שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

סיכום

במאמר זה אנו מתארים את העקרונות לתכנון וביצוע ניסוי מעקב שושלת רב-צבעוני באמצעות עכברי R26R-Confetti. אנו מספקים פרוטוקול ספציפי למעקב אחר תאי אפיתל בקרנית שניתן לשנות עבור רקמות אחרות מעניינות.

תקציר

ניסויי מעקב אחר שושלת מגדירים את המקור, הגורל וההתנהגות של תאים ברקמה או אורגניזם ספציפיים. טכניקה זו מיושמת בהצלחה במשך עשורים רבים, וחשפה ממצאים מכוננים בביולוגיה התפתחותית. לאחרונה, הוא אומץ על ידי ביולוגים של תאי גזע כדי לזהות ולעקוב אחר אוכלוסיות שונות של תאי גזע עם התערבות ניסויית מינימלית. ההתפתחויות האחרונות בגנטיקה של עכברים, זמינותם של מספר רב של זני עכברים וההתקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרים תכנון פשוט של מערכות מעקב שושלות עוצמתיות לרקמות שונות עם מומחיות בסיסית, תוך שימוש בכלים זמינים מסחרית. לאחרונה ניצלנו את המתודולוגיה רבת העוצמה הזו כדי לחקור את מקורם וגורלם של תאי גזע על פני העין באמצעות עכבר R26R-Confetti. מודל זה מציע מערכת גנטית רב-צבעונית, לביטוי של 4 גנים פלואורסצנטיים באופן אקראי. כאן אנו מתארים את עקרונות המתודולוגיה הזו ומספקים פרוטוקול מותאם לתכנון ניסויי מעקב אחר שושלת; במיוחד עבור אפיתל הקרנית כמו גם עבור רקמות אחרות.

מבוא

במהלך התפתחות עוברית, רקמה ואיבר המורפוגנזה תתקיים באמצעות תכנית מדויקת שיכול להיות מתוארת במונחים של התפשטות תאים, נדידת תאים ומפרט שושלת ^1-4. תהליכים ביולוגיים אלה מעורבים גם בשמירה על הומאוסטזיס רקמה בוגרת, אשר דורש התחדשות תאי גזע. מעקב שושלת, זיהוי והמעקב של הצאצאים של סוג מסוים של אוכלוסיית תאים, מספק כלי חשוב ללימוד עובר ונובע הומאוסטזיס תא. ואכן, הוא משמש יותר ויותר בתחומים רבים של מחקר. במיוחד, מעקב שושלת הפך כלי חיוני בזיהוי המקור וגורלם של תאי גזע בפיתוח הומאוסטזיס והסרטן. סיבה לכך הוא שהוא עשוי לספק מידע חיוני על איך התא מתנהג בהקשר של הרקמה או אורגניזם שלמים, עם התערבות מינימאלית ניסיונית, בניגוד לבידוד תא ובתרבות או transplantati מבחנהשבעלול לגרום להטיה לא רצויה.

באופן מסורתי, צבעים כגון carbocyanine שומנים מסיסים, אשר משלבים לתוך קרום הפלזמה של תאים, שמשו למעקב שושלת. למרות שהסוגים אלה של ניסויים הובילו בהצלחה לתגליות גדולות ומושגים מכוננים בצורה בביולוגיה התפתחותית ^5,6, יש להם כמה מגבלות, כולל הקושי לשלוט הספציפי של תאים ממוקדים, ההשפעה לא רצויה של הצבע על התנהגות תא והדילול של התווית לאורך זמן. גישות תיוג אנלוגי נוקלאוטיד אפשרו מתעדות את קיומה של איטי רכיבה על אופניים "תאי תווית שמירה" שככל הנראה מתאים לרגיעת תאי גזע ^7,8. עם זאת, בעוד שטכניקה זו יכולה להפגין הנוכחות של תאי רכיבה איטיים המבוססים על קינטיקה התפשטות על פני תקופה זמן מוגבלת זה לא יכול לספק תובנות משמעותיות לגבי הפונקציונליות של תאי גזע. ספיד שושלת התחקות אופטימליodology צריך למזער את ההשפעה של תיוג על המאפיינים של התאים המסומנים, צאצאיו, או שכניו. בנוסף, זה יהיה מועיל יש שליטה על האינדוקציה התיוג, כלומר, יש את היכולת לתייג אוכלוסיית התא של עניין בשלב ואופן תלוי זמן, כמו גם בתא בודד אופן (משובט). שיטת תיוג יציבה ובלתי הפיכה שהוא עבר על כל הצאצאים של תא המייסד חשובה כל כך שהתווית תהיה נשמרת לאורך זמן, ולא הועברה לתאים שכנים.

