הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53350

⸱

17 בנובמבר 2015

 ,  ,  ,  , 
1University of Zurich, Balgrist University Hospital, 2Institute for Biomechanics, ETH Zurich

במאמר זה

סיכום

מתוארים פרוטוקולים לכימות אינטראקציות מכניות בין תאים דבקים ומצעים מיקרו-מובנים. אינטראקציות אלו קשורות קשר הדוק להתנהגויות תאים חיוניות כולל נדידה, התפשטות, התמיינות ואפופטוזיס. הפרוטוקולים מציגים תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח הנקראת MechProfiler, המאפשרת קביעת הכוחות המעורבים עבור כל מיקרו-פוסט.

תקציר

מצעי תרבית תאים עם מיקרו-פוסטים גמישים משולבים מאפשרים למשתמש לחקור את האינטראקציות המכניות בין תאים לסביבתם הקרובה. במיוחד, אינטראקציות תא-מצע הן העניין העיקרי. כיום מערכי מיקרו-פוסטים הם שיטה מאופיינת ומבוססת היטב עם מגוון רחב של יישומים שפורסמו בעשור האחרון. עם זאת, נראה שיש הסתייגות בקרב ביולוגים להתאים את הטכניקה בשל התהליך הארוך והמאתגר של ייצור מיקרו-פוסטים יחד עם היעדר תוכנה נגישה בקלות לניתוח תמונות של תאים המקיימים אינטראקציה עם מיקרו-פוסטים.

קריאת הכוח ממיקרו-פוסטים היא קלה באופן מפתיע. מיקרו-עמוד מתנהג כמו קפיץ עם התא מחובר באופן אידיאלי בקצהו. בהתאם לגודל, תא מפעיל כוח מהשלד הציטולוגי שלו דרך נקודת הידבקות מוקדית אחת או יותר למיקרו-פוסט, ובכך מסיט את המיקרו-פוסט. כמות הסטייה קשורה ישירות לכוח המופעל בכיוון ובגודל. מספר המיקרו-פוסטים המכוסים על ידי תא ודפוסי הפוסט סטייה אופייניים ומאפשרים קביעת ערכים כמו כוח לעמוד, ופרמטרים ביולוגיים רלוונטיים רבים המאפשרים "פרופיל מכני" של פנוטיפים של תאים.

שיטה נוחה ליצירת פרופילים מכניים מתוארת כאן המשלבת את הדור הראשון של מיקרו-פוסטים מוכנים לשימוש מסחרי עם חבילת תוכנה שפותחה בתוך החברה ונגישה כעת לכל החוקרים. כהדגמה של יישום טיפוסי, תמונות בודדות של תאי סרטן העצם צולמו במיקרוסקופ שדה בהיר לפרופיל מכני של מודלים של קו תאים של גרורות. שילוב זה של חיישני כוח משיכה מסחריים ותוכנת קוד פתוח לניתוח מאפשר לראשונה יישום מהיר של טכניקת מערך המיקרו-פוסטים בעבודת מעבדה שגרתית הנעשית על ידי משתמשים שאינם מומחים. יתר על כן, תהליך ניתוח חזק ויעיל מאפשר למשתמש לנתח מספר רב של תמונות מיקרו-פוסט בצורה חסכונית ביותר בזמן.

מבוא

מבחני מבוססי תאי Mechano רגישים לאפשר לחקירת תאים חסיד, עם מגוון רחב של יישומים המשקפים את התפקיד המרכזי שמכניקה יכולה לשחק בביולוגיה של תא. יישומים אלה לעתים קרובות להתמקד במנגנונים המניעים את תהליכי subcellular או כל תא התנהגות. מצד אחד, גורמים סביבתיים חיצוניים, כגון הרכב נוסף סלולארי מטריצה ​​או מטריצת קשיחות יכולים להשפיע באופן דרמטי את התגובה המכנית וביולוגית של תא. 1 ניתן לראות אותו לאחר שימוש בכיתות רבות של תרכובות פעילים pharmaceutically, את ההשפעות של אשר לעתים קרובות מאופיין באמצעות מודלים תרבית תאים. 2 בנכסים האחרים יד genotypic, כגון אלה הנגרמים על ידי מוטציות גנטיות ספונטניות או מושרה בניסוי, יכול לגרום לשינויים מסומנים בפנוטיפ תא הקשורים לשינויים במבנה שלד התא ותפקודו. 3 דוגמאות אלה רק כמה מן רבים אפשרייםנושאים שphenotyping המכני של תאים הוא רלוונטי, וכל אלה נחקרו מועילים עם מערכי micropost.

