כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

סיכום

אנו מדווחים על שיפורים משמעותיים במדידה הניתנת לשחזור של מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס לאחר חשיפה של עכברים לגורמים פוטנציאליים המזיקים ל-DNA.

תקציר

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע היא כלי רב עוצמה כדי לכמת באוכלוסיית תאים קריטית אם, ובאיזו מידה, כימי יכול לגרום למוטציות שעלולות לגרום לסרטן. השימוש בassay האנזימטית לכמת מוטציות בתאי גזע בגן dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X כבר דווח בעבר. ¹ שיטה זו דורשת ההכנה של חלקים ודגירה קפוא של הרקמה מחולק עם תערובת תגובה כי תשואות צבע כחול אם התאים לייצר אנזים פונקציונלי dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט (G6PD). אם לא, התאים להופיע לבנבן. יש לנו שונה תערובת התגובה באמצעות מדיום אופטימלי מתחם טמפרטורת חיתוך (אוקטובר) במקום של אלכוהול פוליוויניל. זה מקל על מדידת pH, מגביר solubilization של רכיבי צביעת G6PD ומגביל דיפוזיה של אנזים G6PD. על מנת להוכיח כי מוטציה התרחשה בתאי גזע, כל קריפטה חייבת חסר אנזימטי G6PDפעילות. רק אם תאי גזע נמלי מוטציה G6PD פנוטיפי כל הצאצאים בקריפטה תחסר פעילות האנזימטית G6PD. לזהות מאורות עם מוטציה בתאי גזע, ארבעה חלקים רצופים סמוכים קפוא (רמה) נחתכו ב 7 מיקרומטר עוביים. גישה זו של ביצוע חתכים סמוכים מספקת קונפורמציה שכוך היה מוטציה באופן מלא מאז אותו קריפטה מוטציה יקויימו בחלקים סמוכים. שקופיות עם דגימות רקמה שהיו בהפרש של יותר מ -50 מיקרומטר היו מוכנות להעריך כולל של> 10 ⁴ מאורות לכל עכבר. תדירות המוטציה היא מספר מאורות הנצפים מוטציה (לבן) ÷ במספר סוג בר מאורות (כחולים) בקבוצת טיפול.

מבוא

הוא חשב לסרטן מעי גס לערב חשיפה לגורמים סביבתיים ורכיבים תזונתיים שיכול לגרום נזק לדנ"א ולייצר הפעלת מוטציות סומטיות באונקוגנים (למשל, SS-קטנין) או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן (למשל, APC). הנחה היא כי המוטציות קריטיות הללו מתרחשות בתאי גזע במעי הגס. בגלל ארכיטקטורת קריפטה הייחודית של האפיתל המעי הגס, אפשר למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס לאחר חשיפת בעלי חיים לכימיקלים הקשורים לסרטן מעי גס. אנזימים צמודים X כמה יכולים לשמש כמדדים למוטציות המתרחשות בתאי גזע, כמו המוטציות תהיה נוכחת בכל התאים בתוך כוך.

בעבר, הליך פורסם הוכחה כי כימיקלים שגורמים לגידולים במעי הגס בעכברים גם נוצרו מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס באמצעות ניתוח של מוטציות בdehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X הגן (G6PD). ^1-3השיטה מכמתת את השכיחות של מוטציות סומטיות אקראיות בתאי גזע במעי הגס ללא כל לחץ בחירה. ההליך כרוך הייצור של חלקי מעי גס קפוא מבולבל מעכברים שטופלו ובקרה וזיהוי של מאורות חסרי תאים המייצרים פעילות G6PD פונקציונלית. מאורות אלה שעברו מוטציה, אשר מופיעים לבן, מצביעים על כך שהמוטציה התרחשה בתאי גזע שהולידו צאצאים גם מחסה גן שעבר מוטציה G6PD. בassay האנזימטית, מאורות המוטציה deficient G6PD לא יכולים לחמצן גלוקוז 6-פוספט, אשר נדרש להפחתת tetrazolium ניטרו הכחול (NBT). כאשר אנזים G6PD הוא פונקציונלי, NBT בתערובת הכתמים מצטמצם formazan ומשקעים לא מסיסים, צבירה במיקום של האנזים ותאים "הכתמה" כחולים. תאים שמוטציות G6PD להישאר לבנבן בניגוד למאורות סוג כחולים מוכתמים פראיים. שיטה זו מודדת מוטציות שיש פנוטיפ "null". בגלל enzymes, כגון G6PD, יכול לפזר את התאים בסעיף רקמה מבולבל אם החלקים ממוקמים בתמיסה מימית, יש צורך לייצב את האנזים בסעיפי הרקמות להיות מנותחים. ⁴ הייצוב של האנזים ב רקמה אסור להפריע לדיפוזיה של מולקולות מגיב קטנות נחוצות לתגובה האנזימטית G6PD.