לאחרונה, גישות גנטיות של תיוג תא פותחו. במערכות אלה, ניתן להשתמש במקדמים ספציפיים תא כדי לעורר ביטוי recombinase Cre כדי להסיר מחסום-וצד loxP ולאפשר את הביטוי של גני כתב כגון גני כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק או Β-galactosidase ^9-13. גישה זו מאפשרת לא רק המעקב של תאים וצאצאיהם, אלא גם מאפשרת תא הואolation ואפיון מולקולרי. מעקב תא ברמת התא הבודד התאפשר על ידי אינדוקציה של הביטוי של גן כתב ניאון בודד. מגבלה חשובה אחת של מערכת זו היא העובדה שרק כאשר אחוז נמוך מאוד של תאים שכותרתו ניתן להפריד ולעקוב אחר שיבוטים בודדים. כדי להתגבר על מגבלה זו יכולים לשמש כתבי ססגוניות. בעת שימוש בתיוג ססגוניות, המעקב של גורל ההפרש של תאי שכנים באותו הנישה יכול להיות מושגת יעילות ^14-17. לאחרונה, מגוון רחב של Brainbow אללים (Br) פותחו לניסויי שושלת התחקות, המאפשר ביטוי סטוכסטיים של גני כתב ניאון מרובים ניצול Cre / מערכת לקס. מערכת Cre / לקס מורכב של אנזים recombinase Cre, אשר מכיר ונקשר לרצפי DNA ספציפיים כגון אתרי loxP. בעקבות עקידת recombinase Cre, רקומבינציה הספציפית האתר מתרחשת, מה שגורמת לרצפי הסרת loxP המוקף resultinG בביטוי אקראי של חלבוני ניאון שונים (המנגנון מתואר להלן). מגוון רחב של קווי Br זמין לשימוש (ראה ביקורות ^16,18,19). ההבדלים העיקריים בין זני Br כוללים הבדלים (i) במספר גני ניאון הכלול בקלטת, שנעו בין 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) גני ניאון , (Ii) את נוכחותם של אתרי לקס חוקיים הדדי לאפשר היפוך גן (Br2.0-2.1), (iii) הסוג של אתרי לקס משמשים, וכן (iv) הביטוי או שתיקתו של ביטוי גני ניאון לפני הפעלת Cre. Br3 הוקם לאחרונה מציע שיטה משופרת להדמיה ססגוניות של נוירונים. אחד המאפיינים העיקריים של התמליל הזה הוא שהוא מכיל סט חדש של חלבוני photostable farnesylated ניאון, המאפשרים גם צביעה העצבית הטוב ביותר מעבד ^20.

חשוב לציין, גרסאות שונות של קלטות Br עשויות להכיל ספציפיות העצבי Thy1 יחסי ציבורomoter או בכל מקום הביע CAG אמרגן (CMV). לבסוף, בזמן שחלק מהעכברים הטרנסגניים Br עשוי להכיל transgene Br בודד, אחרים יכולים להיות מורכבים ממספר רב של עותקי transgene, ובכך מאפשרים הייצור של מספר עצום של אפשרויות לשילובי צבעים לבוא לידי ביטוי בכל תא (למשל לראות ^16).

