Method Article

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/53152

⸱

August 29th, 2015

 , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Sunnybrook Research Institute, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פלטפורמת הקרנה לזהות קינאזות חלבון האנושית ייעודית למצעי phosphorylated אשר יכול לשמש כדי להבהיר מסלולי העברת אותות רומן. הגישה שלנו כוללת שימוש בספרייה של קינאזות חלבון אנושי מתויג GST מטוהר ומצע חלבון רקומביננטי של עניין. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות קינאז MAP / microtubule ויסות זיקה 2 (MARK2) כקינאז לאתר מוסדר גלוקוז על-מוסדר CREB תעתיק Coactivator 2 (CRTC2), חלבון דרוש להתפשטות תאי ביתא, כמו גם משפחת אקסל של טירוזין קינאז כרגולטורים של גרורות תא על ידי זירחון של חלבון המתאם ELMO. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו ולדון איך זה יכול לעזור להקים מפה מקיפה של כמה תאים מגיבים לגירויים סביבתיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויי חלבון לאחר translational (PTMs) חיוניים לתקשורת תאית. אולי הכי טוב למדו מכל PTMs הוא זרחון, מזורז על ידי קינאז חלבון, המסדיר את מספר עצום של פונקציות חלבון, כוללים הפעילות ביוכימית שלהם, לוקליזציה subcellular, קונפורמציה, ויציבות. זיהוי של אתרי זירחון על חלבוני יעד יכול להתבצע על ידי מיפוי phosphopeptide tryptic או על ידי טכניקות proteomic עכשיו סטנדרטיות באמצעות דגימות מועשרים לפפטידים phosphorylated 1,2. בעוד שלושה רבעים מproteome הביעה צפויים להיות phosphorylated 3 וזיהה 200,000 אתרי זירחון 5, עם הערכות עד 1 מ'6, רבים מהם אי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים, צלחות, ותאים

  1. הפוך 500 מיליליטר חיץ תמוגה: 25 מ"מ טריס pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 50 מ"מ NAF, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 מ"מ בטא glycerophosphate, גליצרול 5%. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. מייד לפני השימוש, מוסיף dithiothreitol 1 מ"מ (DTT), פלואוריד 1 מ"מ sulfonyl phenylmethyl (PMSF), וvanadate נתרן 1 מ"מ. לאחר שלב זה, PMSF אינו נדרש בכל חיץ לשטוף.
  2. לעשות 20 מיליליטר של 10x קינאז מאגר: 200 מ"מ טריס pH 7.5, 50 בטא glycerophosphate מ"מ (FW 216), vanadate נתרן 2 מ"מ. Aliquot ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נציגי תוצאות ממסך מוצגות באיור 2. 180 קינאז הוקרן באמצעות מצע פפטיד GST מתויג המתאים לaa 268-283 מCRTC2 כמו גם חלבון המיאלין מצע assay קינאז הקלאסי הבסיסי (MBP). רק שתי קינאזות, MARK2 וMARK3 קינאז הקשורים מאוד phosphorylated פפטיד CRTC2. MBP נכלל כבקרה פנימית בכל מבחני, כפי שהוא מכיל הרבה שאריות phosphorylatable ופועל ב -18 kDa, לכיוון החלק התחתון של הג'ל. זה מאפשר לפרשנות של סגוליות: כמה קינאז חסונה יהיה phosphorylate מצע וMBP. ראוי לציין כאן הוא שהבארות המכילות .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז הפרסומים המקוריים המתארים את הגישה 14,15, הספרייה המקורית של 180 GST-קינאז הורחבה 420 חברים, או ~ 80% מkinome החלבון האנושי. עם הספרייה המורחבת, הפרוטוקול כפי שתואר לוקח 4-5 ימים ולאחר מכן 1-4 ימים כדי לפתח סרטים (כהכרחי), אשר יכול להתקצר על ידי שימוש בphosphorimaging ושיפור אותות דיגיטלי. יש כמה שלבים עיקריים שבו יש להקפיד (ראה איור 1 לסקירה של פרוטוקול). ראשון, היא הבריאות של המניה של תאים (mycoplasma חופשי, לא אפשר להגיע למפגש בהרחבה, וטופל בטריפ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSERC 386634. ברצוננו להודות לחברי המעבדה Screaton לדיונים מועילים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מאגר ליזהתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.1
10x מאגר קינאזתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.2
10x M-ATPתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.3
פלסמידים קינאז אנושייםOrfeome, Invitrogen, OrigeneGST מתויג בבית
96 צלחות בארFisher ScientificCS003595
293T תאיATCCCRL-11268
DMEMFisher ScientificSH3002201תוסף תזונה עם 100  פניצילין U/ml, 100  μ גרם/מ"ל סטרפטומיצין, 10% סרום עגל עוברי.
חממת CO2SanyoMCO-17AIC
15 ס"מ כלי תרבית תאיםפישר סיינטיפיק877224
מדיום סרום מופחתInvitrogen22600-050
מגיב טרנספקציה על בסיס ליפידיםInvitrogen11668-019
מתקן נוזלים אוטומטיThermo Scientific5840300
קובץ מצורף לקלטת קטנהThermo Scientific24073295
חיבור קלטת סטנדרטיThermo Scientific14072670
4 מ"מ pervanadateתוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 3.1
0.25 M CaCl2תוצרת הבית
פיפטה רב-ערוצית (20-200 & #956; l)Labnetp4812-200
פיפטה רב-ערוצית (1-10 μ l)Thermo Scientific4661040
צלחות 6 בארות V-bottomEvergreen Scientific290-8116-01V
צלחות מצופות גלוטתיון 96 בארותFisher ScientificPI-15240
תנור היברידיזציהBiostad350355
GST מצע מתויגתוצרת בית
חלבון בסיסי מיאלין (MBP)SigmaM1891
פיפטה משחזרת (1 מ"ל)Eppendorf22266209
32P gamma-ATPPerkin ElmerBLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100  מ"ל)תוצרת הביתראה פרוטוקול שלב 1.4
ג'ל TGX טרומי 26 בארותBioRad567-1045אחוז הג'ל הנדרש תלוי במשקל המולקולרי של המצע המעניין
כתם Coomassieתוצרת בית0.1% Coomassie R250, 10% חומצה אצטית, 40% מתנול
Coomassie destainתוצרת הבית10% חומצה אצטית, 20% מתנול
מיכלי ג'ל מסומניםתוצרת הביתמכסי פלסטיק משומשים מקופסאות קצה ריקות, גדולים מספיק כדי להכיל נייר סינון ג'ל אחד
Whatman FisherScientific57144
יריעות צלופן (2)BioRad165-0963
מייבש ג'לLabconco4330150
סרט אוטורדיוגרפיה תחליב כפולVWRIB1651454
קלטת סרטפישר מדעיFBAC-1417
מסך מתעצםפישר מדעיFBIS-1417
רולר גומי איטום צלחתסיגמאR1275

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).
  2. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttrans....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase Substrate IdentificationHigh Throughput ScreeningGST Kinase PulldownProtein Kinase LibrarySubstrate Phosphorylation AnalysisGel ElectrophoresisAutoradiography DetectionKinase Specificity ValidationSignal Transduction MappingCell Based Validation

Related Articles