Method Article

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/53152

⸱

August 29th, 2015

 , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Sunnybrook Research Institute, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פלטפורמת הקרנה לזהות קינאזות חלבון האנושית ייעודית למצעי phosphorylated אשר יכול לשמש כדי להבהיר מסלולי העברת אותות רומן. הגישה שלנו כוללת שימוש בספרייה של קינאזות חלבון אנושי מתויג GST מטוהר ומצע חלבון רקומביננטי של עניין. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות קינאז MAP / microtubule ויסות זיקה 2 (MARK2) כקינאז לאתר מוסדר גלוקוז על-מוסדר CREB תעתיק Coactivator 2 (CRTC2), חלבון דרוש להתפשטות תאי ביתא, כמו גם משפחת אקסל של טירוזין קינאז כרגולטורים של גרורות תא על ידי זירחון של חלבון המתאם ELMO. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו ולדון איך זה יכול לעזור להקים מפה מקיפה של כמה תאים מגיבים לגירויים סביבתיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויי חלבון לאחר translational (PTMs) חיוניים לתקשורת תאית. אולי הכי טוב למדו מכל PTMs הוא זרחון, מזורז על ידי קינאז חלבון, המסדיר את מספר עצום של פונקציות חלבון, כוללים הפעילות ביוכימית שלהם, לוקליזציה subcellular, קונפורמציה, ויציבות. זיהוי של אתרי זירחון על חלבוני יעד יכול להתבצע על ידי מיפוי phosphopeptide tryptic או על ידי טכניקות proteomic עכשיו סטנדרטיות באמצעות דגימות מועשרים לפפטידים phosphorylated 1,2. בעוד שלושה רבעים מproteome הביעה צפויים להיות phosphorylated 3 וזיהה 200,000 אתרי זירחון 5, עם הערכות עד 1 מ'6, רבים מהם אין לי ביולוגיה הוקצתה, מסלול איתות, או חלבון kinase.

בעוד זיהוי של אתרי פוספורילציה הוא יחסית פשוט, אתגר גדול יותר הוא יחסיתלזהות אותו מקור קינאז (ים) שמכוון את האתרים הללו, תהליך שאנו מכנים קינאז מיפוי: זוגות מצע. מספר גישות לזיהוי קינאז: זוגות מצע תוארו, או מתחיל עם קינאז של עניין ומחפש מצעים שלה או מתחיל עם מצע של עניין ומנסה למצוא קינאז שינוי בניסוי 7-11 או המחשוב 12. לזהות קינאזות למצע phosphorylated ידוע, ניתן להשתמש ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המכילים רצף נשמר קצר של חומצות אמינו משני צדי שאריות פוספורילציה (אתר הקונצנזוס), כמו גם זיהוי קינאז היוצרים מורכב precipitable עם המצע. עם זאת, גישות אלה הן זמן רב ולעתים קרובות אינו עומדות בהצלחה.

פיתחנו גישה פונקציונלית שיטתית לזהות במהירות קינאז שיכול phosphorylate מצע נתון 13. Assay המסך מייצר ספציפי מצוינתity, עם מבחר מאוד ברור לקינאז מקור הפוטנציאלי. בהתחשב במרכזיותה של זירחון לאיתות ביולוגית, המסך שימושי לגילוי במסלולי איתות כמעט בכל תא 14-16. המסך כולל ביצוע assay קינאז בקנה מידה גדולה עם ספרייה של קינאזות חלבון האנושית. קינאז תויג עם S-transferase גלוטתיון חיידקי חלבון (GST) והם מטוהרים מתמציות תאים יונקים, מה שאומר שאנזימי רקומביננטי - בניגוד לאלה שהוכנו מחיידקים - נוצרים בנוכחות חלבון קינאז במעלה הזרם לעתים קרובות נדרש ל אנזימי רקומביננטי יש פעילות במבחנה. ואכן, תוך פעילות קינאז סרין, תראונין, וטירוזין קינאז הנדרשת להפעלה במורד הזרם נמצא בשמרים 10, שמרי הגנום מקודד חלבון קינאז 122, המציין כי kinome היונקים, עם למעלה מ -500 גנים 17, הפך באופן משמעותי יותר מורכב כדי Regulate התהליכים ייחודיים לאורגניזמים מסדר גבוהים יותר. יתר על כן, ההשפעה של גירויים שונים רלוונטיים לביולוגיה של תא ומחלות של בני אדם (כגון מולקולות קטנות, גורמי גדילה, הורמונים, וכו ') יכולה לשמש לפעילות קינאז 14,15 לווסת בהקשר מתאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים, צלחות, ותאים

