מאמר שיטה

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53210

⸱

12 בספטמבר 2015

 ,  , 
1Department of Physiology & Membrane Biology, University of California Davis

במאמר זה

סיכום

טכניקת לנדיס המותאמת מאפשרת מדידה זוגית של המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלים בודדים במזנטריה של חולדות רגילות וחולדות מהונדסות גנטית בתנאי בקרה ובדיקה באמצעות טכניקות מיקרו-פרפוזיה. הוא מספק שיטה נוחה להערכת מנגנונים המווסתים את חדירות המיקרו-כלי דם וחילופי כלי דם בתנאים פיזיולוגיים.

תקציר

ניסויים כדי למדוד את תכונות חדירות של microvessels perfused בנפרד מספקים גשר בין החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים המסדירים חדירות כלי דם בmonolayers תרבית התא אנדותל ומאפייני תמורה הפונקציונליות של מיטות כלי דם שלמות. שיטה לcannulate וינקב microvessels venular של לפדר עכברוש ולמדוד את המוליכות הידראוליות של קיר microvessel מתוארת. הציוד העיקרי הדרוש כולל מיקרוסקופ intravital עם במה גדולה שונה, התומכת micromanipulators למצב את שלוש microtools שונה: (1) micropipette זכוכית משופעת לcannulate וינקב כלי-דם קטנים; (2) מיקרו-occluder זכוכית לחסום זמנית זלוף ולאפשר מדידה של זרימת מים בתנועת transvascular לחץ ההידרוסטטי נמדד, ו- (3) מוט זכוכית בוטה כדי לייצב את רקמות mesenteric באתר של cannulation. Techniq מיקרו-החסימה שונה לנדיסUE משתמש בתאים אדומים התלויים בperfusate המלאכותי כסמנים של תנועת נוזל transvascular, וגם מאפשר מדידות חוזרות ונשנות של זרמים אלה תנאי ניסוי כמשתנים והבדל לחץ האוסמוטי ההידרוסטטי וקולואיד פני microvessels נשלטות בזהירות. מדידות של מוליכות הידראוליות באמצעות ראשון perfusate שליטה, אז אחרי מחדש cannulation של אותו כלי-דם קטנים עם perfusates הבדיקה מאפשרות לזווג השוואות של תגובת microvessel בתנאים מבוקרים היטב אלה. ניסיונות להאריך את השיטה לmicrovessels בלפדר של עכברים עם שינויים גנטיים צפויים לשנות חדירות כלי דם היו מוגבלים בגלל היעדר microvessels ישר וunbranched הארוך בלפדר עכבר, אבל הזמינות האחרונה של החולדות עם שינויים גנטיים דומים באמצעות הטכנולוגיה / Cas9 CRISPR צפויה לפתוח אזורים חדשים של חקירה שבו ניתן ליישם השיטות שתוארו במסמך זה.

מבוא

Microperfusion בכלי הדם כרוך בהקמה מבוקרת זרימה של perfusate המלאכותי של הרכב ידוע באמצעות micropipette בכלי דם בדרך כלל פחות מ -40 מיקרומטר קוטר. כלי perfused נשאר בסביבת הרקמות הנורמלית שלה, והוא perfused עם הדם של החיה עד למועד cannulation. הפועל בשיתוף עם מגוון רחב של הדמיה וידאו או טכניקות fluorometric, בmicroperfusion האתר מאפשר מדידה של מים זורמים ומומס פני קירות microvessels בתנאים בהם הכוחות המניעים לזרמים אלה ידועים ותכונות החדירות של כלי דם הקיר יכולות להיות העריך באופן ישיר. יתר על כן, על ידי שליטה על הרכב הנוזלים המקיפים את כלי-דם קטנים ברקמות (perfusate וsuperfusate), הרגולציה של חדירות כלי-דם קטנים ובשערי חליפין יכולה להיחקר על ידי הפעלת תאי האנדותל המרכיבים את קיר כלי-דם קטנים להיחשף למגוון רחב של דוארתנאי xperimental (אגוניסטים, תנאי זלוף שונה, אינדיקטורים ניאון כדי למדוד את הרכב תאיים ואיתות) לתקופות שנמדדו בדיוק זמן (שניות לשעה). בנוסף, הערכות ultrastructural או cytochemical של מבנים מולקולריים תאיים מפתח המסדירים את המחסום יכולות להיחקר באותו microvessels בי חדירות נמדדות ישירות. הגישה ובכך יוצרת גשר בין החקירה של המנגנונים התאיים ומולקולריים לשנות תפקוד מחסום אנדותל בתרבית monolayers אנדותל תא והחקירה בmicrovessels שלמה. ראה את הביקורות להערכה נוספת 1-6 הבאה.