במחקר שלנו, השתמשנו בעכבר R26R-קונפטי המכיל את קלטת Br 2.1 ^21. Br2.1 הוא בעיצוב ייחודי כדי לאפשר היפוכי DNA בתיווך Cre ולא רק השמטות בגלל הנטייה ההדדית של אתרי loxP (איור 1). לפיכך, אירועי היפוך / כריתה אלה שיובילו לשינוי צבע יכולים להמשיך כל עוד Cre קיים ^16. מסיבה זו, מערכת ביטוי מושרה זמנית Cre היא חיונית למעקב תא אמין באמצעות Br2.1. כפי שניתן לראות באיור. 1, Br2.1 מכיל אמרגן CAG בכל מקום ואחרי -casse ^ניאו-R מוקף loxPטטי, אשר משמש כמחסום תעתיק, שאחריו 4 גני ניאון כתב, קידוד לירוק (GFP), צהובים (YFP), אדום (RFP) וציאן (CFP) חלבוני ניאון, ממוקמים בשני tandems. אין הקרינה באה לידי ביטוי לפני הפעלת Cre. אינדוקציה של recombinase Cre גורמת להסרת של קלטת ניאו-R המאפשרת ביטוי האקראי של אחד 4 חלבוני ניאון בתא נתון. הקטע הראשון מכיל GFP-מוקף loxP וYFP הפוך, ואילו המגזר השני מכיל RFP-מוקף loxP וCFP הפוך. מגזרי DNA אלה עשויים להיות הפוכים ברציפות (באמצעות loxP שהוא בכיוון הפוך), או נכרת, כל עוד recombinase Cre הוא הווה. לכן, יש להשתמש transgene Cre חולף ובשליטה. קלטת Br2.1 מספקת מערכת מצוינת להבחנה בין פליטות חופפות למיקום אות: הביטוי של YFP וRFP הוא cytoplasmic, GFP הוא גרעיני וCFP חייב קרום התא. GFPופליטת RFP מופרדות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי. על מנת להפריד את פליטת YFP / GFP / CFP, יש צורך במערכת ההדמיה confocal רפאים. בסך הכל, את קלטת Br2.1 מאפשרת ביטוי הספציפי האקראי, מושרה, ורקמות של אחד מכל ארבעה גני ניאון שונים בכל תא ממוקד. למעשה, כאשר יש צורך במספר גדול יותר של שילובי צבעים, אחד יכול ליצור עכברים הומוזיגוטים המכילים 2 אללים של Br2.1, ובכך וכתוצאה מכך הביטוי של 2 תגי צבע לכל תא ובהעלאת מספר שילובי צבעים אפשריים עד 10 ^22. חלק מזני עכבר Br לאפשר הביטוי של מספר גדול בהרבה של שילובי צבעים אפשריים מאז מספר עותקים של הקלטת שולבו הגנום שלהם ^16. עם זאת, ברוב המקרים, ארבעת שילובי צבעים הניתנים על ידי אלל Br2.1 אחת מספיקים. בעקבות הפרוטוקול ניתן כאן, אפשר להקים בשיטה זו משתמשת בהתקנה פשוטה יחסית של spectrמיקרוסקופיה אל עם מעט אם בכלל צורך בכיול.

כאן אנו מספקים פרוטוקול להתאמה לשימוש בעכברי R26R-קונפטי המכילים אלל Br2.1 יחיד, לניסויי שושלת התחקות של האפיתל קרני. זן עכבר מהונדס זו שימש ללימוד ולגורלו של מעי גס ^21,23 ותאי גזע אפיתל קרני ^22,24, הנוכחות של פעילות תאי גזע בסרטן המעי גס ^25, ולאפיון podocyte כליות בפקעיות הכליה מגזרית מוקד (FSGS) ^17.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: בטיפול זה מחקר בבעלי חיים ושימושם תאמו את הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון. כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית.

1. בחר Cre-recombinase מתאים הבעת זן עכבר

1. מתוך המגוון הגדול של קווים מהונדסים Cre זמינים לרכישה ²⁶ ובהתאם לרקמת המטרה להיחקר, לבחור זן עכבר מהונדס Cre בי גן recombinase Cre נשלט על ידי אמרגן שהוא ספציפי לרקמות של עניין. בנדרשת שליטת מקרה זמנית, לבחור קו Cre מושרה.
   הערה: בחרנו transgene מושרה טמוקסיפן K14-Cre ^ERT לתייג במיוחד תאי גזע / אב אפיתל limbal וקרניים ^24. שימו לב שיכול להיות הבדלים בין זנים, כמו די ג'ירולמו ועמיתים לעבודה דיווחו סגוליות limbal ללא ביטוי קרני לK14-Cre ^{22 ERT.} יתרון לשימוש בעכברים מהונדסים Cre מושרה הוא שהיא מאפשרת הגיוס של שושלת התחקות במסגרות זמן צדדי.

