דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי. על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב עם יתרונות הגלומים שיש לו את הפוטנציאל להפוך את דג הזברה מודל מיושם באופן נרחב למחקר של הומאוסטזיס אנרגיה והשמנת יתר. גדליו הקטנים של דג הזברה מאפשר למבחנים בעוברים להתנהל במתכונת צלחת 96 או 384 גם, טכנולוגיות מבוססות Morpholino וCRISPR לקדם קלות המניפולציה גנטית, וטיפול תרופתי על ידי יישום אמבטיה הוא בת קיימא. יתר על כן, דג הזברה הן אידיאלי עבור מסכי גנטיים קדימה ומאפשרים לגילוי גנים חדש. בהתחשב בחידוש היחסי של דג הזברה כמודל להשמנה, יש צורך לפתח כלים שמנצלים באופן מלא את היתרונות הללו. בזאת, אנו מתארים שיטה למדידת הוצאה אנרגטית באלפי דג הזברה העוברית בו-זמנית. פיתחנו פלטפורמת microplate בעלי החיים שלמה שבו אנו משתמשים 96-גם צלחות לבודד את הדגים בודדים ואנו מעריכים NADH 2 ייצור מצטבר באמצעות כדאיות תרבית תאים הזמינות המסחרית מחדשסוכן alamarBlue. בpoikilotherms היחסים בין NADH 2 ייצור והוצאת אנרגיה קשור בחוזקה. assay ההוצאה אנרגיה זו יוצר פוטנציאל למסך במהירות מניפולציות תרופתיות או גנטיות הישירות לשנות הוצאה אנרגיה או לשנות את התגובה לתרופה שימושית (למשל רגישות לאינסולין).
מבוא
העכבר הוא כיום המודל הדומיננטי למחקר השמנה. מרווח הדור הקצר וכלים גנטיים זמינים בעכבר היו אח ורע עד כה. עם זאת, דג הזברה יש גם מרווח קצר דור (3 - 4 חודשים) ועולה אפילו העכבר בקלות המניפולציה גנטית 1,2. דג הזברה שומרת כמעט 90% מהגנים של יונקים, ואילו עלה בהרבה על העכבר במספר הצאצאים והפוטנציאל לשימוש במסכים גנטיים וסמים 3.
כדי לנצל את הפוטנציאל של מודל דג הזברה ללימודים בהשמנה יתר, מבחני חייבים להיות מפותחים כדי לחקור גורמים המשפיעים על ויסות משקל גוף, כוללים הוצאה אנרגיה. כמעובדים מטבוליטים באמצעות β-חמצון וחמצן מחזור חומצת tricarboxylic הוא נצרך וNADH 2 מיוצר. לפיכך, NADH 2 הוא מדד ישיר לשטף של מטבוליטים דרך מסלולים מטבוליים (חמצון המטבוליט). בpoikilotherms, H + לדלוף דרך הממברנה של המיטוכונדריה הפנימית, שuncouples NADH 2 חמצון מסינתזת ATP, היא 4 - 5 פי נמוך יותר מאשר בhomeotherms 4. בהתאם לכך, בNADH דג הזברה 2 קשורים מאוד הדוק לייצור ATP באמצעות זרחון חמצוני. בזאת, אנו מתארים assay המודד NADH 2 ייצור בדג הזברה זחל כמדד להוצאת האנרגיה 5.
צריכת חמצן היא תקן הזהב למדידת הוצאות אנרגיה. ובכל זאת, כדי לנצל את פוטנציאל תפוקה הגבוה של דג הזברה הטוב ביותר, מבחני של הוצאה האנרגיה חייבים להיות נוחים לתפוקה גבוהה. מערכות צריכת חמצן שתלוי בחדר סגור במחזור המערכת מוגבלות בתפוקה במספר התאים זמינים 6. O האוויר הפתוח 2 הצריכה / CO 2 מבחני הפקה גם יושמו ב5,7 דג הזברה. בסיס צלחת אלה באוויר פתוח 96-היטבמערכות ד נוחות לתפוקה גבוהה. למרבה הצער, חילוף גזים עם הסביבה מגביל את רגישות של מבחני אלה. לאחרונה פרסמו את היישום של assay המנטר NADH 2 באמצעות מחוון חיזור alamarBlue 5. assay זה מתגבר על המגבלות בתפוקה וברגישות משותפת לניתוחים של צריכת חמצן בדג הזברה.