הגבלה של microperfusion היא שניתן להשתמש בו רק במיטות כלי דם, כי הם דקים, שקופים ויש לי שלמות מבנית מספיק כדי לאפשר cannulation עם micropipette זכוכית. בעוד חקירות מוקדמות משמשות microvessels צפרדע בלפדר ומטר אנגינה עורית דקuscle 7,8, בהרבה ההכנה הנפוצה ביותר במודלים של יונקים היא לפדר עכברוש 9-15. רוב החקירות התמקדו בשינויים חריפים בחדירות כלי דם למדו על פני תקופות של 1-4 שעות, אבל יותר חקירות האחרונות הורחבו למדידות על כלי פרט 24-72 שעות לאחר זלוף ראשוני 12,16. הטכנולוגיה שפותחה לאחרונה CRISPR, אשר מבטיחה להפוך את המודלים של עכברים מהונדסים גנטי יותר זמינים ללימוד תקנת חדירות כלי דם 17 צריכים לאפשר השיטות שתוארו בתקשורת זה להיות מיושמת בmicrovessels venular של לפדר במודלים של העכברים חדשים החשובים אלה.

השיטה דורשת מיקרוסקופ הפוך מצוידים בבמת מיקרוסקופ נבנה מותאם אישית גדולה מספיק כדי להכיל שתי הכנת בעלי החיים ולפחות שלוש micromanipulators משמשת לmicrotools העמדה קרוב לכלי perfused וליישר micropipette זלוף עם הכלילומן. לדוגמא פלטפורמה מותאמת אישית לבמת מיקרוסקופ XY (כ -90 × 60 סנטימטרים) יכולה להיות מפוברקת מפלדה בעובי 1 סנטימטר עם ציפוי חלודה הוכחה. השלב מחובר לשולחן מדד הנדסה או שתי שקופיות יונה-זנב רכובים בזוויות ישרות ונתמכות על עמודי טפלון או העברות כדור לתנועה במישור האופקי. אסדה טיפוסית (ראה איור 2) יש הרבה מן המשותף עם ציוד מיקרוסקופ וmicropositioning משמש למגוון רחב של ניסויי זרימת דם intravital כגון אלה כדי למדוד את זרימת דם חד כלי והמטוקריט, אספקת חמצן מקומית על ידי microvessels דם perfused, רגולציה של חלק בכלי דם טונוס שרירים, והצטברות כלי הדם המקומית של קליעים נותבים ניאון הוזרקו לכל מחזור. 18-26

ההיבט הבסיסי של הטכניקה הוא המדידה של נפח זרימה (J v) על פני שטח מוגדר שטח (S) של קיר כלי-דם קטנים. כדי להשיגזה באמצעות הטכניקה לנדיס שונה שתוארה במסמך זה מיקרוסקופ ההפוך פשוט הוא נאות. מצלמת וידאו קטנה היא רכובה על נמל התמונה ואות וידאו, עם בסיס זמן הוסיף, מוצג על צג וידאו ונרשם גם בצורה דיגיטלית במחשב או כאות דיגיטלית או אנלוגי במצלמת וידאו. ברגע שהכלי-הדם הקטן הוא cannulated החלק מהכלי-הדם הקטן הגלוי למצלמה ניתן לשנות על ידי הזזת הבמה ומניפולטורים כיחידה מבלי לשבש את cannulation.

מדידה של תזרימי transvascular יכולה גם להיות משולבת עם חקירות מפורטות יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוחכם עם מסננים מתאימים כגון אסדות המשמשות למדידות של חדירות מומסות, ניטור יחס ניאון של סידן cytoplasmic או מנגנונים תאיים אחרים, והדמיה confocal 6,12,13, 27. יתרון עיקרי של כל גישות microperfusion הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות, על אותו הכלי, תחת שינוי מבוקר של כוח מניע כגון לחצים ההידרוסטטי וoncotic, או שינוי מושרה בתגובות כלי למצבים דלקתיים. העיצוב הנפוץ ביותר הוא השוואה לזווג של מוליכות הידראוליות נמדדו (עמ 'יב) באותו כלי עם הכלי perfused הראשון באמצעות micropipette מלא perfusate שליטה והשעית התא האדום להקמת מדינת חדירות תחילת המחקר, ולאחר מכן עם טפטפת שני עם סוכן מבחן נוסף לperfusate. cannulations מרובה אפשרי עם המחזור חזר לאחר reperfusion עם פיפטה השליטה.