  1. הפוך 500 מיליליטר חיץ תמוגה: 25 מ"מ טריס pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 50 מ"מ NAF, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 מ"מ בטא glycerophosphate, גליצרול 5%. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. מייד לפני השימוש, מוסיף dithiothreitol 1 מ"מ (DTT), פלואוריד 1 מ"מ sulfonyl phenylmethyl (PMSF), וvanadate נתרן 1 מ"מ. לאחר שלב זה, PMSF אינו נדרש בכל חיץ לשטוף.
  2. לעשות 20 מיליליטר של 10x קינאז מאגר: 200 מ"מ טריס pH 7.5, 50 בטא glycerophosphate מ"מ (FW 216), vanadate נתרן 2 מ"מ. Aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. מייד לפני השימוש, מוסיף 5 מ"מ DTT.
  3. לעשות 20 מיליליטר של 10x חיץ M-ATP: 300 מיקרומטר אדנוזין טריפוספט (ATP), 66 מ"מ MgCl 2, 33 Aliquot מ"מ MnCl 2. ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C.
  4. הפוך של סולפט dodecyl נתרן 2x 100 מיליליטר (SDS) תמוגה חיץ: 1.5 בסיס גרם טריס, 20 מיליליטר גליצרול, H 30 מיליליטר 2 O. ממיסים ולהתאים את ה- pH 6.8 עם HCl. הוסף 40מיליליטר 10% SDS, להתאים את עוצמת קול עד 100 מיליליטר. הוסף 25 bromophenol הכחול מ"ג.
  5. מקום 4 μl של 25 ng / פלסמיד ביטוי היונקים μl קידוד GST-קינאז 14 לכל גם בקבוצות של 96 צלחות גם וצלחות תווית בהתאם. צלחות חותם והקפאה ב -20 ° C עד לשימוש.
  6. 1-2 ימים לפני transfection, תאי HEK293T התרבות בנשר הבינוני (DMEM) + 10% בסרום שור עוברי (FBS) שונה Dulbecco המלא ואנטיביוטיקה ב37 ° C חממה בתוספת CO 2 (5% סופיים). מעבר עם טריפסין ואינם מאפשר המניה להפוך> 80% ומחוברות בהרחבה. מינימום של 6 x 10 7 תאים נדרשים עבור המסך (3 x 15 סנטימטר מנות של תאי HEK293T כ בנקודת מפגש 80%).

2. Transfection

הערה: ראה איור 1 עבור תרשים זרימה של כל פרוטוקול.

  1. אם צלחות המכילות פלסמידים קינאז הוקפאו, הפשרה בטמפרטורת חדרND צנטריפוגות ב 1,900 XG במשך 3 דקות כדי לאסוף כל לחות בחלק התחתון של בארות.
  2. מערבבים 8.6 מיליליטר של מדיום מופחת בסרום (למשל, OPTI-MEM) עם 312.7 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס. בואו לשבת במשך 5 דקות.
  3. הוסף 10 μl של מדיום סרום מופחת לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי.
  4. הוסף 10 μl לכל גם בתמהיל מגיב בינוני סרום / transfection המופחת מצעד 2.2 באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת במשך 20 עד 45 דקות.
  5. תאי Resuspend 293T על 7.5 x 10 5 תאים / מיליליטר ב 80 מיליליטר של DMEM המלא. להוסיף השעיה תא (כלומר 7.5 x 10 4 תאים) 100 μl לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי.
  6. בדקו בארות תחת מיקרוסקופ לחלוקת תא אחיד ולחזור לחממה עבור 24 שעות.