עשינו מספר השינויים המשמעותיים בהליך המקורי. הבינוני לצביעה האנזימטית הקריטית השתנה מאלכוהול פוליוויניל למתחם אופטימלי טמפרטורת חיתוך (אוקטובר), המאפשר שליטת pH וsolubilization של הרכיבים המשמשים assay. הצביעה מתבצעת באמצעות 0.4-0.5 מיליליטר בארות עשויות מנקי פלדה, כך שכל קטע רקמה קיבל את אותו הנפח של תערובת תגובת G6PD. הליך פותח כדי להעריך את מספר מאורות בסעיף הדמיה המספק דגימה גדולה של רקמת המעי הגס מבלילספור ידני> 10 ⁵ מאורות עבור כל מעי גס. הניתוח של 7 מיקרומטר סעיפי רקמות סמוכים מאפשר הדמיה של קריפטה מוטציה בשקופית אחד או יותר, אשר מפחיתה חפצים מכתים פוטנציאליים. שינויים אלה הופכים את ההליך יעיל יותר ושחזור.

שימוש בפרוטוקול מתוקן זה, יש לנו לכמת את תדירות המוטציה בתאי גזע במעי הגס לאחר החשיפה של C57Bl / 6 עכברים לazoxymethane, סרטן מעי גס ידוע במכרסמים. ^5-7

פרוטוקול

הפרוצדורות והטיפול אתי בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג IACUC (פרוטוקול # 1,104,674).

1. הכנת תערובת מכתים G6PD

הערה: ודא שהריכוז הסופי של כל ריאגנטים הוא כדלקמן; 5 מ"מ glucose-6-פוספט (G6P); 2 מ"מ NADP, 5 מ"מ MgCl _2, 0.35 סולפט 1 מ"מ-methoxy-5-מתיל methylphenazinium (MMPMS) ו0.8 מ"מ NBT. ^1,8,9 לכל מגיב הריכוז הראשוני נגזר ל40 מיליליטר נפח סופי. פתרונות היו מוכנים טריים ומשמשים בכל יום.

1. הוסף 2 מיליליטר של 200 מ"מ 7.4 חיץ pH פוספט (PB) ל -35 מיליליטר של מדיום אוקטובר בצינור 50 מ"ל ולנער במרץ. ודא עם נייר pH שהפתרון הוא ~ pH 7.4. אם לא לבטל את הפתרון.
2. הוסף 61 G6P מ"ג מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ"מ PB, 61 מ"ג NADP מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ"מ PB, ו -41 מ"ג MgCl ₂ מומס ב0.96 PB מיליליטר של 100 מ"מ. לאשרר שpH הוא ~ 7.4 שנינותנייר pH שעות. אם לא ~ 7.4, לבטל את הפתרון.
3. הוסף 5 מ"ג של MMPMS מומס ב0.25 מיליליטר של 200 מ"מ PB (pH 7.4). במרץ לנער את תערובת תגובה וכתוצאה מכך ליצור homogenate אדום כהה ברור. אם הפתרון הוא עכור, צריכה להיות מושלכת התערובת. הצינור המכיל תערובת התגובה הוא עטוף בנייר כסף כדי למזער את החשיפה לאור. אחסן את תערובת התגובה ב RT ואילו הרכיב הסופי, NBT, מוכן.
4. הכן בנפרד פתרון 5 מ"מ NBT על ידי הוספת 0.4 מיליליטר פוראמיד דימתיל נטול מים (DMF) ו -0.4 מיליליטר אתנול נטול מים ל- 164 מ"ג של NBT בצינור 2 מיליליטר עם מכסה O-טבעת. לסגור את המכסה באופן רופף (לא סגור היטב) ולהביא את הפתרון לרתיחה באמבטית שמן עד NBT הוא בפתרון. ⁸
5. לאפשר NBT solubilized להתקרר לRT ולאחר מכן להוסיף את כל הפתרון לתערובת תגובת OCT ולנער במרץ כדי להשיג פתרון ברור. שים לב לשינוי בצבע פתרון מכתום-אדום ראשונית לאדום כהה או purpצבע le לאורך זמן. זה נורמלי.
6. מניחים את תערובת כתמי G6PD הסופית בC חדר חם 37 מעלות במשך שעה 1 לפני השימוש.