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את cannulation וmicroperfusion של כלי venular בלפדר עכברוש להקליט והנתיבים מים על פני קיר כלי-דם קטנים ולמדוד את p L של קיר הכלי, מדד שימושי של החדירות של המסלול המשותף למים ומומסים פני שלם מחסום אנדותל. ההליך נקרא techniq נדיס שונהUE כי העיקרון המקורי לנדיס של שימוש בתנועה היחסית של תאים אדומים כמדד להחלפת נוזל transvascular לאחר זלוף חסום נשמרה 28, אבל מגוון של תנאי ניסוי (למשל, הבדלים בלחץ ההידרוסטטי oncotic ואלבומין פני קיר כלי-דם קטנים) זמין לאחר microperfusion הוא הרבה יותר גדול מאשר בmicrovessels דם perfused uncannulated 8,29.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.

1. ייצור ראשוני של Micropipettes, Restrainers, וחוסמים

  1. משוך כמה צינורות נימי הזכוכית בורוסיליקט נקיים במחצית באמצעות חולץ אלקטרוני מותאם כך, כאשר משכו, החלק המתוח של הצינור הוא כ 1 ס"מ האורך ושני חצאים הם סימטריים במידה מסוימת. ודא שלהתחדד עולה בקנה אחד עם הממדים באיור 1. השתמש בשני חצאים לmicropipettes, restrainers וחוסמים.
    1. פוע micropipettes באמצעות גלגל שחיקה אוויר מונע 30 עם 0.5 מיקרומטר נייר מחוספס רחץ במים. הגדר את הזווית של בעל micropipette כך שזה בערך 30 מעלות מאופקיות.
    2. ביסודיות לשטוף ולייבש את micropipettes באמצעות יניקה למשוך אצטון הנקי באמצעות הקצה ועד הפיר. בדוק את micropipettes (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ זקוף קטן עם 4 × 40 × מטרות מצוידות בבעל micropipette קליפ התנין וreticle עינית.
    3. micropipettes בחר עם פתיחת טיפ כ -50 מיקרומטר ארוכים עם שיפוע שאורכו / רוחב יחס הוא בין 3.1 ו -3.5 ועם נקודה בחדות מחודדת אשר מסייעת לחדור את סיבי הקולגן הקשים בלפדר.
    4. אחסן 15-20 micropipettes בגדלים שונים מעט בתיבה נטולת אבק.
  2. הפוך restrainers באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימי זכוכית משך זמן קצר ליד microflame כדי ליצור קצה קהה (איור 1). אחסן כמה בקופסא ללא אבק.
  3. הפוך microoccluders באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימים משך תחת microflame ועדינות לכופף (באמצעות מתאם צינור, למשל., 23G) טיפ הנאה (כ 4 מ"מ מקצה) כדי להפוך את הזווית של קרוב ל 120 מעלות לפיר ( איור 1 ג). הפוך ולאחסן כמה.

2. הכנת בעלי חיים וניתוח

  1. הרדימי זכר (350-450 גר ') או Sprague-Dawley חולדות נקבות (200-300 גרם) עם נתרן pentobarbital (80-100 מ"ג / קילוגרם, סיגמא אולדריץ, P3761) באמצעות הזרקה תת עורית; להגן לפדר על ידי לא באמצעות זריקת intraperitoneal.
  2. לאורך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוניים, לשמור על הרדמה על ידי זריקות משלימות (30 מ"ג / קילוגרם) לפי צורך. לקבוע עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן או קרני. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, להרדים את העכברוש באמצעות מנת יתר של pentobarbital או הזרקה תוך לב של אשלגן כלורי רווי בהרדמה.

