אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Summary

חלבוני מעטפת גרעינית ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים והיו מעורבים במגוון מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר חדש מבוסס Cre/Lox המאפשר בקרה מרחבית-זמנית של שיבוש מתחמי LINC.

Abstract

נדידה גרעינית ועיגון בתוך רקמות מתפתחות ובוגרות מסתמכת במידה רבה על מכלולי חלבון מקרומולקולריים גדולים הנקראים LInkers של שלד הנוקלאוס ושלד הציטו (קומפלקסים LINC). פיגומי חלבון אלה משתרעים על פני המעטפת הגרעינית ומחברים את פנים הגרעין לרכיבים של השלד הציטופלזמי שמסביב. קומפלקסים של LINC מורכבים משתי משפחות חלבונים שמורות אבולוציונית, חלבוני Sun ו-Nesprins המכילים מוטיבים של חתימה מולקולרית C-terminal הנקראים תחומי SUN ו-KASH, בהתאמה. חלבוני שמש הם חלבונים טרנסממברניים של הממברנה הגרעינית הפנימית שהתחום הנוקלאופלזמי ה-N-terminal שלהם מקיים אינטראקציה עם הלמינה הגרעינית בעוד שתחומי ה-SUN הטרמינליים C שלהם בולטים לתוך החלל הפרה-גרעיני ומקיימים אינטראקציה עם תחום KASH של Nesprins. לאיזופורמים קנוניים של נספרין יש מסוף N בגודל משתנה המקרין לתוך הציטופלזמה ומקיים אינטראקציה עם מרכיבי השלד הציטולוגי. פרוטוקול זה מתאר אימות של אסטרטגיית עכבר טרנסגנית שלילית דומיננטית המשבשת אינטראקציות SUN/KASH אנדוגניות באופן ספציפי לסוג התא. הגישה שלנו מבוססת על מערכת Cre/Lox העוקפת חסרונות רבים כגון קטלניות סביב הלידה ופנוטיפים לא אוטונומיים של תאים הקשורים למודלים של קו הנבט של השבתה של קומפלקס LINC. מסיבה זו, מודל זה מספק כלי שימושי להבנת תפקידם של מתחמי LINC במהלך ההתפתחות וההומאוסטזיס במגוון רחב של רקמות.

Introduction

מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א 'וב' מסוג lamins ^1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחות של חלבונים הטרנסממברני נפרד מNE: חלבוני שמש (Sad1 / Unc84) וNesprins (גרעיני המעטפה SPectRINS). ביונקים, ar Sun1 וSun2חלבונים הטרנסממברני דואר של INM שN-מסוף nucleoplasmic אזור אינטראקציה ישירות עם A- וlamins B-סוג ^3-5. בצד השני של INM, בתוך PNS, חלבוני שמש נמל מתיחה שימור האבולוציוני של ~ חומצות אמינו 150 C-מסוף נקראות תחום SUN. תחומים SUN אינטראקציה ישיר עם קאש-שימור אבולוציוני (Klarsicht / Anc-1, עברו" הומולוגיה) תחום, החתימה המולקולרית של Nesprins. תחומים קאש מורכבים ממתיחה של ~ 30 חומצות אמינו C-מסוף שבולטת לתוך PNS ואחריו תחום הטרנסממברני ^6. לפחות ארבעה גנים שונים Nesprin (Nesprin1-4) לקודד קאש המכיל חלבונים שלמקם בNE ^7. אזורי cytoplasmic של Nesprins, הגדלים משתנים מ~ 50kDa (Nesprin4) למדהים 1,000 kDa (ענק Nesprin1), מכילים spectrin מרובה חוזר כמו גם מוטיבים מסוימים המאפשר האינטראקציה שלהם עם רכיבי cytoskeletal כגון אקטין, plectin ומנועים מולקולריים ^{8 13.}

מחקרים בבעלי חוליות וחסרי חוליות הראו כי Lamin / מנועים מולקולריים שמש / Nesprin / מהווים "ציר" אבולוציונית שימור שליטה הגירה ומעגן גרעיניים. מודלים עכבר נוק-אאוט כמה (KO) של רכיבים מורכבים LINC תוארו וסייעו במתן מסגרת להבנת התפקידים של חלבוני שמש וNesprin בNE במהלך התפתחות יונקים ^9,14,15. עם זאת, מודלים אלה כמה חסרונות הנוכחיים משמעותיים, בעיקר: 1) קושי בפרשנות פנוטיפים בשל תא השפעות חד-אוטונומיות, 2) קושי בהבחנה תרומות phenotypical של קאש המכילים לעומת קאש-פחות Nesprin isoforms ^16, 3) יתירות פונקציונלית של חלבוני שמש וNesprin בNE בסוגים רבים של תאים דורשת תוכניות רבייה מורכבות כדי להשבית את כל אינטראקציות SUN-קאש בעכברים ¹⁷ ו -4) קטלני סביב הלידה של עכברים החסרות לקאש-תחום של שניNesprins1 ו -2 מונעים את הניתוח של מבוגרים פנוטיפים ^18.