2. בחרו הזנים Br עכבר מתאימים

1. בחר את הקלטת המתאימה Br בהתאם לשאלת המחקר ^ו16,18,20 קו Cre זמינים.
   1. אם נעשה שימוש בזן עכבר Cre אינו מושרה, לבחור קלטת Br שאינו מאפשרת תנוחות הפוכות / השמטות DNA רציפות ובכך לגרום למוצרים ללא מוצא (למשל Br1.0 או Br1.1) ^16.

3. חוצים את הקווים המהונדסים של ריבית

1. לפרוטוקול המוצג כאן, לחצות את מתח R26R-קונפטי הומוזיגוטים (Br2.1 / Br2.1) עם מתח Cre ^ERT הומוזיגוטים (Cre ^ERT / Cre ^ERT) כדי לקבל צאצאי hemizygous (Br2.1 / +; Cre / +) כי הם מוכנים לשושלת מונו האללים התחקות ככל שהם מכילים אלל Br2.1 אחת ואלל Cre היחיד.
   הערה: כדי להגביר את היעילות של תיוג, אחד יכול ליצור עכברים המכילים שני אללים Cre (Br2.1 / +; Cre / Cre), ואילו שני אללים Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) היה להגדיל שילובי צבעים (כמפורט ^ב22).

אינדוקציה 4. Cre-recombinase

הערה: הממשל של טמוקסיפן בניסויים אלה בוצע על ידי זריקת intraperitoneal יומית, למשך 3-4 ימים, על מנת לגרום לטרנסלוקציה של recombinase Cre ^ERT לתוך הגרעין של גזע הבסיסי K14-חיובי / אב limbal וקרני תאי האפיתל. הפרוטוקול הבא יכול לשמש להזרקה של ארבעה עכברים. לחלופין, יישום מקומי של טמוקסיפן אל פני השטח העין מניב יעילות גבוהה יותר. פתרון טמוקסיפן יכול להיות כל הזמן בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. לחמם את הפתרון לפני השימוש.

1. שוקל 100 מ"ג של טמוקסיפן ולפזר אותו ב 5 מיליליטר של שמן תירס ליוצר פתרון טמוקסיפן 20 מ"ג / מיליליטר.
2. להזריק 200 μl של טמוקסיפן פתרון (4 מ"ג) intraperitoneally לעכברים זקנים 8 שבועות במשך 3-4 ימים רצופים.
   הערה: פתרון טמוקסיפן יכול להיות כל הזמן בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. לחמם את הפתרון לפני השימוש.
3. ליישום מקומי: לשקול 60 מ"ג של טמוקסיפן ולפזר אותו ב 1 מיליליטר של שמן תירס ליצירת פתרון טמוקסיפן 60 מ"ג / מיליליטר. וורטקס ולהגדיר את הפתרון באמבט מים רועד נשמר על 65 מעלות צלזיוס עד שהוא הופך חופשה ברורה שזה באמבטיה עד לשימוש.
   1. להחיל בזהירות של פתרון טמוקסיפן 100 μl לכל משטח העין של העכבר.