3. להכין פתרונות ואריתרוציטים לשימוש כסמני זרימה

  1. הכן את הפתרון של רינגר היונקים לsuperfusate ופתרון perfusate השליטה (בדרך כלל הפתרון של רינגר המכיל 10 מ"ג / מיליליטר חומצת שומן יונקיםאלבומין החופשי שור בסרום, BSA).
    1. perfusate סינון באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים זעירים שעלולה לחסום את קצה micropipette; לסנן לתוך מיכל נקי קטן.
  2. הכן אריתרוציטים על ידי ציור על 0.2 מיליליטר דם מוריד הזנב של העכברוש הרדים למחט 20G במזרק קטן המכיל 0.05 מיליליטר הפרין (1000 U / ml) ולהעביר לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות המכיל כ -14 פתרון של רינגר יונקים מ"ל פתרון .
    1. צנטריפוגה לארוז בעדינות תאים אדומים (כ 200 גרם × מקסימום 7 דקות). לצייר את supernatant מחדש להשעות את התאים האדומים בפתרון של רינגר.
    2. לאחר צנטריפוגה והסרת שלוש פעמים supernatant לעזוב את התאים אדומים ארוזים בחלק התחתון של הצינור לשימוש מאוחר יותר. שים לב שהליך זה מפחית טסיות perfusates הסופי פחות מ -0.1% מרמות נורמליות 31.

4. מסדרים את רקמות בבעלי החייםמגש

  1. לגלח את הבטן של החולדה הרדים ממתחת לטבור לתהליך xiphoid. ודא שהאזור המגולח משתרע סביב הצד הימני (לעכברוש הניח בצד ימין), כך ששיער אינו מהווה פתיל לצייר superfusate מתוך הרקמה היטב. להסיר שערות חתך עם תחבושת רטובה או רקמה.
    1. את העור עם מלקחיים משוננים בוטים ולעשות חתך מרכז-קו (ארוך 2-3 סנטימטר) דרך העור באמצעות מספריים חסון. באמצעות קנס מספריים (איריס) לעשות חתך דומה באמצעות alba Linea, הרמת דופן הבטן עם מלקחיים משוננים כדי למנוע נזק למעי.
    2. עם בעלי החיים בצד השני שלה על המגש של בעלי החיים, משוך בעדינות את הבטן מחלל הבטן באמצעות החלת כותנה שקצה (עץ מקל) ספוגה בתמיסת רינגר ומלקחיים משוננים בוטים. מסדרים את הבטן ברקמה כל כך טוב שלפדרו מונח על העמוד לצפייה מבעד למיקרוסקופ לטפל כדי למנוע נגיעה לפדר (potentially נזק microvessels) עם או מלקחיים או כותנה.
      הערה: מגש בעלי החיים (איור 2 א) ניתן לבנות מפלסטיק ודורשת רקמות היטב (למשל, קוורץ המלוטש בערך 2 סנטימטרים קוטר 5 מ"מ וגבוה.) (כ -3 מ"מ עמוק), עמוד ברור אופטי, וכרית חימום הותאם כדי לשמור על הטמפרטורה של בעל החיים. העובי של העמוד לא יעלה על מרחק העבודה של המטרה.
  2. מקם את מגש בעלי החיים על הבמה מיקרוסקופ כדי שלפדר גלוי דרך העיני.
  3. מקם קו טפטוף כובד-הפד Superfuse לפדר עם הפתרון של רינגר היונקים שמרו על 35-37 מעלות צלזיוס ברציפות. השתמש פדה גזה להחזיק הבטן במקום, לעזור לשמור על לחות, ופתיל הפתרון של רינגר העודף מעל פני השטח. התאם את הזרימה ולשאוב את השפכים כדי לשמור על עובי superfusate עקבי.
  4. לזהות microvessels venular היעד, שהםמגזרי unbranched במורד הזרם של זרימה מתכנס, ענפים אחד או שניים דיסטלי לנימים האמיתיות. מצא את כלי unbranched (באופן אידיאלי, 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך) שיש זרימת דם מהירה וחופשית של תאים לבנים דבק על קיר הכלי.
  5. מקם את כלי-דם קטנים מבחן במרכז שדה מיקרוסקופ ולעבור עוצר לעמדה בסמוך לאתר cannulation בחר.

