תאי Caco-2 יכולים לשמש כמודל במבחנה לחקר הובלת האנטרוציטים של שומנים, ותרופות/ויטמינים מסיסים בשומנים. מערכת הממברנה החדירה מפרידה בין התא האפיקלי לתא הבסיסי, בעוד שמערכת ביטוי ה-lentivirus מציעה שיטת ביטוי יתר יעילה של גנים. בידוד הליפופרוטאינים מאושר על ידי TEM.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרים על ספיגת שומן בתזונה נערכים בדרך כלל על ידי שימוש במודל של בעלי חיים המצוידים בצינורית לימפה. למרות שמודל בעלי חיים זה מקובל כמודל in vivo לספיגת שומן תזונתי, הטכניקות הכירורגיות המעורבות מאתגרות ויקרות. מניפולציה גנטית של המודל החייתי היא גם יקרה וגוזלת זמן. ניתן לטעון שמודל האלטרנטיבה במבחנה הוא זול יותר, חוסך זמן ופחות מאתגר. חשוב לציין, מודל המבחנה מאפשר לחוקרים לבחון את האנטרוציטים כמערכת מבודדת, ולהפחית את המורכבות הטבועה במודל האורגניזם השלם. מאמר זה מתאר כיצד תאי קרצינומה של המעי הגס האנושי (Caco-2) יכולים לשמש כמודל מבחנה לחקר הובלת אנטרוציטים של שומנים, ותרופות וויטמינים מסיסים בשומנים. הוא מסביר את התחזוקה הנאותה של תאי Caco-2 ואת הכנת תערובת השומנים שלהם; והוא דן עוד באפשרות החשובה של שימוש במערכת הממברנה החדירה. מכיוון שתאי Caco-2 מובחנים מקוטבים, היתרון העיקרי בשימוש במערכת הממברנה החדירה הוא בכך שהיא מפרידה בין האפיקל לתא הבסיסי. כתוצאה מכך, ניתן להוסיף את תערובת השומנים לתא האפיקלי ואילו את הליפופרוטאינים ניתן לאסוף מהתא הבסיסי. בנוסף, נדונה היעילות של מערכת הביטוי של נגיף הלנטי בוויסות ביטוי גנים בתאי Caco-2. לבסוף, מאמר זה מתאר כיצד לאשר את הבידוד המוצלח של ליפופרוטאינים במעי על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM).
מבוא
מחקרים של ספיגה במעיים של שומן, ותרופות מסיסים בשומנים וויטמינים יכולים להתנהל in vivo על ידי שימוש במודל פיסטולה הלימפה 1 - 4. עם זאת, הטכניקות הניתוחיות המעורבים הן לא רק אתגר, אבל גם יקרות. למרות in vivo גישות המבוסס על ניתוח צואה עשויה להיות מנוצלת, הם משמשים בעיקר כדי לקבוע את ספיגת אחוזים על ידי מערכת עיכול 2,5. המודל במבחנה המתואר במאמר זה הוא יותר חסכוני, והטכניקות מעורבות הן ללא ספק פחות מאתגרות. מחקרי הנדסה גנטיים הם גם חסכוניים יותר ופחות כאשר הם נערכו באמצעות מודל במבחנה זה זמן רב.
מאז חומרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תחזוקה של קאקו-2 תאים
- שימוש בכלים בתרבית רקמה רגילים
- להפשיר את קאקו-2 תאים מבקבוקון קפוא על ידי הצבת את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ומייד להוסיף אותם לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (15% בסרום שור עוברי מחומם מראש (FBS ) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM)).
- כאשר קאקו-2 התאים הגיעו 50-70 מפגש%, לפצל אותם 1: 6 על ידי דוגרים....