הכנת רקמה 5. הדמיה

1. בעלי חיים קורבן באמצעות isoflurane (מתאדים 2% בחמצן) הרדמה (לאשר הרדמה תקינה על ידי חוסר רפלקסים) ואחרי משאיפת CO ₂ בנקודות זמן מתאימות לאחר הזרקת טמוקסיפן וcollect הרקמה הרלוונטית.
   1. בניסויים אלה, enucleate עיניים בנקודות הזמן הבא: 1, 4, 8, 12, ו -16 שבועות לאחר הזרקת טמוקסיפן. להשיג enucleation באמצעות מלקחיים מעוקלים. לחץ על העפעפיים גורמים לגלגל העין פופ מתוך ארובת העין. מניחים את המלקחיים מאחורי גלגל העין מחזיקה את עצב הראייה. משוך בעדינות את גלגל העין ולנתק אותו.
      הערה: בשלב זה, כפי שיתואר להלן, ניתן להכין רקמות לניתוח wholemount של תאים שכותרתו. יכולים גם להיות מוכנים קטעי רקמה קפוא רגילים, קבוע בPFA וצלם כמפורט להלן (ראה סעיף 6 ו ^-22).
2. מניחים כל עין בצלחת 60 מ"מ המלא PBS.
3. תחת מיקרוסקופ סטריאו-מלקחיים באמצעות להחזיק את העין ליד עצב הראייה עם הקרנית פונים כלפי מטה ולהשתמש אזמל כדי להסיר את עצב ראייה, השרירים ורקמות חיבור ולעשות חתך קטן בחלק האחורי של העין.
4. בעזרת מספריים האביב להגדיל בזהירותלחתוך נותנים העדשה קופצת החוצה ולהסיר את הקשתית באמצעות מלקחיים.
5. לשטח את הקרנית על ידי ביצוע חתכים 4-5 רדיאלי מתחילים מהמרכז לכיוון הפריפריה באמצעות אזמל.
6. השתמש באזמל כדי לחתוך רקמות היקפי עודפות מעבר לימבוס.
7. תקן קרניות PFA 4% במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם בקצרה עם PBS.
8. דגירה דגימות עם DAPI במשך 10 דקות ולשטוף קצר עם PBS.
9. קרניות הר בשקופיות זכוכית עם צד אפיתל פונה כלפי מעלה. מניחים ירידה של הרכבה תקשורת על גבי הקרנית וכיסוי עם כיסוי זכוכית. בואו שקופיות יבשות O / N בRT. שמור שקופיות ב 4 מעלות צלזיוס.

6. Confocal מיקרוסקופית והדמיה ניתוח

1. השתמש במערכת confocal רפאים המאפשרת הפרדה של פליטת YFP / GFP / CFP. עירור הקרינה סט ואורכי גל פליטה בהתאם לחלבוני הניאון של קלטת Br. בחר את אורך גל העירור המתאים ביותר עבור כל חלבון מכוון צלב מזעורעִירוּר. לבחור טווחי פליטה צרים כדי למזער את הדליפה של אותות מהחלבונים השונים.
   1. לקלטת Br2.1, השתמש הבא להגדיר של עירור הקרינה (לשעבר) ופליטה (EM) כנקודת התחלה: DAPI - 405 ננומטר / em ננומטר 420-480 לשעבר, CFP - ננומטר 458 לשעבר / em 470-500 ננומטר, GFP - 488 ננומטר / em ננומטר 497-508 לשעבר, YFP - 514 ננומטר / em ננומטר 529-540 לשעבר, וRFP - 561 ננומטר / em ננומטר 575-615 לשעבר.
2. על מנת להמחיש אזורי רקמה גדולים עם רזולוציה גבוהה, לרכוש הדמיה אריח. לקבלת התוצאות שמוצגת באיור 2 א-B, תמונה כל הקרנית על ידי קבלת מערך של 12 x 12 תמונות, כלומר, לרכוש 144 שדות (512 x 512) באמצעות 4 ערוצי ניאון בכל תחום. בסך הכל לאסוף 576 תמונות ולאחר מכן למזג.
3. כדי לחקור את הלוקליזציה של תאים מתויגים במעמקים ומבנים של הרקמה שונים, לרכוש תמונות Z-ערימה של אזורים השונים של עניין. בt כדיo תמונת העומק המלא של הקרנית, לרכוש 8 חלקים אופטיים ב 3 מיקרומטר מרווחים. צפיות המאונכות של הקטעים שנאספו כמו גם תחזיות תמונה המבוססות על עוצמות המרביות ניתן לבנות באמצעות תוכנות הדמיה קונבנציונליות ^24.