5. מילוי micropipette והר במחזיק

  1. רק לפני cannulating, להשעות את התאים האדומים בperfusate. להוסיף 7 μl של תאים אדומים ארוזים 0.5 מיליליטר perfusate במבחנה ורוסיליקט נקייה. הערה: Hematocrits של 1-3% יכול לשמש, אבל המטוקריט עקבי יביא לריכוזי perfusate עקביים של כל חומרים שוחררו מהתאים האדומים.
  2. להתאים מזרק 1 מיליליטר עם מתאם צינור 23G וצינורות PE 50 (אורך סנטימטר 5-15). צייר את תערובת perfusate / אדום התא לתוך המזרק. הפוך מזרק לערבב ולגרש את כל הבועות מצינורות ומתאם. להתייעלות, צינורות לנכון כמה מזרקים לפני תחילת הניסוי ולשמור אותם בקופסא ללא אבק או שקית ניילון.
  3. מלא את micropipette על ידי קידום צינורות לתוך הסוף הגדול של micropipette עד שנוגע באזור המחודד. החל לדחוף מהיר עדין על בוכנת המזרק כדי למלא את קצה micropipette. הערה: זרם או טיפה זעיר צריך להיות גלוי בקצה לראיות מילוי מלא.
  4. למשוך את צינורות תוך דחיפה קלה על הבוכנה כדי למלא את החלק הרחב יותר של פיר micropipette. הסר בועות קטנות בפיר הרחב על ידי מצליף פיר micropipette בזהירות. הערה: הליך דומה כבר מאויר 32.
  5. מניחים את micropipette לבעל פיפטה עם יציאת צד המאפשר חיבור רציף לנוזל מד לחץ מים. ודא שבעל, שמצורף לדיסק הידראולי משמש לשליטה קידום יפה מאוד של micropipette, הוא בזווית קלה (15-25 מעלות)לאופקי כך שהקצה של להתחדד micropipette לא פגע בבטן או מגש.
  6. הר הכונן ההידראולי על micromanipulator ניד, שבו יש x, y, z וכוננים כדי לאפשר קרוב יישור לכלי בדיקה (איור 2).
  7. התאם את הלחץ ההידרוסטטי להחיל את הנוזל בmicropipette באמצעות מזרק או הנורה גומי מלא מים כדי לשנות את גובה נוזל בעמודת המים של מד הלחץ לכ -40 CMH 2 O מעל לפדר.
  8. Cannulate כלי-דם קטנים בהקדם האפשרי לאחר מילוי פיפטה; תאים אדומים ליישב לתחתית של פיפטה, כך שלאחר כ -40 דקות מעט מאוד תאים אדומים יזרמו לתוך הכלי.

6. מדידת לחץ Microcannulation וכלי הדם

  1. לפני מיצוב micropipette המלא תחת מיקרוסקופ, לחץ בעדינות על עוצר את הרקמה ליד כלי-דם קטנים הפעלת כוח מספיק כדי אחיזת הרקמה. צייר אתעוצר בחזרה, מעט מתיחת הרקמה בקנה אחד עם כלי-דם קטנים, כך שהלחצים בסיבי קולגן mesenteric מיושרים עם הכלי.
    1. יישר את micropipette עם הכלי ולהוריד אותו לעין דרך העיני. הנח את הקצה רק במעלה הזרם של אתר cannulation נבחר ומוריד אותה אל הרקמה, כך שהוא חוסם באופן חלקי זרימה בתוך הכלי, אבל לא לחסום אותו.
  2. Cannulate הכלי על ידי הנהיגה קצה פיפטה לאט לתוך לום הכלי באמצעות הכונן ההידראולי. היזהר שלא לדחוף דרך הצד התחתון של כלי השיט.
    הערה: כmicropipette נכנס ללום, perfusate מהירות שוטף את הדם בכלי מחוץ ללום וperfusate חופשיות זורם לתוך דיסטלי מחזור של בעלי החיים לכלי-הדם הקטן מבחן, עקירת חלק מזלוף הדם הנורמלי בכלי מורד הזרם.
  3. מנמיכים את לחץ זלוף על ידי התאמת מד הלחץ עד הדם (כפי שמצויןעל ידי התאים האדומים של בעלי החיים) נמשך בחזרה למגזר perfused; זה קובע את לחץ האיזון שבו התאים האדומים בעדינות להתנדנד בלומן הכלי ומודד את הלחץ ההידרוסטטי כלי-דם קטנים (P ג) בקצה הדיסטלי של מגזר כלי-דם קטנים. לשמור זלוף כלי בכל הלחצים מעל לחץ איזון זה.