בשעת כתיבה זו, כ -200 מאמרים פורסמו מתארים אינטראקציה התא-micropost. עבודות אלה לדון בהיבטים התיאורטיים של עקרונות סטיית micropost כמו גם הוראות מעשיות בייצור שלהם. המאמר הראשון המתאר את האינטראקציה של תאים ומערכי micropost גמישים פורסם על ידי טאן ועמיתים בשנת 2003. 4 בניגוד למיקרוסקופ הקלאסי כוח המתיחה (TFM) שבו מצעים רכים רציפים משמשים לאמידת התכווצות תא nanonewton קנה מידה, טאן et al. תאר שיטה באמצעות קורות אנכיות צפופות מרובות עשויות אלסטומר סיליקון. היתרונות העיקריים של שיטה זו עולים משתי תכונות עיקריות. ראשון כדי לשנות את מצע נוקשות תא-לכאורה צריך רק לשנות את ממדי micropost תוך שמירההרכב המצע אחר קבוע ובכך להימנע מהבדלים בטופולוגיה משטח וכימיה. microposts השני מתנהג כמו מעיינות בודדות שניתן לנתח דיסקרטי עם כוח והחלטות מרחבית על סדר הידבקויות מוקד בודדים ויכול להפחית את האתגרים אנליטיים שטבועים לניתוח דומה על ידי TFM הסטנדרטי.

היום המגוון הרחב של יישומים למערכי micropost עולה בהרבה על רק המיפוי של כוחות לכמה תאים בודדים. לדוגמא, אקיאמה מדווחת על שימוש ברקמת כלי גב מבודד מזחל עש כמפעיל למערך micropost, על מנת לפתח מיקרו-רובוט אוטונומי המונע בשריר חרקים. 5

עם זאת, יישומים שפורסמו רוב microposts התמקדו במחקרים של מצבים רפואיים כמו זיהום או סרטן. לדוגמא, מערכי micropost שימשו ללמוד דור הכוח של פילי סוג IV ארוזים של gonorrh Neisseriaמושבות oea המשויכת למפלי אות שיפור זיהום. 6 אחרים השתמשו microposts ללמוד תאי סרטן השד שטופלו בתרופות תרכובות מיקוד שלד התא. 7

סטייה של micropost מתוארת לעתים קרובות תוך שימוש בתאוריה קלסית קרן לשלוחה עם עומס סוף ההנחה התא מייחס רק לקצה קצו של micropost. כאן F הכוח ליישם שגורם δ סטייה תלוי בk "קשיחות כיפוף" של micropost ומחושב על ידי:

figure-introduction-1 (1)

עם E, אני, ולהיות L מודולוס של יאנג, רגע תחום אורך אינרציה וקרן בהתאמה. עם זאת, תוצאות ממשוואה זו נותנת קירוב כללי של הכוחות בעבודה מאז גז קרן וכיפוף גם רק כהשתאה מצע אינם נלקחים בACלִסְפּוֹר. בהתחשב בכך שmicroposts עשוי בדרך כלל מחומרים רכים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) מבוסס גומי סיליקון הגורמים האלה צריכים להיות כלולים. . שון et al הראה שיש גורם תיקון כזה המבוסס על היחס של micropost (L / D) ונ 'יחס פואסון של הפולימר המתאים 8 זה ניתן על ידי.:

figure-introduction-2 (2)

עם ההטיה T (v) להיות מקדם הטיה הכולל הולם פרמטר = 1.3 ניתן למצוא כמו באותו המאמר:

figure-introduction-3 (3)