7. קרנית פגיעה בשילוב עם טמוקסיפן אינדוקציה

1. הרדימי עכברים עם isoflurane (2% מתאדים בחמצן) ולנהל משככי כאבים (10 מ"ג / קילוגרם Carpofen, מוזרקים תת עורי). אשר הרדמה תקינה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
2. שוקל 1 גרם של אבקת טמוקסיפן ולפזר אותו ב 5 מיליליטר של DMSO סטרילי כדי לייצר 200 מ"ג / מיליליטר פתרון ריכוז.
3. לחמם את פתרון טמוקסיפן עד 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עד הפתרון הופך ברור. שמור פתרון באמבטיה עד לשימוש.
4. החל משחה עין לעין הנגדית שלא טופלה על מנת למנוע התייבשות במהלך הרדמה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר קון מספיקבאיבוד הכרה לשמור כיבה sternal. אל תחזרו עכברים שעברו פציעה בעין לחברה של עכברים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. עכברים צריכים להיות במעקב הדוק הבאים הפציעה. במקרה שהם מאבדים יותר מ -10% ממשקל גופם, סובלים משחיקה בקרנית, או אי נוחות, יש להפסיק את הניסוי. ממשל משככי כאבים חוזר בכל שעה 24 לאורך כל הניסוי.
5. באמצעות מזרק סטרילי, ללא מחט מחוברת אליו; תחול 200 פתרון μl טמוקסיפן מריחה על פני קרנית כולה של עין אחת של כל עכבר.
   הערה: הפתרון הנוזלי מתמצק במהירות על פני השטח העין בRT. ההשפעה של פגיעה בקרנית תלויה בחומרה של הפצע. בעקבות יישום אחד של פתרון טמוקסיפן / DMSO ללא תופעות לוואי שנצפו בעכברים. במקרה של בקשות חוזרות ונשנות ניתן לצפות אטימות קרנית.
6. המשך עם הכנה והדמיה של רקמות (ראה כתיונים 5 ו -6) בנקודות זמן רלוונטיות. לקבלת התוצאות מוצגות כאן, להקריב את העכברים (כמפורט בשלב 5.1) לאחר פציעת שבוע אחד (איור 2 ו ^-24).

תוצאות

לאחרונה, אנו נועדנו להצביע על המקור, ההישרדות והגירה של תאי גזע ותאי האפיתל של קרנית ^24. צבירת ראיות תומכת בדוגמא שאפיתל קרני נוצרה מחדש על ידי תאי גזע הממוקמים באופן בלעדי בנישת limbal, אזור בצורת טבעת בפריפריה הקרנית. תאוריה זו נתמכת על ידי במבחנה ובנתוני vivo, ועל ידי עדות קלינית שסיפקה את הבסיס לטיפול מוצלח חלוצי גזע limbal תא ^27-29. עם זאת, נושא זה נשאר התווכח מאוד בשנים האחרונות בשל מחקר המבוסס על ניסויי השתלת limbal שהציעו לימבוס העכבר אינו משתתף בחידוש קרני ^30. כדי לבדוק השערה מעניינת זה, ניסויי שושלת התחקות באמצעות עכברי R26R-קונפטי בוצעו, למעקב לגורלם של תאי גזע / אב אפיתל limbal והקרניים בתנאי מצב יציב לתקופה של עד 120 ימים ^24.עיניים enucleated וקרניות הר-שטוחות נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת לייזר confocal רפאים 10 ו -120 ימים הודעת הזרקת טמוקסיפן. כצפוי, אשכולות סדירים קטנים של תאי ניאון נצפו לאורך כל משטח העין 10 ימים לאחר ההזרקה, תוך 1-4 חודשים מאוחר יותר (איור 2 ו ^-24), פסים מוארכים הנמשכים מימבוס לכיוון המרכז קרני התפתחו לאט. תוצאה זו מרמזת כי הקרנית מחדש על ידי תאים שנודדים מימבוס לכיוון המרכז של הקרנית. לאחר מכן, התחדשות קרנית בתנאים פצעו נבדקה. על מנת לבחון את גורלם של תאים קרני / limbal K14-חיוביים תחת פצע תנאים תוך גרימת מעקב תא יעיל, אנו מומסים טמוקסיפן בsulfoxide דימתיל (DMSO), שגורם לפגיעה בקרנית על יישום מקומי. בדרך זו הצלחנו לגרום לפציעה קלה אם יישום מקומי יחיד יושם (איור 2 ג), מו הפחתת כוח מנוע ופצע אם טיפול לבד DMSO נוסף יושם ביום לפני גיוס טמוקסיפן או פצע חמור כאשר DMSO לבד היה למריחה על העור ב 2 ימים רצופים לפני גיוס טמוקסיפן.

