חלבוני מעטפת גרעינית ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים והיו מעורבים במגוון מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר חדש מבוסס Cre/Lox המאפשר בקרה מרחבית-זמנית של שיבוש מתחמי LINC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא
במאמר זה
סיכום
תקציר
נדידה גרעינית ועיגון בתוך רקמות מתפתחות ובוגרות מסתמכת במידה רבה על מכלולי חלבון מקרומולקולריים גדולים הנקראים LInkers של שלד הנוקלאוס ושלד הציטו (קומפלקסים LINC). פיגומי חלבון אלה משתרעים על פני המעטפת הגרעינית ומחברים את פנים הגרעין לרכיבים של השלד הציטופלזמי שמסביב. קומפלקסים של LINC מורכבים משתי משפחות חלבונים שמורות אבולוציונית, חלבוני Sun ו-Nesprins המכילים מוטיבים של חתימה מולקולרית C-terminal הנקראים תחומי SUN ו-KASH, בהתאמה. חלבוני שמש הם חלבונים טרנסממברניים של הממברנה הגרעינית הפנימית שהתחום הנוקלאופלזמי ה-N-terminal שלהם מקיים אינטראקציה עם הלמינה הגרעינית בעוד שתחומי ה-SUN הטרמינליים C שלהם בולטים לתוך החלל הפרה-גרעיני ומקיימים אינטראקציה עם תחום KASH של Nesprins. לאיזופורמים קנוניים של נספרין יש מסוף N בגודל משתנה המקרין לתוך הציטופלזמה ומקיים אינטראקציה עם מרכיבי השלד הציטולוגי. פרוטוקול זה מתאר אימות של אסטרטגיית עכבר טרנסגנית שלילית דומיננטית המשבשת אינטראקציות SUN/KASH אנדוגניות באופן ספציפי לסוג התא. הגישה שלנו מבוססת על מערכת Cre/Lox העוקפת חסרונות רבים כגון קטלניות סביב הלידה ופנוטיפים לא אוטונומיים של תאים הקשורים למודלים של קו הנבט של השבתה של קומפלקס LINC. מסיבה זו, מודל זה מספק כלי שימושי להבנת תפקידם של מתחמי LINC במהלך ההתפתחות וההומאוסטזיס במגוון רחב של רקמות.
מבוא
מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א 'וב' מסוג lamins 1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.
1. גידול העכבר וGenotyping
- להתרבות עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) עכברים עם Tg (PCP2-Cre) לייצר Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. הערה: בעוד שאר פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בקו Tg העכבר (PCP2-Cre) כדי להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי פורקינג בתוך המוח הקטן, הליך דומה יכול להיות אחריו עם כל עכבר אחר Tg (Cre) (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה ממחיש את התועלת של (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) מודל עכבר Tg להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבות מולקולריות של התא וגרגיר של המוח הקטן (איור 2). כמו כן, על מנת למקסם את כל פנוטיפים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית חשוב לזהות מתח Cre עם ביטוי Cre נרחב על פני סוג התא של עני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים לצוות ליבת המורפולוגיה וההדמיה, של ליבת הגנטיקה המולקולרית (מחלקת עיניים ומדעים חזותיים) ושל עכבר הגנטיקה Core באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס בית הספר לרפואה. המחברים נתמכים על ידי תכנית המענק הקטנה ממרכז מקדונל לתאי ומולקולרית לנוירוביולוגיה, מרכז התקווה להפרעות נוירולוגיות, העין הלאומית (# R01EY022632 לDH), National Eye Institute מרכז Core גרנט (# P30EY002687) ו מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון למחלקת עיניים ומדעים חזותיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ' | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% תמיסת פרפורמלדהיד | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710 | |
| OCT תרכובת | רקמה-טק | 4583 | |
| שקופיות הידבקות | StatLab | M1000W | |
| סרום חמור | סיגמא אולדריץ' | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| נוגדן נגד קלבינדין | סיגמא אולדריץ' | C9848 | |
| נוגדן נגד EGFP | Abcam | ab13970 | |
| נוגדן | שתואר בעבר בהפניה 21 | ||
| הרכבה פלואורסצנטית מדיה | Dako | S3023 | |
| 2-מתיל בוטאן | סיגמא אולדריץ' | O3551 |
מקורות
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of s....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
