללא L-גלוטמין)
תמיסת חיץ HEPES 1  M	GIBCO	1135546
L-גלוטמין	GIBCO	25030-024	200 מ"מ
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
פניצילין/סטרפטומיצין	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	ללא L-גלוטמין
נתרן פירובט	GIBCO	1137663	100 מ"מ
טריפאן כחול פתרון	סיגמא-אולדריץ	T8154	0.4%
ויליאם s E	GIBCO	32551-020
עם GlutaMAX ™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 מ"ג/2 מ"ל
אינסולין אנושי	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-אצטיל ציסטאין	סיגמא-אולדריץ'	A9165-5G
סרום עגל עוברי (FCS)	PAA	A15-101
<חזק>שם	חברה	>מספר קטלוגי	תגובות
>ציוד לצביעה חיסונית
CD 68	R& D Systems, ארה"ב		חד שבטי
CK 19	סנטה קרוז	D2309	פוליקלונלי
CK18	סנטה קרוז	K2105	חד שבטי
וימנטין	סנטה קרוז		מונוקלונלי
GFAP	סיגמא אולדריץ'		מונוקלונלי
טריטון X-100	סיגמא אולדריץ'	23.472-9
עיזים נגד עכבר IgG1-PE	סנטה קרוז	C0712
עיזים נגד ארנב IgG-FITC	סנטה קרוז	L0412
מתנול	J.T.Baker	1104509006
פורמלדהיד 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
אלבומין סרום בקר (BSA)	סיגמא אולדריץ'	A7906-100G