בניגוד לפסים הדקים limbal שהתפתחו לאט והגיעו למרכז קרני בתוך 4 חודשים בתנאי מצב יציב, נדידת תאים בעקבות פציעה הייתה מהירה. למרבה הפלא, פסי limbal ארוכים ועבים כבר פיתחו בתנאים אלה בתוך 7 ימים. מעניין לציין, גיוון צבע היה לפעמים מינימאלי (איור 2 ד). בידיים שלנו, מדי פעם, בעיקר תאים אדומים זוהו בכל הקרנית, מצביע על כך שגיוון הצבע יכול להיות מוטה כלפי fluorophores הספציפי. הטיה לא רצויה זה יכול להיות מכויל על ידי בדיקות תגובת מינון כפי שדווחו בעבר ב ^-31 Br1.0L ובBr2.1 ^21.

les / ftp_upload / 53,370 / 53370fig1.jpg "/>
איור 1. איור סכמטי של מבנה R26R-קונפטי. () מבנה R26R-קונפטי מכיל אמרגן CAG לרמות ביטוי גבוהים, loxP (משולש שחור) -flanked -roadblock ניאו ^R וקלטת Brainbow2.1 במוקד Rosa26 ^16,21. קלטת Brainbow2.1 כוללת שני הדימרים-מוקף loxP ראש אל זנב. דימר אחת מורכב מחלבון-מקומי גרעיני ירוק ניאון (GFP) וחלבון אוריינטציה הפוך cytoplasmic צהוב ניאון (YFP, הנטייה inversed מיועדת - PFY). דימר השני מכיל RFP cytoplasmic וחלבוני ניאון ציאן קרום-קשור-אוריינטציה הפוכה (CFP, הנטייה inversed מיועדת - PFC) ^16. (ב - E) עם הפעלת Cre-recombinase, אירועי כריתה והיפוך שונים עלולים להתרחש; תוצאות אפשריות הן exemplifiאד בB - E. פעילות Cre גורמת התארגנות סטוכסטיים של הקלטת המובילה להסרות גן ו / או תנוחות הפוכות ובכך תוצאות בביטוי האקראי של אחד מארבעת חלבוני הניאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. שושלת קרנית התחקות תחת הומאוסטזיס ופציעה. R26R-קונפטי / עכברי K14-Cre הוזרקו 4 מ"ג טמוקסיפן כמפורט בפרוטוקול. בזמן המצוין נקודות לאחר אינדוקציה שיטחה קרניות היו צילמו (- B). פציעה קרנית יחד עם האינדוקציה Cre הושגה על ידי היישום המקומי של טמוקסיפן המומסים DMSO (C - D). תמונות פסיפס שהושגועל ידי רב-ערוצית ריצוף מיקרוסקופיה confocal רפאים מוצגים (- D). בהומאוסטזיס, פסי limbal הרדיאלי של תאים נודדים איטיים הוארכו בין ימבוס והמרכז קרני. פסים אלה התפתחו לאט, הגיעו למרכז קרני בתוך 4-5 חודשים (ב '). אשכולות של תאים קרני ניכרו גם (חיצים לבנים, ב '). לעומת זאת, פסי limbal גדולים הופיעו בתוך שבוע אחד בתנאי פציעה (C). דוגמא להטיה של גיוון צבע לתאים אדומים (ד '). גבול limbal-קרני מבואר על ידי קו מקווקו. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. קיצורים: CFP, חלבון פלואורסצנטי ציאן; GFP, חלבון ניאון ירוק; RFP, חלבון ניאון אדום; YFP, חלבון ניאון צהוב. נתון זה שונה ^מ24. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר שלנתון זה.

דיון

ניסויי שושלת התחקות נערכו במשך שנים רבות. השיפורים הטכנולוגיים האחרונים והופעתה של זני עכבר קונפטי פתחו אפיקים חדשים למחקר. היום, חוקרים יכולים ליהנות ממספר רב של קווים זמינים מסחרי רקמות ספציפיות Cre, עכברי נוקאאוט ועכברים מהונדסים. זה מספק הזדמנות לעיצוב מערכות תכליתית ניסיוניות לטיפול בשאלות מדעיות עם מומחיות בסיסית, הימנעות בפועל מייגע, תוך מתן נתונים חזקים ואמינים.