כלומר, הנוקשות המתוקנות של micropost k קור היא התוצר של K = עיקול k כיפוף קשיחות הטהור וגורם תיקון קורניתנו על ידי:

figure-introduction-4 (4)

לכן, יש לבצע חישובי כוח התא באמצעות הווריאציה מעודנת יותר של משוואה (1) קוראים עכשיו:

figure-introduction-5 (5)

ההשפעה של התיקון הופכת להיות ברורה יותר ברגע שהערכים אופייניים לממדי micropost משמשים. לדוגמא, micropost ארוך 15 מיקרון עם חתך עגול וקוטר של 5 מיקרומטר עשוי מגומי סיליקון מבוסס PDMS מוביל לגורם תיקון של 0.77 ולכן חישוב מתוקן היה להעריך את כוחות התא המופעל על ידי 23%. זה הופך להיות אפילו יותר קשה לmicroposts עם ההיבט ratios הקטן יותר.

באופן מסורתי, ניתוח תמונת micropost גם היה מבוסס על תיאורית כיפוף קרן האידיאלית. בשנת 2005 הקבוצה שהיה חלוצה בשימוש בMICRמערכי opost פורסמו תוכנת ניתוח תמונה המתאימה לניתוח micropost 9 התוכנה דורשת רישיון תוכנה והמשתמש חייב לקחת שלוש תמונות לכל תפקיד.; אחד מכל המטוסים העליונים ותחתונים של micropost במצב הולכה ועוד אחד במצב הקרינה עם התא המוכתם. לאחר השוואת העמדות העליונה ותחתונים לכל micropost התוכנה קובעת שדה כוח וקטור ומחשבת פרמטרים הקשורים כמו כוח למשרה. חבילות תוכנה אחרות קיימות ועקרונות ניתוחם מוזכרים בקצרה במאמרים המקביל המתארים אותם, אבל חבילות תוכנה אנליטיים אלה הן בדרך כלל לא זמינות לציבור. 10,11

מערכי micropost מיועדים לכוחות תא מיפוי יכולים להיות מסווגים כאו להיות בפריסה מאונך micropost או אחד משושה, האחרון שבם יש את היתרון של פערים במרחק שווה בין כל microposts השכן. חה microposts הטיפוסייש חתך עגול וממדיהם נעים בין 1.0 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר בקוטר 2 עד 50 מיקרומטר באורך. 4 עם זאת, microposts עם חתך אליפטי או מרובע גם דווח. 12,13

השימוש בתערובות סיליקון מבוסס PDMS כחומר micropost מאפשר להוספת חלקיקים לתוך התערובת. לדוגמא הוספת ננו-מוטות קובלט מאפשר הפעלה מגנטית של micropost ובכך נותן עוד תואר של חופש עיצובים ניסיוניים פוטנציאל. 14 רוב הקבוצות לייצר מערכי micropost על מצעים קשיחים שטוחים כמו מכסה זכוכית או בתוך צלחת פטרי. עם זאת, מאן ועמיתים לעבודה דיווחו לאחרונה מערך micropost נוצר על קרום מתיחה. 15 זה מאפשר היישום של כוחות תא מתיחה לתאים חסיד בזמן לימודי תגובות דינמיות לחיות תאי subcellular במונחים של התכווצות תא.

ורוב estab המועסקים נרחבתהליך lished להכנת מערכי micropost מבוסס על יתוגרפיה הרכה כפי שתואר בפרוטוקולים תובנה של Sniadecki ועמיתים. 16-18 בתהליכי חדר נקי סטנדרטיים קצרים משמשים ליצירת microstructures על גבי פרוסות סיליקון באמצעות photoresist SU8. זה ואחריו תהליך העתקה שבו גומי סיליקון הוא יצוק על מבני העברתם לתוך תבניות. בשלב שני תבניות אלה משמשות לשכפל מיקרו הראשוני באמצעות גומי סיליקון על גבי מצע נבחר. עם זאת, למרות המספר הגדול והולך וגדל של פרסומים הקשורים ליישומם, הקמת תהליך ייצור לmicroposts לוקח כמות ניכרת של זמן אפילו למומחי מיקרו-הנדסה; יש שלבי תהליך רבים הדורשים אופטימיזציה והתאמה לסביבת המעבדה הספציפית ופריסת micropost להניב רמת איכות מקובלת.