הנפתח 3. GST-קינאז

  1. הפוך Fפתרון pervanadate 4 מ"מ על ידי ערבוב 60 μl של 0.2 M vanadate נתרן עם 540 μl של H 2 O.: ריש בשילוב צינור שני 2.7 μl של 30% חמצן ו -1.4 מיליליטר של PBS. להוסיף שני פתרונות יחד ולתת לשבת במשך 15 דקות לפני השימוש.
  2. בעזרת פיפטה רבה (לא משתמש במתקן נוזלי אוטומטי כפי שהוא יוצר יותר מדי מערבולת בבאר) לוותר על 2 μl של 0.25 מ 'CaCl 2 בכל טוב, ואחריו 2.5 μl של pervanadate מוכן בשלב 3.1. דגירה כל צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למקם על קרח.
  3. הכן 35 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי הוספת DTT, PMSF, וvanadate נתרן כפי שצוין בסעיף 1 (הכנת ריאגנטים).
  4. שמירה על צלחות על קרח, להסיר בינוני מכל גם באמצעות aspirator ואקום. מייד להוסיף 50 μl / טוב של חיץ תמוגה קר כקרח באמצעות מצויד בקלטת סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת 30 דקות על קרח לlyse (אופציונאלי: ניתן לעצור כאן במידת צורך על ידי איטום platדואר ואחסון ב -80 ° C. כדי להמשיך, צלחות הפשרה על קרח).
  5. צלחות ספין ב1,900 XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. לגרד תאים מכל טוב בעזרת פיפטה רבה ולהעביר את כל התוכן לכותרתו כראוי צלחות 96 גם V-תחתון. צלחות ספין ב1,900 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. במהלך ספין, למלא צלחות גלוטתיון מצופים (אחד לכל צלחת 96-היטב) עם 100 μl / היטב חיץ קרח קר תמוגה (ללא PMSF) כשטיפה. שמור צלחות על קרח.
  8. הסר צלחות V-תחתון מצנטריפוגות. אחד בכל פעם, להפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה והכתם על מגבת נייר. העבר את מאגר תמוגה מהצלחות V-תחתון לצלחות גלוטתיון ידי הטיית הצלחת ובעזרת פיפטה רבה, להיות זהיר, כדי לא להפריע את הכדור בחלק התחתון. לכסות צלחות ולהשאיר על קרח עבור שעה 2 מינימום להיקשר.
  9. קרוב לסוף הצעד המחייב 2 שעות, להכין תחנת עבודה רדיואקטיביות, הבטחה לאהוא אמצעי בטיחות דרוש נמצא במקום עבודת רדיואקטיבי. תנור הכלאה להגדיר עד 30 מעלות צלזיוס.
  10. הכן 200 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי vanadate DTT ונתרן הוספה כאמורה בסעיף 1. PMSF אינו נדרש בשלב זה.
  11. הפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה ולמחוק על מגבת נייר. בארות לשטוף 3x עם 100 חיץ תמוגה μl (ללא PMSF). אל תתנו לבארות לשבת יבשות - לשמור אותם בשטיפה עד מוכן להמשיך.
  12. הכן 55 מיליליטר של חיץ 1x קינאז (KB) על ידי דילול המניות 10x והוספת DTT כפי שצוין בסעיף 1. צלחות לשטוף פעם אחת עם 50 μl של 1x KB באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. השאר 1x KB בבארות עד פתרון מוכן:
    1. הכן פתרון על ידי הוספת 500-530 מיקרוגרם של המצע של עניין, 500 מיקרוגרם של חלבון המיאלין בסיסי (MBP), 2.65 מיליליטר של 10x KB, 13.25 μl של 1 M DTT, ו- H 2 O עד 15.9 מיליליטר.
  13. אחד בכל פעם, להפוך את הצלחות מעל כיור כדי להסיר שטיפת KB 1x, למחוק על מגבת נייר, ומייד להוסיף 30 μl של הפתרון באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. שמור צלחות על קרח.
  14. הכן פתרון B באזור עבודת הרדיואקטיביות על ידי הוספת 2.5 מיליליטר 10x M-ATP, ATP 32 P 500 gamma- μCi, ו- H 2 O ל -10 מיליליטר.
    1. הוסף 20 μl של הפתרון B לכל גם באמצעות פיפטה מהדר אשר מסייעת בערבוב בשל כוח פליטה. מכסים ודגירה בתנור הכלאה 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  15. לאחר 30 דקות, להעביר צלחות בחזרה לקרח. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה 2x SDS זה גם בעזרת פיפטה רבה. יכול להמשיך בשלב זה לשלב הבא, או לאטום את הצלחות בנייר אלומיניום ולאחסן ב -20 ° C עד נוח.