2. בעלי חיים טיפול ואוסף רקמות

1. פנק את עכברי זכרים 6 שבועות בן C57Bl / 6 עם סוכן מזיק DNA, למשל, 10 מ"ג / קילוגרם azoxymethane (AOM) בהיקף של 200 μl PBS על ידי הזרקת IP. פנק את עכברי שליטה עם 200 μl של PBS על ידי הזרקת IP.
2. לאחר 90 יום, להרדים עכברים על ידי CO ₂ מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם כפי שאושר על ידי פרוטוקול IACUC.
3. לפתוח בניתוח בחלל הבטן מבדיוק מעל פי הטבעת לבסיס של עצם החזה. הזז את המעי הדק מתוך חלל הגוף אבל לא לכרות אותו. בלו המעי התחתון, ממש מתחת לcecum לפי הטבעת. ¹⁰
4. פורס בזהירות בצד אחד של המעי הגס באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה ולהסיר צואה מהמעי הגס נפתח על ידי שטיפה עם PBS סטרילי הנקי. רול שוויצרי הבלומעי גס ד עם צד luminal פונה החוצה, והמקום בעובש רקמה. ¹⁰
5. לחלוטין לטבול את המעי הגס בתבנית בינונית ומקום אוקטובר בדיואר המכיל נוזל N _2. להחזיק את התבנית כך שבסיס הפלסטיק הוא רק במגע עם הנוזל N ₂ עד בינוני אוקטובר קפוא מוצק.
6. אחסן את גוש הרקמה הקפוא ב -80 עד חיתוך חלקים קפואים. אין להשתמש בכל מקבע, אשר יביא לאיון של אנזים G6PD.

3. הכנת סעיפים קפואים

1. לחתוך קטעי רקמה קפוא בעובי של 7 מיקרומטר באמצעות cryostat ב-25 מעלות צלזיוס. חותך 4 7 מיקרומטר סעיפים רצופים ומקום שניהם על אותו השקופית (איור 1). הכן 2 שקופיות, או ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים לייצג רמה אחת של המעי הגס (איור 1).
2. חזור לרמה הבאה עם מרחק מינימאלי של> 50 מיקרומטר מהחלק האחרון של יחסי הציבוררמת evious. מרחק זה הבטיח כי מאורות העריכו לכל רמה לא לשכפל אחד לשני.
3. לעתים קרובות לנגב את להב cryostat עם 100% אתנול להסיר את שאריות אוקטובר שמצטברת במהלך חיתוך. לפני חתך יתחדש, הלהב היבש ניגב עם גיליון מייבש אנטי-סטטית להתפוגג מטען סטטי שנצבר. שקופיות חנות עם החלקים קפואים ב -80 ^o C.

4. הכתמה של רקמה קפואה סעיף

1. בצע את תגובת היסטוכימיה האנזים בחדר חם 37 ° C עם לחות גבוהה.
   הערה: ניסיון התגובה האנזימטית בתנור דגירה או על חם שקופית הובילה לצביעת G6PD עניה ועולה בקנה אחד.
2. לבנות בארות מכתים רקמות באמצעות שני 1.5 סנטימטרים X מנקי פלדה 0.15 סנטימטר (גובה X הקוטר פנימי) שמחובר יחד באמצעות גריז סיליקון (איור 1). חותך את parafilm כדי להתאים את הבסיס של היטב עם המרכז לגזור והמקום גםד על קטע הרקמה בשקופית.
   הערה: parafilm על החלק התחתון של מכונת הכביסה יוצרת חותם בין השקופיות ומכונת הכביסה ששומרת את תערובת כתמי G6PD צמיגה בסעיף הרקמה. מבנה זה נותן גם עם 0.4-0.5 מיליליטר נפח, כך שכל קטע רקמה במחקר מקבל את אותו הנפח של תערובת כתמי תגובת G6PD.
3. דגירה שקופיות רקמה קפוא ב 37 ^o C בחדר חם למשך 10 דקות. על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף את תערובת התגובה מכתימה G6PD היטב כל אחד קטע רקמה (2 סעיפים לכל שקופית) ל45-50 דקות. הסר שקופיות מחדר חם, ולהרים בזהירות את בארות נירוסטה מהשקופיות.
4. שקופיות הגדר בקצה הארוך שלהם כדי לאפשר את מדיום התגובה לניקוז. מגלשות מקום ב100 מ"מ PB (pH 7.4) במשך 30-60 דקות להסיר את תערובת התגובה מכתימה G6PD מהרקמה מבלי להפריע צביעת הרקמות. לצלול שקופיות במים מזוקקים למשך 5-10 דקות כדי להסיר מלחי PB
5. חותם את הרקמה על ידי תוספתing fluoro-ג'ל מטפטף על הרקמות ומחכים ~ 30 דקות לייבוש. למנוע בועות שיכולים לבלבל את זיהוי של מאורות שעברו מוטציה.
   הערה: אם בועות טופס, ההליך ניתן לחזור לאחר הסרת fluoro-ג'ל על ידי שריה במים מזוקקים. אין להשתמש בתלושי כיסוי כפי שהם נוטים בועות אוויר מלכודת.