דג הזברה הופכת מודל חשוב יותר ויותר ללימודים של הומאוסטזיס אנרגיית גוף כולו. בחלקו, כי דג הזברה הם נוחים לשימוש במסכים גנטיים קדימה ומסכי סמים. יתר על כן, ממוקד מניפולציה גנטית, כולל מציאה ולדפוק ב, יכול להיות מיושם במהירות. הראינו בעבר כי assay זה יכול להיות משולב עם יישום תרופת אמבטיה ומציאה גנטית או נוקאאוט לזהות תרכובות וגנים שמשנים את קצב חילוף חומרים 5. יתר על כן, assay זה נועד לנצל את היתרונות הגלומים לתפוקה הגבוהה דג הזברה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות מאוניברסיטת אריזונה משרד להתנהגות אחראית של מחקר ואושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים
1. גידול דג הזברה ותחזוקת העובר
- הכן בינוני עובר E3 8. כדי להפוך את פתרון מניות 60x, לפזר 34.8 גרם NaCl, 1.6 גר 'KCl, CaCl 5.8g 2 ● 2H 2 O, וגרם 9.78 MgCl 2 ● 6H 2 O ב1.95 L ddiH 2 O. התאם ל- pH 7.2 באמצעות NaOH וHCl התאם נפח 2 ליטר באמצעות ddiH 2 O.
- להכין מדיום עובר 1x E3, לדלל 16.5 מיליליטר 60x המניה ב 1 L ddiH20. הוספה 100 μl 1% מתילן כחול.
- רבייה
- זכר הבית והמנייה נקבה להרהר (7-18 חודשים של גיל) בנפרד על מנת למקסם את הפוריות.
- הפעל את האורות 1 - 2 שעות לפני היום לפני ביצים הרצויות. הזדווגות להגדיר (זכר 1 ו1 - 2 נקבות) בגכלובי רוסינג כפי שתוארו קודם לכן 9. כלובי חצייה לאפשר לביצים לברוח טריפה כשהם עוברים דרך הבסיס המחורר של להכניס את הטנק שבו הדגים הבוגרים מתקיימים.
- אופציונאלי:. לרבייה מתוזמן, (כפי שניתן היו דרוש למחקרים שכלל הזרקת morpholino), להפריד את הזכר ונקבת דג על ידי מחלק פלסטיק שקוף, הסר זה בבוקר כדי לגרום הנחת מתוזמן של הביצים והפריה. לmorpholino לימודים, לבצע חישובי כוח להעריך את מספר הדגים עובריים הנדרשים לטיפול. ללא הערכה של גודל אפקט או וריאציה, משפט ראשוני ניתן להפעיל עם n = 8.
- יוצקים את הביצים מהכלוב מעבר לצלחת פטרי (100 - צלחת פטרי 150 עוברים / 10 סנטימטרים). לאפשר את הביצים להתיישב לתחתית הצלחת ויוצקים את המים. הסר את כל מים שנותרו בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה. להוסיף בחזרה בינוני עובר E3 שנעשה בשלב 1.1.
- הפוך AFפיפטה הצולעת המלוטשת חד פעמית לביצת עתיד והעברת דגים. בעזרת מספריים, לחתוך פיפטה העברה חד פעמית סיימה בסיום 0.25 מיליליטר. כדי להסיר את קצוות גסים, פולני להבת קצה החתך מעל מבער בונזן.
- לשמור על דגים עובריים עד 4 ימים לאחר הפריה (DPF) ב -10 סנטימטרים בצלחות פטרי במדיום עובר E3 דג הזברה על 28.5 ○ ג פעמיים בכל יום, להשתמש בלהבה מלוטשת סיימה פיפטה העברה חד פעמית כדי להסיר כל ביצים מופרות או עוברים מתים (מראה אטום לבן). ברגע שכל יום, להחליף בינוני עובר E3. יוצקים את מדיום עובר E3, להסיר נוזל שנותר בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה, ולהוסיף גב בינוני מחומם מראש (28.5 ○ C) E3 עובר.