4. ריצה, מכתים, וג'לי ייבוש

הערה: כל העבודה צריכה להתבצע בdesigna אזורטד לרדיואקטיביות.

  1. הפעל תנור הכלאה ולהגדיר עד 85 מעלות צלזיוס. צלחות הפשרה בטמפרטורת חדר. ברגע שהתנור הגיע טמפרטורה, צלחות העברה לתנור ודגירה של 10 דקות ללפגל דגימות.
  2. עומס 26 היטב מראש יצוק ג'לי עם 15 μl של כל תגובה באמצעות פיפטה רבה כדי למלא כמה בארות ובעונה אחת. יש להקפיד שכל הטיפים ליישר עם מקביל היטב לפני הוספת דגימות. הפעל ג'ל ב 150 V. אל תתנו צבע המעקב (קו כחול) לברוח מתחתית הג'ל כזה מכיל ATP מאוגדים.
  3. לפרק את ג'לי ומנותק ATP מאוגדים (קו כחול) באמצעות אזמל או קצה ישר כפי שהוא יהיה לחשוף יותר מדי הסרטים. מניחים את ג'לי במכולות שכותרתו ולכסות עם כתם Coomassie במשך 15 דקות.
  4. להסיר את כתם Coomassie, בקצרה לשטוף את ג'לי עם מים, ולהוסיף destain פתרון. Destain ג'לי עד החלבונים נראים בבירור. להקה לMBP ולהקה למצע צריךיהיה גלוי לכל דגימה.
  5. לייבש את ג'לי:
    1. חותך גיליון גדול של נייר סינון ולמקם אותו במייבש.
    2. להרטיב גיליון צלופן במים מזוקקים עד שהוא חלק ולהתקמט בחינם, ומניח אותו על גבי הנייר.
    3. הנח את ג'לי על גבי גיליון נייר צלופן, מה שהופך את הערה של סדר ג'לי. להרטיב גיליון צלופן שני ומניח על גבי ג'לים.
    4. מרדדים כל הבועות (רולר איטום צלחת עובד היטב עבור זה) למשטח אחיד נחמד. סגור את הדש, להדליק את הוואקום, ולייבש את ג 'לים 3 שעות על 80 מעלות צלזיוס.
  6. ברגע שהג'לי הוא יבשים, לחשוף אותם לסרט XAR באמצעות מסך כדי להגביר את האות. עטוף את הקלטת עם ניילון נצמד או שקית ניילון ולאטום עם קלטת כדי לשמור את כפור. אחסן את הקלטת בלילה -80 ° C.