7. Microocclusion ואיסוף נתונים

  1. שלב אופציונאלי: לפני השימוש במייקרו-occluder לחסום את הכלי, לחץ עליו לתוך הרקמה באזור בשימוש שאינו של לפדר רחוק מכל כלי, כך שהקצה מצטבר כרית קנס של רקמה שמגנה על הכלי הניסיוני במהלך מייקר חזר חסימות.
  2. מניחים את החוסם מעל כלי perfused ליד הקצה התחתון של שדה מיקרוסקופ.
  3. רשום את הבא עם וידאו ואודיו.
    1. מילולי להקליט את מיקומו של האתר ולחסום קצה המסך נמוך יותר כפי שניתן לראות בreticle העינית.
    2. עם טיפשל החוסם ממוקם בדיוק מעל כלי-דם קטנים, להשתמש בשליטת z הקנס של micromanipulator להוריד בעדינות את החוסם עד הזרימה בכלי הוא יחסום. שים לב ללחץ מד הלחץ (P ג) באודיו. החל חסימה בדרך כלל עבור 3-10 שניות, ולאחר מכן שחרר, שחזור זלוף החופשי. הזז את האתר לחסום את כלי לעבר קצה פיפטה ב5-10 מיקרומטר צעדים המבוססים על זמן (> 5 דקות אחרי בלוק ראשוני באתר), מספר החסימות (3-5), כדי למנוע נזק קיר כלי באתר הבלוק .

8. ניתוח של נתונים ומדידה של p L (חדירות מים)