2. הכן Assay פתרון
- הכן את פתרון assay לפי טבלת 1. פתרון assay סינון סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני assay ייזום, לחמם את פתרון assay סטרילי ב28.5 ○ גאמבטיית מים.
| מַרכִּיב | % מסך הכל | נפח (μl / 10 מיליליטר) |
| העובר בינוני 60x E3 | 1.667 | 166.7 |
| deionized זוגי H (DDI) 2 0 | 96.233 | 9,623.3 |
| Alamar הכחול | 1 | 100 |
| 400 מ"מ NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
טבלת 1. Assay בינוני
.3 בצע Assay
- יש לשטוף את עוברי דג הזברה 3 פעמים עם מדיום עובר סטרילי המסונן E3. מערבבים את כל עוברי דג הזברה קיימא מהמצמד לתוך כוס. סינון סטרילי 75 מיליליטר בינוני עובר E3. בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה, מחדשלהעביר כמה שיותר מבינוני עובר E3 מעוברי דג הזברה ככל האפשר. להוסיף חזרה 20 מיליליטר בינוני עובר סטרילי מסונן E3. להסיר ולהחליף בינוני עובר E3 3 פעמים.
- צלחת דגים 1 לכל 93 בארות של שחור 96-גם צלחת צדדית ברור תחתונה. מעבירים את הדג לצלחת העוברי על ידי בנפרד לכידת עובר בתוך להבה מלוטשת סיימה פיפטה העברת פלסטיק חד פעמית (שלב 1.5) ובעדינות ולהוציא לתוך הבאר. העבר את מדיום עובר E3 נלקח מהכוס המכילה דגים שטפו לתוך 3 הבארות ריקות. הדבר מבטיח כי בארות ריקות נחשפו לאותו מים כבארות המכילות דגים. שתי הבארות המכילות דגים ובארות ריקות צריכה להיות לפחות חצי מלאה (200 μl) בסיומו של שלב זה.
- החלף בינוני עובר E3 עם פתרון assay בכל 96 הבארות, כולל בארות ריקות. צעד זה צריך להתבצע בטור 1 בזמן לכל אחד מ -12 העמודים בצלחת גם 96. שימוש בטיפ נאה טרנס חד פעמיפיפטה FER, להסיר בינוני עובר E3 מכל טוב בטור אחד של הצלחת (8 בארות). יש להיזהר שלא לגעת בעובר דג הזברה. להוסיף 300 μl של פתרון assay היטב כל אחד מהמים שהוסרו. חזור על הסרת בינונית עובר E3 והחלפה עם פתרון assay לכל 12 העמודים של הצלחת.
- אופציונאלי: כדי לבדוק את שינוי קצב חילוף חומרים בתגובה למתחם, להפוך את פתרון שהוא פי 100 (100X) ריכוז הטיפול הרצוי. ראוי לציין, להבטיח כי הפתרון 100x אינו עולה על 10% DMSO להגביל את ריכוז DMSO הסופי ללא יותר מ -0.1%. הוסף 3 μl של פתרון 100x לכל אחד מבארות הטיפול.
הערה: לבצע חישובי כוח להעריך את מספר בארות טיפול. עם זאת, ללא אומדן הגודל של תגובה או וריאציה, משפט ראשוני ניתן להפעיל במתחם 8 טופל ו8 בארות שליטה ברכב שטופל המכילות דגים.- הוסף 3 μl של שליטה ברכב לביקורת (ללא DRUטיפול ז) בארות המכילות דגים. כדי להבטיח שתגובת הניאון למתחם היא תוצאה של פעולות בתוך הדגים, חלים טיפולים תרופתיים ורכב עד 3 בארות ריקות בצלחת גם 96.