עכברי R26R-קונפטי הם כלי אלגנטי למעקב יעיל ולומד את הטבע והתנהגותם של תאים בגוף חי. המערכת קלה להקמה והיא מאפשרת מעקב שושלת לא פולשנית של תאים בודדים בעובר, נובעת התחדשות תאים תחת הומאוסטזיס, או בנסיבות שונות כגון פציעה, דלקת וסרטן. נתונים הזמינים מספק descript חזקיון של ההישרדות של תאים ממוקדים, הרחבת תא משובט ונדידת תאים, באופן לכימות. שלב קריטי יהיה לבחור את זן העכבר הגנטי המתאים שיכול באופן מהימן מאפשר תיוג רקמות ספציפי יעילים בשלב ההתפתחותי מדויק. מגבלה אחת של מערכת זו היא כי לניטור אורגניזם חי, הרקמה חייבת להיות נגישה ושקופה. כמו כן, מעקב רקמה עבה בתוך החי ניתן הקל רק על ידי שני פוטונים או במיקרוסקופ רב-פוטונים. עם זאת, מעקב תא אפשרי בסעיפי רקמות שלאחר המוות ואולי הרקמה שלמה ניתן ללמוד לאחר שהפך להיות שקוף בשיטת CLARITY ^32,33. מגבלה נוספת שיש להתחשב היא שלמרות שתאים סמוכים המבטאים את אותו fluorophore סביר שייכים לאותו שושלת משובט, אפשר גם שהם עלולים להיות מופקים ממקור תאים עצמאי שאופן אקראי הביע אותו גן הניאון. possibili זהטאי הופך להיות מאוד לא סביר בעת שימוש באללים Br מרובים כדי לאפשר שילובי צבעים רבים.

בעתיד, המשלב את מערכת קונפטי עם כלים גנטיים זמינים (כלומר, נוקאאוט, מודלים עכבר להתרפק ומהונדסים) יאפשר המחקר של גנים והמוטציות שלהם בבריאות ופתולוגיה. כמו כן, שושלת התחקות תחת הפרעות מערכת שונות (כלומר, נובע נישה תא הרס, אבלציה תא לייזר בתיווך, טיפול תרופתי) תביא תובנות חדשות על מעורבותם של מסלולי איתות בהחלטות גורל תא. סופו של דבר, השימוש קומבינטורית של תיוג ניאון ופליטת אור, כתבים גנטיים של מסלולי איתות וחיתוך מיקרוסקופיה קצה יספק לחוקרי מערכת חזקה כדי ללמוד כיצד אחד תאים מגיבים לסביבתם בסביבה הטבעית שלהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברים טרנסגניים R26R-Confetti הומוזיגוט לקלטת Brainbow 2.1	ג'קסון	#013731
עכברי K14-CreERT	ג'קסון	#005107
טמוקסיפן	סיגמא	T5648
איזופלורן USP Terrell	Piramal Critical Care
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	בשימוש בריכוז של 4  ומיקרו; g/ml
Immu Mount	Thermo Scientific	9990402
LSM 510 מערכת קונפוקלית לסריקת לייזר Meta המחוברת למיקרוסקופ ממונע הפוך (Axiovert 200M) המצוידת בשלב ממונע	Zeiss		החפיפה הספקטרלית בין GFP, YFP ו-CFG מחייבת שימוש בהדמיה ספקטרלית המאפשרת הפרדת ספקטרום הפליטה של החלבונים הפלואורסצנטיים. כאן אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי Zeiss LSM 510. לגלאי Meta הכלול במערכת זו יש 32 אלמנטים של גלאים שכל אחד מהם אוסף פליטה מפס גל של 10 ננומטר. טכניקה זו המכונה "טביעת אצבע ספקטרלית" מאפשרת למשתמש להגדיר את הגבולות המתאימים ביותר לסינון פס גל. יש מגוון מערכות קונפוקליות ספקטרליות שניתן להשתמש בהן, כולל Leica SP5 (ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 תוכנת הדמיה	Zeiss
Duratears-משחת עיניים	אלקון