פרוטוקול זה מתאר מודל רומן עכבר נועד לשבש את כל אינטראקציות SUN-קאש in vivo, בתא אופן אוטונומי ומוסדר מבחינה התפתחותית, ובכך עוקף רב של החסרונות שתוארו לעיל. Cre / מודל עכבר מבוסס לקס זה מסתמך על שני מושגים חשובים: 1) תחום קאש של כל חלבון Nesprin ידוע מספיק כדי למקד EGFP לNE במערכות תרבית תאים ו -2) תחומים SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש, כך ביטוי יתר של כל תחום קאש יהיה להרוות כל תחומי SUN אנדוגני ולהשבית מתחמי LINC באופן דומיננטי שלילי ¹⁷ (איור 1). פרוטוקול זה מתאר קצירת רקמה ומדרגות עיבוד משמשות כדי לאשר את השיבוש של כל אינטראקציות SUN-קאש בתאי פורקינג 'במוח הקטן.

Protocol

הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.

1. גידול העכבר וGenotyping

1. להתרבות עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) עכברים עם Tg (PCP2-Cre) לייצר Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. הערה: בעוד שאר פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בקו Tg העכבר (PCP2-Cre) כדי להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי פורקינג בתוך המוח הקטן, הליך דומה יכול להיות אחריו עם כל עכבר אחר Tg (Cre) ( איור 2 א).
2. בצע genotyping לזהות גורי מחסה שני transgenes EGFP וCre כפי שתואר קודם לכן ^19.

2. הכנת חומרים לאוסף Dissection ורקמות

1. הכן של סוכרוז 30% PBS (30 סוכרוז גרם / 100 של 1x PBS מיליליטר) ולאחסן 100 מיליליטר ב -20 ° C. היום של ח הרקמהarvesting, הפשרה ועומס ~ 30-35 מיליליטר של תמיסת סוכרוז לתוך מזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial.
2. הכן 40 מיליליטר של PFA 4% בPBS (10 מיליליטר 16% paraformaldehyde ו -30 מיליליטר PBS). טען ~ 30-35 PFA מיליליטר של 4% למזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial.
3. מלא את צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר של PBS לנתיחה רקמה.
4. הכן קוקטייל קטמין / xylazine בהיקף של 16 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -3 מ"ג / מיליליטר xylazine.
5. הכן פתרון של 70% אתנול לנתיחה.

3. Dissection ואוסף רקמות

1. באמצעות מזרק 1 מיליליטר, להזריק 500 μl של קוקטייל קטמין / xylazine לכל 25 גרם של משקל גוף ולחכות ~ 15 דקות. לחלופין, להשתמש בשיטת הרגעה אישרה מוסדי אחרת שמתאימה למערכת הביולוגית של עניין.
2. על ההרגעה, בעדינות לצבוט כפה האחורית כדי לאשר את חוסר תגובה לכאב, להצמיד את כל כפות על מגש קלקר עם צד הגב שלהעכבר כלפי מטה.
3. לרסס את הבטן עם 70% אתנול ולעשות חתך מהבטן התחתונה לחלק העליון של כלוב הצלעות כדי לקבל גישה ללב.
4. לעשות חתך קטן בעלייה הימנית של הלב ולהכניס את המזרק המכיל תמיסת סוכרוז 30% לתוך החדר השמאלי של הלב.
5. Perfuse הפתרון בשיעור של ~ 2-5 מיליליטר לדקה. כאשר ריק, להסיר את המזרק וחזור עם 4% פתרון PFA.
6. להוציא סיכה העכבר ממגש הקלקר ולערוף כדי לגשת למוח.
7. הסר את העור סביב ראשו של בעל החיים באמצעות מלקחיים ומספריים. נקבו חור בחלק האחורי של הגולגולת עם מחט ולהסיר בזהירות את הגולגולת עם מספריים ומלקחיים לנתח.
8. ברגע שהמוח הוא בבירור נגיש, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח הקטן ולמקם אותו ב- PBS. לחצות את המוח הקטן במטוס sagittal עם אזמל ולהעביר לפתרון סוכרוז 30% לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. הערה: כדי prepהקטעים פרפין, לתקן את המוח הקטן לילה ב 4 מעלות צלזיוס PFA 4% לפני הטבעה וחתך רקמות.

