Method Article

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

DOI:

10.3791/53240

⸱

September 25th, 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים על שיפורים משמעותיים במדידה הניתנת לשחזור של מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס לאחר חשיפה של עכברים לגורמים פוטנציאליים המזיקים ל-DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע היא כלי רב עוצמה כדי לכמת באוכלוסיית תאים קריטית אם, ובאיזו מידה, כימי יכול לגרום למוטציות שעלולות לגרום לסרטן. השימוש בassay האנזימטית לכמת מוטציות בתאי גזע בגן dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X כבר דווח בעבר. 1 שיטה זו דורשת ההכנה של חלקים ודגירה קפוא של הרקמה מחולק עם תערובת תגובה כי תשואות צבע כחול אם התאים לייצר אנזים פונקציונלי dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט (G6PD). אם לא, התאים להופיע לבנבן. יש לנו שונה תערובת התגובה באמצעות מדיום אופטימלי מתחם טמפרטורת חיתוך (אוקטובר) במקום של אלכוהול פוליוויניל. זה מקל על מדידת pH, מגביר solubilization של רכיבי צביעת G6PD ומגביל דיפוזיה של אנזים G6PD. על מנת להוכיח כי מוטציה התרחשה בתאי גזע, כל קריפטה חייבת חסר אנזימטי G6PDפעילות. רק אם תאי גזע נמלי מוטציה G6PD פנוטיפי כל הצאצאים בקריפטה תחסר פעילות האנזימטית G6PD. לזהות מאורות עם מוטציה בתאי גזע, ארבעה חלקים רצופים סמוכים קפוא (רמה) נחתכו ב 7 מיקרומטר עוביים. גישה זו של ביצוע חתכים סמוכים מספקת קונפורמציה שכוך היה מוטציה באופן מלא מאז אותו קריפטה מוטציה יקויימו בחלקים סמוכים. שקופיות עם דגימות רקמה שהיו בהפרש של יותר מ -50 מיקרומטר היו מוכנות להעריך כולל של> 10 4 מאורות לכל עכבר. תדירות המוטציה היא מספר מאורות הנצפים מוטציה (לבן) ÷ במספר סוג בר מאורות (כחולים) בקבוצת טיפול.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוא חשב לסרטן מעי גס לערב חשיפה לגורמים סביבתיים ורכיבים תזונתיים שיכול לגרום נזק לדנ"א ולייצר הפעלת מוטציות סומטיות באונקוגנים (למשל, SS-קטנין) או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן (למשל, APC). הנחה היא כי המוטציות קריטיות הללו מתרחשות בתאי גזע במעי הגס. בגלל ארכיטקטורת קריפטה הייחודית של האפיתל המעי הגס, אפשר למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס לאחר חשיפת בעלי חיים לכימיקלים הקשורים לסרטן מעי גס. אנזימים צמודים X כמה יכולים לשמש כמדדים למוטציות המתרחשות בתאי גזע, כמו המוטציות תהיה נוכחת בכל התאים בתוך כוך.

בעבר, הליך פורסם הוכחה כי כימיקלים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוצדורות והטיפול אתי בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג IACUC (פרוטוקול # 1,104,674).

1. הכנת תערובת מכתים G6PD

הערה: ודא שהריכוז הסופי של כל ריאגנטים הוא כדלקמן; 5 מ"מ glucose-6-פוספט (G6P); 2 מ"מ NADP, 5 מ"מ MgCl 2, 0.35 סולפט 1 מ"מ-methoxy-5-מתיל methylphenazinium (MMPMS) ו0.8 מ"מ NBT. 1,8,9 לכל מגיב הריכוז הראשוני נגזר ל40 מיליליטר נפח סופי. פתרונות היו מוכנים טריים ומשמשים בכל יום.

  1. הוס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס בבעלי חיים מספקת דרך ייחודית, כדי לקשר בין מוטציות גיוס הסרטן. בדרך כלל, ההנחה היא כי הצעד הקריטי בהיווצרות הסרטן כרוך הפעלת מוטציות באונקוגנים ו / או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן. אנחנו הזרקנו C57Bl / 6 עכברים עם 200 μl של PBS או 10 מ"ג / קילוגרם AOM ב200 μl של PBS. AOM הוא חומר מסרטן מעי גס ידוע. 5-7 בימים 90 הנקודות של נותחו למוטציות בתאי גזע. הפעם נדרש כדי לאפשר לתאי גזע לאכלס קריפטה באופן מלא, ורק כאשר כל קריפטה אינו .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעתים קרובות השפעת genotoxic של מתחם נקבעה על ידי יכולתה לשנות DNA. זה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד הרקמות ומדידת הרמה הגלובלית של adducts DNA. לAOM, זה יהיה כרוך בכימות O 6 -methylguanine adducts במעי הגס. שימוש במידע בגישה זו על נזק בתוך סוגי תאים ספציפיים, כגון בנישת תאי גזע, הולך לאיבוד. בנוסף, adduct DNA הוא לא אותו הדבר כמו מוטציה מאז קבוצה קטנה בלבד של adducts מומרות סופו של דבר למוטציות קבועות. 12 אנו מספקים במסמך הפרטים לכמת מוטציות בתאי גזע reproducib.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש הסופרים לא תודות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ריאגנטים
ניטרובלו טטרזוליום
NADP
גלוקוז-6-פוספט
1-מתוקסי-5-מתילפנאזיניום מתיל סולפט
דימתיל פורממיד
פוספט בופר (pH 7.4
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) 
מיקרוסקופ אור ציוד
מצויד במצלמה
קריוסטט
חדר חם 
5 מגה פיקסל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
  2. Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Colonic Stem CellsG6PD MutationMutation FrequencyFrozen SectionsEnzymatic AssayOCT MediumLight MicroscopyCrypt AnalysisSomatic MutationsStem Cell Quantification

Related Articles