5. קביעת מאורות Mutant G6PD ותדירות המוטציה

1. לנתח שקופיות עבור מאורות מוטציה G6PD תחת מיקרוסקופ אור.
   הערה: הקריטריונים המשמשים לזיהוי קריפטה מוטציה מלאה היו: (i) כל הכוך היה נטול צבע הכחול; (Ii) המבנה החיצוני של הכוך היה שלם, (iii) קריפטה המוטציה נצפתה על 7 מיקרומטר חלקים סמוכים ו, ​​(iv) שני משקיפים היו לזהות את אותו כוך כמוטציה. מוטציות שנצפו על 7 מיקרומטר סעיפים סמוכים נספרות כמוטציה אחת.
2. תמונה כל קריפטה המוטציה G6PD ב40X הגדלה ולקטלג את התמונות באמצעות מצלמה 5.0 מגה פיקסל עםתוכנת הדמיה.
3. לכמת את המספר הכולל של מאורות נבחנו בעכבר על ידי בחירת סעיף נציג לכל עכבר מהרמה עם השטח הקטן ביותר פני השטח ותמונתו בהגדלה 10x (איור 1 ג).
   הערה: רמה מייצגת ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים (איור 1D), אשר בשל הקרבה שלהם לעתים קרובות להראות מוטציה מאורות בסעיף אחד או יותר. הרמות מופרדות על ידי> 50 מיקרומטר לדמיין מאורות מאזורים שונים של המעי הגס.
4. לפתוח כל קובץ תמונה וחזותי לספור את מספר מאורות ברמה על ידי ניתוח הקבצים (כפי שמוצגים בתיבות תרשים 1C). קבצי תמונות ישתנו במספר מאורות נצפו מנמוך כמו 20 עד> 300 מאורות בקובץ אחד.
5. הכפל את המספר הכולל של מאורות מהרמה הנבחרת (איור 1 ג) לכל עכבר במספר הרמות הוקרנו למאורות מוטציה G6PD עבור כל מעי גס. לדוגמא, ספירה כוללת של1,250 מאורות לרמה שנבחרה מוכפלים 8 רמות הוקרנו למאורות מוטציה שווים ספירה כוללת של 10,000 מאורות. להעריך מינימום של 10,000 מאורות עבור כל מעי גס לניתוח סטטיסטי.
6. מערבבים את מספר מוטציות שנצפו בכל בעלי החיים במספר הכולל של מאורות הוקרנו לחשב MF עבור כל טיפול. רמת MF תאי גזע רקע בעכברים שלא טופלו היא <0.1x10 ^-4 (טבלת 1), שהוא קרוב לזה שדווח בעבר בC57Bl / 6 עכברים. ¹¹

תוצאות

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס בבעלי חיים מספקת דרך ייחודית, כדי לקשר בין מוטציות גיוס הסרטן. בדרך כלל, ההנחה היא כי הצעד הקריטי בהיווצרות הסרטן כרוך הפעלת מוטציות באונקוגנים ו / או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן. אנחנו הזרקנו C57Bl / 6 עכברים עם 200 μl של PBS או 10 מ"ג / קילוגרם AOM ב200 μl של PBS. AOM הוא חומר מסרטן מעי גס ידוע. ^5-7 בימים 90 הנקודות של נותחו למוטציות בתאי גזע. הפעם נדרש כדי לאפשר לתאי גזע לאכלס קריפטה באופן מלא, ורק כאשר כל קריפטה אינו ...

דיון

לעתים קרובות השפעת genotoxic של מתחם נקבעה על ידי יכולתה לשנות DNA. זה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד הרקמות ומדידת הרמה הגלובלית של adducts DNA. לAOM, זה יהיה כרוך בכימות O ⁶ -methylguanine adducts במעי הגס. שימוש במידע בגישה זו על נזק בתוך סוגי תאים ספציפיים, כגון בנישת תאי גזע, הולך לאיבוד. בנוסף, adduct DNA הוא לא אותו הדבר כמו מוטציה מאז קבוצה קטנה בלבד של adducts מומרות סופו של דבר למוטציות קבועות. ¹² אנו מספקים במסמך הפרטים לכמת מוטציות בתאי גזע reproducib...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
ניטרובלו טטרזוליום
NADP
גלוקוז-6-פוספט
1-מתוקסי-5-מתילפנאזיניום מתיל סולפט
דימתיל פורממיד
פוספט בופר (pH 7.4
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)
מיקרוסקופ אור ציוד
מצויד במצלמה
קריוסטט
חדר חם