5. פיתוח XAR סרטים

  1. למחרת, להסיר קלטת מהמקפיא ולתת הפשרה בטמפרטורת חדר. לפתח את הסרט בחדר חושך באמצעות מעבד סרט על פי הוראות יצרן.
    הערה: בדוק את הסרטים לראיות של זוגות קינאז-מצע. חשיפה ארוכה יותר שנייה יכולה להיות שימושית גם כדי לזהות אירועי זירחון חלשים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נציגי תוצאות ממסך מוצגות באיור 2. 180 קינאז הוקרן באמצעות מצע פפטיד GST מתויג המתאים לaa 268-283 מCRTC2 כמו גם חלבון המיאלין מצע assay קינאז הקלאסי הבסיסי (MBP). רק שתי קינאזות, MARK2 וMARK3 קינאז הקשורים מאוד phosphorylated פפטיד CRTC2. MBP נכלל כבקרה פנימית בכל מבחני, כפי שהוא מכיל הרבה שאריות phosphorylatable ופועל ב -18 kDa, לכיוון החלק התחתון של הג'ל. זה מאפשר לפרשנות של סגוליות: כמה קינאז חסונה יהיה phosphorylate מצע וMBP. ראוי לציין כאן הוא שהבארות המכילות ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז הפרסומים המקוריים המתארים את הגישה 14,15, הספרייה המקורית של 180 GST-קינאז הורחבה 420 חברים, או ~ 80% מkinome החלבון האנושי. עם הספרייה המורחבת, הפרוטוקול כפי שתואר לוקח 4-5 ימים ולאחר מכן 1-4 ימים כדי לפתח סרטים (כהכרחי), אשר יכול להתקצר על ידי שימוש בphosphorimaging ושיפור אותות דיגיטלי. יש כמה שלבים עיקריים שבו יש להקפיד (ראה איור 1 לסקירה של פרוטוקול). ראשון, היא הבריאות של המניה של תאים (mycoplasma חופשי, לא אפשר להגיע למפגש בהרחבה, וטופל בטריפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSERC 386634. ברצוננו להודות לחברי המעבדה Screaton לדיונים מועילים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מאגר ליזהתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.1
10x מאגר קינאזתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.2
10x M-ATPתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.3
פלסמידים קינאז אנושייםOrfeome, Invitrogen, OrigeneGST מתויג בבית
96 צלחות בארFisher ScientificCS003595
293T תאיATCCCRL-11268
DMEMFisher ScientificSH3002201תוסף תזונה עם 100  פניצילין U/ml, 100  μ גרם/מ"ל סטרפטומיצין, 10% סרום עגל עוברי.
חממת CO2SanyoMCO-17AIC
15 ס"מ כלי תרבית תאיםפישר סיינטיפיק877224
מדיום סרום מופחתInvitrogen22600-050
מגיב טרנספקציה על בסיס ליפידיםInvitrogen11668-019
מתקן נוזלים אוטומטיThermo Scientific5840300
קובץ מצורף לקלטת קטנהThermo Scientific24073295
חיבור קלטת סטנדרטיThermo Scientific14072670
4 מ"מ pervanadateתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 3.1
0.25 M CaCl2תוצרת הבית
פיפטה רב-ערוצית (20-200 & #956; l)Labnetp4812-200
פיפטה רב-ערוצית (1-10 μ l)Thermo Scientific4661040
צלחות 6 בארות V-bottomEvergreen Scientific290-8116-01V
צלחות מצופות גלוטתיון 96 בארותFisher ScientificPI-15240
תנור היברידיזציהBiostad350355
GST מצע מתויגתוצרת בית
חלבון בסיסי מיאלין (MBP)SigmaM1891
פיפטה משחזרת (1 מ"ל)Eppendorf22266209
32P gamma-ATPPerkin ElmerBLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100  מ"ל)תוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.4
ג'ל TGX טרומי 26 בארותBioRad567-1045אחוז הג'ל הנדרש תלוי במשקל המולקולרי של המצע המעניין
כתם Coomassieתוצרת בית0.1% Coomassie R250, 10% חומצה אצטית, 40% מתנול
Coomassie destainתוצרת הבית10% חומצה אצטית, 20% מתנול
מיכלי ג'ל מסומניםתוצרת הביתמכסי פלסטיק משומשים מקופסאות קצה ריקות, גדולים מספיק כדי להכיל נייר סינון ג'ל אחד
Whatman FisherScientific57144
יריעות צלופן (2)BioRad165-0963
מייבש ג'לLabconco4330150
סרט אוטורדיוגרפיה תחליב כפולVWRIB1651454
קלטת סרטפישר מדעיFBAC-1417
מסך מתעצםפישר מדעיFBIS-1417
רולר גומי איטום צלחתסיגמאR1275

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).
  2. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
  3. Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
  4. Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
  5. Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
  6. Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
  7. Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
  8. Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
  9. Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
  10. Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
  11. Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
  12. Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247(2013).
  13. Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
  14. Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
  15. Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
  16. Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
  17. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase Substrate IdentificationHigh Throughput ScreeningGST Kinase PulldownProtein Kinase LibrarySubstrate Phosphorylation AnalysisGel ElectrophoresisAutoradiography DetectionKinase Specificity ValidationSignal Transduction MappingCell Based Validation

Related Articles