- להפשיר את קאקו-2 תאים מבקבוקון קפוא על ידי הצבת את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ומייד להוסיף אותם לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (15% בסרום שור עוברי מחומם מראש (FBS ) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM)).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור קאקו-2 תאים נורמלים 1 מציג 13 ימים לאחר מחוברות. המראה של מבנים בצורת כיפה וטיפי שומנים תאיות אופייני של קאקו-2 תאים מובחנים. כאשר קאקו-2 התאים אינם מפוזרים באופן שווה במהלך זריעה, הם גוש ולגדול באזורים מסוימים של המנה; ויהיו כמה אזורים בצלחת ללא כל תאים. מתערבל והצבת הצלחת על משטח משופע יש להימנע. כמו כן, חשוב לשים לב שהודעת מחוברות-קאקו-2 תאים רגישים יותר לניתוק כאשר תקשורת צמיחה חדשה תתווסף לתאים בערך מדי. לכן, יש להוסיף מדיה החדשה בעדינות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה, שתי מערכות שיכולים לשמש כדי לשמור קאקו-2 תאים מתוארים, כלומר, צלחת תרבית רקמה הרגילה וקרום החדיר. היתרונות של שימוש במערכת הקרום החדיר כוללים הפרדה של הפסגה ותאי basolateral, ואת יכולת דגירה תערובת השומנים ולאסוף את ההפרשה ליפופרוטאין בו זמנית. עם זאת, מוסיף קרום החדיר הם יקרים, וקרום פוליקרבונט אינו מאפשר את חשיפת תא טובה. אחד היתרונות של מודל זה במבחנה הוא שמחקרי מניפולציה גנטיים יהיו חסכוניים יותר ופחות זמן רב. ליעילות טובה יותר, יש להשתמש במערכת ביטוי lentiv.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחבר אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרס מענק הזרע מהמכללה לרוקחות של אוניברסיטת קליפורניה נורת'סטייט (ל-AMN). המחברים רוצים להודות למכללת הרוקחות של אוניברסיטת קליפורניה נורת'סטייט על כיסוי עלות הפרסום של מאמר זה, ולג'ורג' טלבוט על עזרתו בעריכת כתב היד הזה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | VWR | 16750-112 | יש לחמם מראש את מצע הגידול בצלחת תרבית רקמה בודדת לפני הוספת תאים |
| FBS | Fisher | 3600511 | אנו לא מחממים את הסרום שלנו |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | עם PBS לפני טיפול בטריפסין |
| מערכת ממברנה חדירה | פישר | 7200173 | צלחת 10 ס"מ, גודל נקבוביות 3 מ"מ, קרום פוליקרבונט |
| צלחת 10 ס"מ | פישר | 08-772-E | צלחת תרבית רקמות |
| צלחת 15 ס"מ | פישר | 08-772-24 | צלחת תרבית רקמות |
| 24 צלחת באר | פישר | 12565163 | צלחת תרבית רקמות |
| מגיב טרנספקציה על בסיס ליפידים | פישר | PRE2691 | ניתן להחליף עם מגיב טרנספקציה אחר |
| מדיה מופחתת בסרום | Invitrogen | 11058021 | לטרנספקציה |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | פישר | 9761120 | 0.45 מ"מ נקבוביות |
| פוליברנה | פישר | NC9840454 | 10 מ"ג/מ"ל |
| חומצה אולאית | סיגמא | 01383-5G | למנוע מחזור הקפאה-הפשרה |
| לציטין | פישר | IC10214625 | לציטין ביצים |
| נתרן טאורוכולט | פישר | NC9620276 | המוצר הופסק; מספר קטלוגי חלופי: 50-121-7956 |
| טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז (ללא EDTA) | פישר | 5892791001 | משמש בעיקר לדגימות הזקוקות לניתוח TEM |
| צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט | פישר | NC9696153 | שימוש חוזר בו מספר פעמים ימוטט את מכסה הצינור |
| לצינור אולטרה-צנטריפוגה | פישר | NC9796914 | נדרש כלי להסרת הצינור/מכסה ממזרק הרוטור |
| פישר | 50-949-261 | ||
| מסנן מזרק | פישר | 09-719C | גודל נקבוביות = 0.2 מ"מ; ניילון |
| חומצה פוספוטונגסטית | פישר | AC208310250 | להכנת 2% חומצה פוספוטונגסטית, pH 6.0 |
| פינצטה | פישר | 50-238-62 | עדין במיוחד ו טיפים חזקים |
| Formvar / רשת פחמן | פישר | 50-260-34 | Formvar / רשת מרובעת של סרט פחמן 400 נחושת |
מקורות
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