מערכי micropost מסחריים זמינים כעת במוכן-tפורמט o-שימוש ("מחוץ למדף") עם איכות גבוהה באופן עקבי. ככזה הוא אלטרנטיבה לתהליך הייצור המורכב וארוך הנדרש לייצור באתר. במאמר זה מערך micropost זמין מסחרי שימש למיפוי כוחות סלולריים באמצעות תמונת מיקרוסקופ שדה בהיר אחד. חשוב ממאמר זה מתאר ומתעד תוכנת מלוא תפקודי קוד פתוח בשם MechProfiler, שזמינה להורדה כחומר משלים לכתב היד הזה. ניתן למצוא גם גרסה נשמרה באופן פעיל של התוכנה בhttp://www.orthobiomech.ethz.ch.

השילוב של assay "מחוץ למדף" ותוכנת ניתוח קוד פתוח תואמת במידה ניכרת מוריד את משוכת הכניסה להשיג ניסויי TFM מדויקים. חוקרים ללא גישה למתקנים או חדר נקיים או מומחיות בפיתוח תוכנה יכולים לנתח כוחות סלולריים בהצלחה. זה מאפשר למשתמש להתמקד בmechanosפלט ensitivity assay ולא הטכנולוגיה עצמה, ועושה מדידות כוח המתיחה זמינות לקהילה רחבה יותר. יתר על כן, זה הוא צעד חשוב כדי לסלול את הדרך לכיוון הקרנה אוטומטית מלא של מערכי micropost.

תוכנת ניתוח MechProfiler מעבדת תמונות בפורמט קובץ TIFF, PNG, BMP ו- JPG. ניתן לקחת את התמונות באמצעות הקרינה, לעומת שלב או מיקרוסקופ אור בהיר השדה. התכנית העצמאית פועלת יחד עם Matlab מהדר זמן הריצה החופשי (זמינה בכתובת: איור 12) ואלגוריתמים בסיסיים לאפשר לעיבוד תמונה יעיל, המאפשר למשתמש לעיבוד תמונות עם תאים בודדים או מרובים בכ -1 דקות. יתר על כן, תאים אלה יכולים גם להיות חיים או "קבוע".

תוכנת MechProfiler יכולה להגדיל את תפוקת ניתוח נתונים רבה על ידי הסתמכות על שחזור של מערכי micropost המסחרי האיכותי, # ספציפי יותר, ברירת המחדל ו8220;-הסיט אינם "עמדה של כל הודעה במערך ניתן להניח נגד רשת אידיאלית (סטיות ייצור לרשת במערכים המשמשים למחקר זה היו פחות מ -100 ננומטר).

בקיצור אחד פותח בחירה של קבצי תמונה לניתוח, יבוליהם לאזור של עניין, מגדיר את ההודעות מכוסות על ידי תאים או שצריך להיות מושלך, קובע פוסט עמדות, מחשבים את הסטיות / כוחות נגד הרשת האידיאלית, ולבסוף שומר את כל נתוני התא ספציפי עם אפשרות ליצוא, כולל לגיליון אלקטרוני משרדי סטנדרטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תאים culturing על מערכי Micropost

הערה: כל הצעדים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית על מנת להבטיח סטריליות. הכרכים הניתנים כאן הם לצלוחיות תרבית תאי T25. צפיפות המתכון וזריעת תאי תרבית תאים בינונית מותאמות לשורות תאי סרטן עצמות HuO9 וM132.