4. עיבוד רקמות וחתך

1. הכן תרחיף של קרח יבש ווטאן 2-מתיל. לאפשר את הטמפרטורה של האמבטיה לאזן במשך 5 דקות.
2. מלא cryomold עם מתחם OCT ולמקם את מחצית המוח הקטן החצוי לתבנית.
3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח וזוג מלקחיים עמדת המוח הקטן, כך שהמשטח החצוי (ליד קו האמצע של המוח הקטן) פונה כלפי מעלה.
4. העבר את cryomold לslurry הקרח היבש במשך 5 דקות עד למתחם אוקטובר יצר לבנה מטריצה ​​מוצקה סביב דגימת הרקמה. הערה: כעת ניתן לאחסן הדגימה הקפואה ב -20 ° C אם נדרש.
5. התווית מראש שטופלה שקופיות פולי-ליזין לאיסוף קטעי רקמה ולהכין את cryostat פי הוראות היצרן כדי לאסוף 15 מיקרומטר חלקים של והנוזלbellum. כדי לאסוף את החלקים, פנה בזהירות את סעיף אוקטובר עם הצד המצופה פולי-ליזין של השקופית. כדי לשמר את הכיוון של הסעיף, לא לסובב את השקופיות במהלך שלב זה.
6. סעיפי רקמות חנות ב -20 ° C עד שתמשיך עם כתמים והדמיה.

5. מכתים והדמיה של המוח קטן סעיפים

1. הכן את הפתרונות לפני מכתים הרקמות הבאים:
   ~ 50 מיליליטר של PBS
   ~ 5-10 מיליליטר של PFA 4% ב- ​​PBS
   ~ 10-20 מיליליטר של 0.5%, 10% חמורים בדם Triton X-100 ב PBS
2. חלקי המוח הקטן הפשרה. חשוב לציין, לצמצם את החשיפה שלהם לכל מקור של אור רציף והאינטנסיבי כדי למנוע דהייה של EGFP.
3. באמצעות עט מחסום הידרופובי, לצייר מלבן סביב סעיפי רקמות.
4. פוסט לתקן את החלקים עם PFA 4% במשך 5 דקות. השתמש מספיק נוזלי כדי לכסות את כל השטח שמסומן על ידי המחסום הידרופובי (בדרך כלל ~ 500 μl). באמצעות ואקום או פיפטה, מחדשלהזיז את מקבע להיות זהיר במיוחד שלא להפריע את סעיפי רקמות.
5. עם טפטפת, בעדינות להחיל PBS בשקופית מבלי להפריע סעיפי רקמות. לאחר 5 דקות להשתמש בוואקום או פיפטה כדי להסיר את הנוזל בזהירות. חזור על PBS לשטוף כולל של שלוש פעמים.
6. בעזרת פיפטה, להחיל בזהירות את הדילול המתאים של נוגדנים עיקריים (3 μl Calbindin ו / או נוגדן Nesprin2 לμl 900 של פתרון) ב 0.5% X-100, 10% חמורים בדם טריטון בPBS. דגירה של שעה אחת בטמפרטורת חדר בחושך.
   הערה: EGFP-KASH2 יהיה גלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הישיר על חלקים קפואים, ואין צורך להשתמש בנוגדן אנטי-EGFP. עם זאת, אם חלקי פרפין ערוכים, הדמיה של EGFP-KASH2 דורשת immunodetection עם נוגדן אנטי-EGFP.
7. הסר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS שלוש פעמים.
8. הכן 1: 1,000 דילולים של נוגדנים משני Alexa-פלואוריד ב 0.5% Triton X-100,10% חמורים בדם בPBS וחנות בחושך.
9. להסיר בעדינות ולשטוף PBS הסופי ולהחיל את דילול נוגדנים משני במשך שעה אחת בחושך.
10. הסר את פתרון נוגדנים משני, לשטוף ולשטוף את הסעיף שלוש פעמים. במידת הצורך, יחול כתם גרעיני, כגון DAPI (~ 300nM), במהלך יישום PBS הראשון.
11. להסיר לחלוטין את פתרון PBS מרחבי הרקמה והמקום ~ 5-7 μl של ההרכבה תקשורת בקטע הרקמה. מניחים coverslip זכוכית על גבי קטע הרקמה ומניח בצד ל~ 15-30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
12. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסננים המתאימים לדמיין EGFP וכל אורכי גל אחרים מתאימים לנוגדנים משני המשמשים בצעדים 5.8 / 5.9. בפרוסות המוח הקטן, להשתמש אובייקטיבי 20X כדי להציג המכון גרעיני EGFP-KASH2.

Results

פרוטוקול זה ממחיש את התועלת של (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) מודל עכבר Tg להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את ...

Discussion

השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבות מולקולריות של התא וגרגיר של המוח הקטן (איור 2). כמו כן, על מנת למקסם את כל פנוטיפים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית חשוב לזהות מתח Cre עם ביטוי Cre נרחב על פני סוג התא של עני...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סוכרוז	סיגמא אולדריץ'	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% תמיסת פרפורמלדהיד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	15710
OCT תרכובת	רקמה-טק	4583
שקופיות הידבקות	StatLab	M1000W
סרום חמור	סיגמא אולדריץ'	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
נוגדן נגד קלבינדין	סיגמא אולדריץ'	C9848
נוגדן נגד EGFP	Abcam	ab13970
נוגדן			שתואר בעבר בהפניה 21
הרכבה פלואורסצנטית מדיה	Dako	S3023
2-מתיל בוטאן	סיגמא אולדריץ'	O3551