  1. במהלך הפעלת וידאו, לקבוע את המרחק הראשוני (ℓ 0) מתא אדום סמן לאתר החסימה על ידי שימוש בתמונה של מיקרומטר במה והעמדות הידועות על התמונות. לקבוע את המהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של תא הסמן מתפקידו בכמה מסגרות בשנייה 3-10 של תמונות שתועדו. להרתיעשלי רדיוס הכלי (r) מהתמונות שצולמו במהלך חסימה (איור 3).
  2. לחשב J נ / S עבור כל חסימה כ× (dℓ / DT) (1 / ℓ 0) × (R / 2). חישוב p L בלחץ מתמיד כ( v J / S) מחולק בלחץ הנהיגה (לחץ כלי-דם קטנים - לחץ האוסמוטי קולואיד יעיל; ראה דיון).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 4 מראה את התוצאות מהמדידה במהלך השינויים בעמ L הזמן בחולדת venular microvessel cannulated ברציפות עם ארבע perfusates. 33 עמ 'גודל L מחושב בלחץ מתמיד שימש כמדד לשינויים בקיר חדירות כלי-דם קטנים, ראשון במדינה עם שליטת perfusate המכיל 1% אלבומין בסרום שור לאחר מכן כאשר כלי נחשפו לברדיקינין הסוכן הדלקתי (BK) באמצעות micropipette שני מכיל 10 ננומטר Bk. ברדיקינין גרם לעלייה חולפת בעמ L שחזרה לכיוון ערך שליטה דקות 10-1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרטים של חישובי p L. למרות שתנועת נוזל transvascular מתרחשת בזמן שהספינה היא perfused בחופשיות, משא ומתן כזה הוא קטן מכדי להימדד בזלוף החופשי משום שהוא בדרך כלל פחות מ 0.01% משיעור זלוף הכלי. עם זאת, כאשר זלוף הוא נעצר על ידי הגורם לחסימה זמני כלי-דם קטנים, זרימת transvascular (כלומר, סינון) נמדד מהתנועה של תאים אדומים סמן בלומן כטור של נוזל בין תאים אדומים סמן והאתר של חסימה מקצר כפי שמוצג ב איור 3. בהתאם למורכבות ואורכו של פרוטוקול נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות המענקים HL44485 וHL28607.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ, שולחן ושלב
מיקרוסקופ הפוך (סוג מטלורגי) עם ראש משולש לווידאו: דוגמהאולימפוסCK-40מנסה למקם עיניות גבוה יותר ביחס לבמה - אתה צריך להסתכל דרך עיניות תוך כדי הושטת יד לראש הבמה מעל מיקרומניפולטורים מתערבים
מיקרוסקופ הפוך (סוג מטלורגי) עם ראש משולש לווידאו: דוגמהLeicaDMILמנסה למקם עיניות גבוה יותר ביחס לבמה - אתה צריך להסתכל דרך עיניות תוך כדי הושטת יד לראש הבמה מעל מיקרומניפולטורים מתערבים
קוטר צר, מרחק עבודה ארוך מטרה: דוגמהNikon Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
שלב פלטפורמה---1/2 אינץ' או 1 ס"מ חנותריתוךזה צריך להיות כבד כדי להפחית את הרטט
שולחן Unislide xy: שקופיות זנב יונהVelmexAXY4006W1
VIDEO
CCD: דוגמהPulnixTM-7CN (כבר לא זמין)אין צורך בצבע
מערכת לכידת וידאו עם אודיו -
(מסגרת דוממת לחלוטין, תנועת מסגרת אחת)
קטן
מיקרופון מיקרומניפולטורים, מיקרומניפולטור מחזיקים
, XYZ (3)קודם/סטולטינג (כבר לא זמין)חפש Z משובח, וטווח גדול יותר של נסיעה בכוננים גסים כדי להקל על מיקום
כונן בדיקה הידראולי, כיווןאחד FHC50-12-1Cצריך לקנות כונן ידני או כונן אלקטרוני
כונן תוף ידני FHC50-12-9-02
או כונן הידראולי, תלת כיווניSiskiyou CorporationMX610 (חד כיווני) או MX630 (3 כיוונים)נהדר לזרועות קצרות, מלא במים ויש לשלוח אותו בחזרה למילוי ~ כל שנתיים
מחברים/מוטות/מחזיקיםSiskiyou CorporationMXC-2.5, MXB וכו'.
סיכהמגן Starrett162Cלהחזיק
מחזיק פיפטהמסנן מכשירי פרססיון עולמיMPH3
מד לחץ מים ~ 120 ס"מ
מגש
שקוף פרספקס למגש מיקרוסקופ לבעלי חיים
3/4 אינץ 'דיסק קוורץ מלוטש ~ 1/4 אינץ' גובהקוורץ סיינטיפיק בע"ממותאם אישית ( או פרספקס מלוטש, זכוכית); ודא שהגובה קטן ממרחק העבודה של
דבק פרספקס אובייקטיבי (ריתוך 4: זהירות מסרטן)
דבק רפואי לבאר רקמותNuSilMED-1037
שטיח חום גומי סיליקון לכל מטרה, 5 אינץ' L x 2 אינץ' WCole ParmerEW-03125-20מחמם למגש מיקרוסקופ - זקוק לכבל ובקר - גרסת 240V זמינה
מתאם כבל חשמל לתנורי חימום וערכות קפטון, 6 רגל, 120 וולטAC Cole ParmerEW-03122-75
STACO 3PN1010B בקר מתח משתנה, 10 A; 120 וולט פנימה, 0-140 וולט החוצהקול פארמרEW-01575-00
ייצור
חולץ פיפטה אנכיSutter Instrument CompanyP-30 עם נימה ניכרום
1.5 מ"מ OD צינורות נימיים דקיםSutter Instrument CompanyB150-110-10
מטחנת פיפטה אבן אוויר ומיקרוסקופ דיסקציה - ראה הפניה בטקסטאו רכוש חבילה מ- Sutter Instruments או World Precision Instruments
RX Honing Machine, System IIRX Honing Machine CorporationMAC-10700 Rx System IIחלופה לאבן אוויר, שימוש עם מיקרוסקופ מנתח המותקן בזווית
    עם דיסק השחזה קרמיRX Honing Machine Corporationהשתמש "כפי שהוא" או צרף
יריעות סרט חיפוי, 0.3 או 0.5 um3Mחלק מס' 051144 80827268X יריעות סרט חיתוך אימפריאלי עם גב דבק - ניתן לרכוש מאמזון
פלדה מצלמת וידאו מערכת השמעת וידאו גנרית מיקרוסקופפיפט

מקורות

  1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
  2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
  4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
  5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
  6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
  7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
  8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
  9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
  10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
  11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
  12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
  14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
  15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
  16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
  17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
  18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
  19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
  20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
  21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
  22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
  23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
  24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
  25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
  26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
  27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
  28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
  29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
  30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
  31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
  32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
  34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
  35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
  36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
  37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
  38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
  39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
  40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
  41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
  42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
  43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

genetically modified

מאמרים קשורים