  1. הכן תרבית תאים לזריעה על מערך micropost.
    1. בדוק את איכות תרבית תאים על ידי הנחת בקבוק התרבות במיקרוסקופ אור רגילה. ודא שהתאים להראות צמיחה טיפוסית ומורפולוגיה ידי אומדן כמה תחתית בקבוק התרבות מכוסה. כיסוי של 70% -80% משקף שיעור צמיחה בריא. שים לב לכמות צף תאים כפי שהם מייצגים תאים מתים ו / או תרבות מגודל.
    2. Trypsinize תאים על ידי הסרת בינונית ושטיפה עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט חיץ (PBS). להוסיף 0.8 מיליליטר 1x טריפסין חומצה / Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לדגור על RT עד התאלסלק S, אשר לוקח בערך 2-4 דקות. בדוק את התהליך עם מיקרוסקופ ולעתים לנצל את הבקבוק בעדינות כדי לתמוך בדחיקה.
    3. הוסף 5 מיליליטר תרבית תאים בינוני (המדיום השתנה Dulbecco הנשר (DMEM) / F12 עם סרום 10% שור עוברי (FBS), פניצילין 1% / streptavidin (עט / סטרפטוקוקוס)) כדי לעצור את התגובה ולשטוף תאים שיורית שעדיין יושבים בתחתית של הבקבוק. בהמשך לכך פיפטה השעיה זו מעלה ומטה מספר פעמים כדי לקבל תערובת הומוגנית. הקפד פיפטה כל הפתרונות על פני שטח הצמיחה המקורי של הבקבוק כדי לקבל דחיקה יעילה.
    4. מעבירים את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות זה באמצעות צנטריפוגות בראש טבלה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות.
    5. הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. הקפד להימנע מהדור של בועות תוך כדי כך.
    6. לקבוע צפיפות תאים באמצעות תא ספירת תאים וmicrosco אורפ. בדוק את ההשעיה התא בתא ספירת תאים לאגרגטים תא ולהבטיח שתהיה לי תאים בודדים בלבד לניסוי הבא. פיפטה שוב למעלה ולמטה כמה פעמים אם התאים נוטים ליצור אגרגטים להפריד ביניהם.
    7. לדלל את ההשעיה התא עם מדיום מספיק כדי להשיג פתרון תא של 25,000 תאים / מיליליטר. מערבבים אותו היטב על ידי צינור היפוך הסגור מספר פעמים.
  2. הכן מערך micropost לזריעת תאים.
    הערה קריטית: אל פיפטה על גבי מערך micropost ישירות כמו זה עלול לפגוע בmicroposts, במיוחד כאשר בועות לא רצויות הם הציגו. יתר על כן, לוודא כי מערך micropost לא מתייבש כמתרחש כוחות הנימים להוביל לקריסה של microposts.
    1. מניחים את מצע הזכוכית עם מערך micropost להתמודד בטוב של צלחת 12 גם באמצעות פינצטה ולהרטיב אותו על ידי הוספת 1 מיליליטר אתנול (99%). לדגור על RT במשך 20-30 שניות.
    2. לדלל את אתנולבשלבים על ידי הוספה כ 1 מיליליטר מים המיוננים סטרילי (מים DI) בצד טוב וaspirating בערך 1 מיליליטר בעזרת פיפטה העברה או מכשיר שאיפה. חזור על שלב זה לפחות 3 פעמים.
    3. החלף את DI-המים עם PBS-חיץ באותו אופן על ידי הוספה וaspirating כ 1 מיליליטר. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
    4. החלף את PBS-החיץ עם מדיום על ידי הוספה וaspirating כ 1 מיליליטר של מדיום. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
  3. פתרון פיפטה 1 מיליליטר תא (25,000 תאים) בחלק העליון של כל מערך micropost מוכן. לסגור צלחת רב היטב ולהעביר אותו לחממה (CO 2% 5, 37 מעלות צלזיוס). בואו התאים לדבוק ולגדול על גבי microposts ל6 -7 שעות.
  4. בדוק את תהליך ההדבקה מדי פעם באמצעות אור מיקרוסקופ. בדוק שרוב התאים מופיעים פרושים על פני מספר רב של microposts.