- קראו צלחת מלאה דגים על קורא צלחת ניאון עם גל עירור ב530 ננומטר ואורך גל פליטה ב590 ננומטר.
- צלחת מקום לחממת humidified מוגדרת 28.5 ○ C (לשמור על צלחת בחושך לאורך assay כדי למנוע photobleaching של פתרון assay). Assay ניתן להפעיל לתקופות הזמן שנעו בין שעות 1 עד 24 שעות. משך assay תלוי במטרה של המחקר. לבדיקת התגובה למתחם קצר משחק שאינו יציב זמן קצר עשוי להיות מתאים ביותר. עם זאת, לבדיקות יציבה מתחם או בדיקות של השפעות גנטיות, למקסם את משך assay עדיף לנצל את היתרונות הקשורים לאות המצטברת.
- בנקודת זמן שנקבע מראש (ראה שלב 3.6 כדי לקבוע עיתוי)לקרוא הקרינה של צלחת מלא דגים שוב עם אותן ההגדרות כמו שלב 3.5.
4. להעריך את השינוי היחסי בקרינה הקשורים לטיפול
- חישוב שינוי בקרינה של כל אחד גם על ידי הפחתת הקרינה בזמן 0 מהקרינה בסיומו של המחקר. ולס ללא דגים (חסר) צריך להיות ערכים ליד 0, הרבה מתחת לערכים מבארות המכילות דגים.
שינוי בקרינה = הקרינה במסקנה - הקרינה בזמן 0 - כדי לברר את השינוי היחסי בקרינה, לחשב את השינוי הממוצע בקרינה לבארות שליטה אז לחלק את השינוי בקרינה של כל אחד גם על ידי השינוי הממוצע בקרינה של בארות השליטה. ראוי לציין, בקרות יכולות להיות גם בקרות רכב או בקרות גנטיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פתרון assay אינו מגדיל הקרינה בהיעדר דגים עובריים (איור 1). עם זאת, assay הוא רגיש מאוד לשינויים קטנים בקצב חילוף חומרים בתוך הבאר. דגים יחידים בתוך היטב יוצרים אות שונה באופן משמעותי מבארות ריקות בתוך שעה 1 (P <0.0001). איור 2 מספק ייצוג חזותי של אותות שנוצרו על ידי דגים עובריים לאחר 24 שעות של דגירה. לצורך תמונה זו בארות צדדיות ברורות היו בשימוש. ובכל זאת, בארות צדדיות שחורות הם העדיפו לביצועי assay כדי למנוע שטיפה של אות הניאון מבארות סמוכות...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זיהום בחיידקים או פטריות יגביל מאוד יישום של assay זה. מתילן הכחול במדיום עובר E3 מגביל את האפשרות של זיהום פטרייתי. לאורך עובר גידול זה קריטי, כי הטיפול נלקח כדי להסיר עוברים מתים פעמיים בכל יום. בנוסף, זה חיוני כדי לשטוף ביסודיות את העוברים עם מדיום עובר E3 סטרילי ביום החניכה assay. 2 שלבים הבאים להגביל את הפוטנציאל לזיהום חיידקים של העוברים. ההכללה של בארות ריקות המתוארות בשלב 3.2 מאפשרת זיהוי של כל זיהום חיידקים. זיהום חיידקים שמניב אות מדידה הוא נדיר. עם זאת, אם אתה עושה את ה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לד"ר רוג'ר קון וצ'או ז'אנג על תרומתם לאימות היישום של מבחן זה כפי שפורסם בעבר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | מיוצר על ידי Thermo Scientific |
| Fine Tip חד פעמי העברת פיפטה | פישר סיינטיפיק | 13-711-26 | מיוצר על ידי Thermo Scientific |
| Fisherbrand בוגר העברה חד פעמית | פיפטה פישר סיינטיפיק | 13-771-9AM | מיוצר על ידי Thermo Scientific |
| צלחות תחתון שקופות שחורות דופן 96 בארות | פישר סיינטיפיק | 50-320-785 | מיוצר על ידי E& קיי סיינטיפיק פרודקטס בע"מ |
מקורות
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545(2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549(2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