2. תאי תיקון ומכתים

הערה: כל הצעדים וכרכים הניתנים כאן הם לטוב אחד של צלחת 12 גם. מומלץ לעבד לא יותר מארבע שנתי עשר הבארות בכל פעם, כדי למנוע התייבשות של הבארות לאחר השאיפה של כל נוזל, אשר יגרום לקריסה של microposts.

  1. בינוני לשאוב מהבאר ותאים לשטוף 2X עם 1 מיליליטר PBS-חיץ. הקפד להחיל כוח עדין בזמן שטיפה עם PBS להסיר פסולת תא שהצטברה על מערך micropost במהלך דגירה ולנתק תאים מתים.
  2. תקן את התאים עם 0.5 מיליליטר 3.7% תמיסת פורמלדהיד שנאגרו במשך 5 דקות.
  3. החלף את פתרון פורמלדהיד על ידי שטיפת 2x מערך micropost עם 1 מיליליטר מים די סטרילי.
  4. כתם התאים עם צבע (0.05% כחול מבריק Coomassie ב -50% מים, 40% אתנול ו -10% חומצה אצטית) לכ -90 שניות. לשטוף פתרון מכתים עודף מ2x עם 1 מיליליטר מים די סטרילי. מוסיף מים DI 1 מיליליטר לmicropost מערך.
  5. בדוק תוצאת צביעה באמצעות מיקרוסקופ אור. לא חזורהוא מכתים צעד, אם גוף תא הוא קלוש מכדי להיות דמיינו.
  6. מערכי micropost חנות עם התאים המוכתמים על גבי במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. להבטיח כדי לשמור אותם מתחת למים בכל העת.

הדמיה 3. סלולארי

הערה: שלב 4 חל רק על מיקרוסקופים ללא אופטיקה אינסוף מתוקן.

  1. להוסיף DI-מים 2 מיליליטר לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית דקה להדמיה ברזולוציה גבוהה.
  2. העבר את מערך micropost באמצעות פינצטה לתוך צלחת ההדמיה עם microposts פונה כלפי מעלה.
  3. מניחים את צלחת פטרי הדמיה בשלב ניד של מיקרוסקופ אור.
  4. הפעל את טבעת הפיצוי של העדשה המשמשת להדמיה עד המספר על הסולם מייצג את העובי הכולל של כל החומרים בדרך האופטית כדי לפצות על חוסר ההתאמה במדדי שבירה של מצע הזכוכית, אלסטומר סיליקון ונוזל על גבי. זה צריך להוביל להופעה בהירה של micropostsליבות.
  5. סגור את איריס בצד התאורה עד 50% ולהסיר כל טבעות ניגוד שלב מהנתיב האופטי המאפשר מצב בהיר שדה רגיל.
  6. יישר את מערך micropost שmicroposts יוצר קו אופקי על פני שדה התצפית. הגדרת נקודת התחלה (למשל, למעלה משמאל) ולהעביר את שלבי צלחת פטרי על הבמה סריקת מערך micropost תוך לקיחת תמונות רבות.
  7. קח את כל התמונות עם הגדרת הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור המצלמה באמצעות מטרת 20X או 40X. שואף להיות תא בודד במרכז התמונה.
  8. לטאטא לאורך ציר z דרך המצע עד הטיפים micropost הם בפוקוס. השתמש בגלגל פוקוס כוונון העדין של המיקרוסקופ ולהפוך אותו לכיוון התמקדות בתחתית micropost כ 2-3 מיקרומטר.
  9. לקבוע נוהל הדמיה סטנדרטי על ידי לקיחת סדרה של תמונות מבחן סעיף מערך אחד שוטף את הפרמטרים הדמיה אחד בכל פעם (למשל, זמן חשיפה,הגדרת איריס, הגדרות מנורה וכו '). ניתוח תמונות עם MechProfiler ולקבוע סט פרמטר מתאים לניתוח מהיר ואמין.

ניתוח 4. תמונה עם תוכנות הקוד פתוח "MechProfiler"

הערה: ניתן להפעיל כל פונקציות התוכנה עם התקן הצבעה באמצעות לחצן העכבר השמאלי. עם זאת, מפעיל מיומן יהיה להשתמש במקשי הקיצור המתועדים נועדו להיות במחצית השמאלית של המקלדת כדי לאפשר עיבוד תמונה בשתי ידיים יעילה.

  1. התחל MechProfiler תוכנת ניתוח תמונה ולפתוח מגוון של תמונות שצריכות להיות מנותחים על ידי לחיצה על "פתח".
  2. הכנס את כל הפרמטרים לסעיף "הגדרות" שניתן על ידי מפתח התוכנה. לקבוע את הפרמטרים שחייבים להיות מוגדר אישית (כלומר, סף גובה ומרחק מינימאלי) בהתאם לנהלים שתוארו בפירוט על ידי התוכנה ידנית.
  3. לנתח תמונהשל אחד על אחד על ידי חיתוכם לאזור של עניין באמצעות "חתוך" (לחץ וגרור עם כפתור העכבר לחוץ למטה). לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן נמשך לסיים פעולה זו.
  4. סימון כל מתווה גלויה תא אחד על אחד על ידי לחיצה על "צייר קווי המתאר תא" ולהשתמש בסמן שיער הצלב לציור כולל את כל microposts התא מצורף.
  5. לבטל את כל microposts לא רצוי על ידי לחיצה על "בטל הודעות" ולהשתמש בסמן שיער הצלב לציור. הקף את כל microposts ששייך לתא מחוץ לתמונה או הקטע שהסיטו מכל סיבה אחרת, אבל לא על ידי התא של עניין.
  6. התחל שגרת התוכנה "מצא centroids" על ידי לחיצת עכבר. התאם את מסנן הגדרה ממש ליד הכפתור "מצא centroids" עד שכל microposts רשום, אשר גלוי על ידי צלב אדום במרכזם. אם הגדרת המסנן היא גם microposts הנמוך יתעלם, אם הוא גבוה מדי muעמדות ltiple תסומן לmicropost יחיד. שמור את מסנן הגדרה קבוע במהלך פגישת ניתוח.
  7. השתמש בפונקצית עריכה הידנית "העריכה ידנית" לcentroids עם עמדות micropost מרובות או שלא נענו. השתמש בשיער צלב עכבר כדי לבחור את micropost בשאלה על ידי לחיצה וגרירתו על פני. לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן ומניחה את הסמן האדום החסר בסעיף התמונה המוגדל, אשר באופן אוטומטי סוגר. בטל micropost כזה אם הוא מחוץ לקווי מתאר התא נמשך (ראה שלב 4.5) לפני שימשיך.
  8. מצא את רשת micropost האידיאלית על ידי הפעלת הפונקציה "צור רשת" בלחיצת עכבר. להבטיח את המיקום מתאים עם הראש האמיתי micropost, שמוצג על ידי טבעת כחולה, בתוך קווי המתאר התא נמשך.
  9. לתקן כל יצרנית רשת במקומה בתוך שטח התא שבו צורך בשימוש בפונקציה המקבילה "מנואל ערוך" בלחיצת עכבר. השתמש בשיער הצלב כדי לבחור את micropost בquestion על ידי לחיצה וגרירתו על פני. לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן מופיע ולמקם את הסמן הכחול החסר בסעיף התמונה המוגדל, אשר באופן אוטומטי סוגר.
  10. השתמש בכפתור "חישוב הסטיות" על ידי לחיצת עכבר לקבל היסטוגרמה של ערכי הסטייה מחושבים על בסיס ההבדל בין העמדה של micropost בתוך סעיף התמונה והרשת האידיאלית שנוצרה.
  11. שמור את הניתוח המלא כולל השולחנות של ערכים על ידי לחיצת עכבר על "שמור".
  12. המשך ניתוח התמונה או על ידי לחיצה על "איפוס צפה" ולנתח סעיף אחר של תמונות או לחיצת עכבר על "התמונה הבאה", בו בנוחות ניתן לעשות זאת באמצעות מפתח גדפן מקלדת תקין.

5. ניתוח נתונים - Mechanoprofiling

  1. פתח את הקובץ "results.xls" עם תכנית גיליון אלקטרוני משרד מהתיקייה עם התמונות מנותחות. הוא מכיל את הנתונים עם אלערכי l מחושבים כוללים את כל סטיות micropost ואמצעים נגזרים סטנדרטיים כגון עבודה (כלומר, אנרגיית עיוות מצע) על ידי התא נותח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היתרון העיקרי של הטכניקה המתוארת טמון בפשטות שלה ופוטנציאל להשתלבות מהירה ויעילה לעבודת מעבדה שגרתית. השילוב של מערכי חיישן מסחריים באיכות גבוהה יחד עם תוכנות קוד פתוח מספק מידע על mechano-רגישות שאחרת היה דורש גישה למתקני חדר נקי ובידע המעמיק של ניתוח תמונה ופיתוח תוכנה. איור 1 מדגים את זרימת העבודה של השיטה שהוצגה. זה מתחיל בהכנה וזריעת תאים על גבי מערך micropost. לאחר תיקון ומכתים את תאי מערכי micropost מוכנים להדמיה. חלק מהטכניקה המרכזי הוא ניתוח התמונה באמצעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו מבקשת לקדם את התחום של כוח המתיחה מיקרוסקופי על ידי באופן משמעותי הפחתת מחסומים טכניים ומעשיים לכניסה. מחסומים אלה באים משני צדדים. בראש ובראשונה הם האתגרים הטכניים לא טריוויאלית הרבים שיש להתגבר כדי לייצר reproducibly וניסוי עמלה מערך micropost. שנית, הוא הצורך באופן דומה לא טריוויאלית עבור ניתוח אוטומטי למחצה אמין של כוחות תא בודדים - תוך התחשבות שבניסוי טיפוסי עשוי לדרוש הניתוח של מאות או אפילו אלפים של תאים. הטכניקות שתוארו לעיל פותחו כדי להפוך micropost מיקרוסקופ כוח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר הראשי (NG) הוא מייסד שותף של MicroDuits GmbH, הספקית המסחרית של מערכי המיקרו-פוסטים ששימשו במחקר זה. לאף מחבר אחר אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים עם עבודה זו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הוועדה לטכנולוגיה וחדשנות (CTI) שוויץ מענק 14796-PFLS-LSCTI. מערכי MicroPost סופקו בנדיבות על ידי MicroDuits GmbH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלוחיות תרבית תאים T25Nunc156367
1x PBS-bufferSigmaD8537
0.5% Trypsin-EDTALife Technologies15400054
בינוני DMEM/F12SigmaD8437
FBS SouthAmerica Life Technologies10270106
פניצילין-סטרפטומיצין 100xסיגמאP4333
בקבוקוני צנטריפוגה 15 מ"לSarstedt62.554.502 
מערך Micropost מצופה מראש בקולגן I/FibronectinMicroDuitsMPA-col1/FNמידות Micropost: Ø=6.4  ומיקרו; m, l=18.2 ומיקרו; m; grid=13 ומיקרו; M, Kcorr=2.87  n/&מיקרו; מ
אתנול שרירי בטן p.A.Merck100.983
פורמלין Nunc150628צלחת 12 בארות
, ניטרלית חוצצת 10%SigmaHT5011
כחול מבריק G-250Sigma27815Coomassie כחול
מתנול ACS p.A.Merck1.06009
חומצה אצטיתסיגמא695092
צלחת תחתונה מזכוכיתWillCo Wells BVGWSb-3522קוטר 35 מ"מ, צמצם 22  mm
T-100 EclipseNikonn/aמיקרוסקופ הפוך
D3-L3Nikonn/aשולט מצלמה
DS Fi2מצלמתניקון
תמיסת

מקורות

  1. Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
  2. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
  3. Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
  4. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  5. Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
  6. Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
  7. Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
  8. Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
  9. Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
  10. Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
  11. Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
  12. Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
  13. Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
  14. Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
  15. Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
  16. Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311(2007).
  17. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
  18. Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.