מאמר שיטה

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

20K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53384

⸱

23 בדצמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר יצירה ואפיון אמינים של תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs) מנפח קטן של דם היקפי בוגר. BOECs יכולים לשמש כתחליף לתאי אנדותל מחולים עם הפרעות בכלי הדם וכמצע ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

תקציר

מבחינה היסטורית, הזמינות המוגבלת של תאי אנדותל ראשוניים מחולים עם הפרעות בכלי הדם עיכבה את חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקוד לקוי של האנדותל אצל אנשים אלה. עם זאת, הזיהוי האחרון של תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs), שנוצרו מאבות אנדותל במחזור בדם היקפי בוגר, עשוי לעקוף מגבלה זו על ידי הצעת תחליף תא ראשוני דמוי אנדותל לתאי אנדותל שמקורם בחולה. מעבר לערכם להבנת הביולוגיה של האנדותל ומודלים של מחלות, ל-BOECs יש שימושים פוטנציאליים בטיפולי השתלת תאי אנדותל. הם גם מהווים מצע תאי מתאים ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תכנות מחדש גרעיני, ומציעים מספר יתרונות על פני סוגי תאים אחרים. אנו מתארים שיטה להפקה, תרבית ואפיון אמינים של BOECs מדם היקפי של מבוגרים לשימוש ביישומים אלה ואחרים. גישה זו (i) מאפשרת יצירת תאי אנדותל ספציפיים לחולה מנפח קטן יחסית של דם היקפי בוגר ו-(ii) מייצרת תאים הדומים מאוד לתאי אנדותל ראשוניים במורפולוגיה, איתות תאים וביטוי גנים.

מבוא

עד לאחרונה, הדור שלאחר הלידה של כלי דם החדשים היה האמין להתרחש אך ורק באמצעות תהליך המכונה אנגיוגנזה כ, מוגדר כהנבטה של כלי דם חדשים מתאי האנדותל של כלי קיימים מראש. 1 תהליך זה מנוגד מvasculogenesis, או היווצרות דה נובו של כלי דם מהאבות אנדותל, שחשבו שיתרחשו באופן בלעדי בעובר. 2 עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה יותר זיהו ומבודדים במחזור תאי האנדותל אב (EPCs) בדם ההיקפי של מבוגרים. תאים אלה יש את היכולת להתמיין לתאי אנדותל בוגרים בתרבות ובהם האמינו להשתתף בvasculogenesis לאחר הלידה. 3,4

פרוטוקולים לבידוד והרחבת EPCs אלה בדרך כלל כרוכים בתרבות של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) בתקשורת המכילים גורמי גדילת אנדותל, כולל vasculגורם ar אנדותל צמיחה (VEGF) וצמיחה פיברובלסטים גורם-2. 5-8 תרבויות EPC לייצר מגוון רחב של סוגים שונים באופן דרמטי תא. תרבויות ראשוניות (<7 ימים) נשלטות על ידי סוג תא monocytic, ידוע בספרות כ" מוקדם "EPCs. למרות שמם, תאים אלה מבטאים את סמן CD14 מונוציטים, הם שליליים עבור CD34 סמן האב ולהביע את הרמות מזעריות בלבד של CD31 הקלאסי אנדותל הסמנים וVEGF קולט 2 (VEGFR2). 5 תרבות המשך מולידה אוכלוסייה משנית של תאים, ידוע כEPCs מאוחר תולדה או תאי האנדותל תולדת דם (BOECs), המופיעים מושבות דיסקרטיות לתאי האנדותל כמו-. בניגוד לEPCs המוקדם monocytic, BOECs, שגם היה נקרא תאי האנדותל מושבה להרכיב (ECFCs), תאי האנדותל תולדה או תאי האנדותל מאוחר תולדה, התערוכה המורפולוגיה המרוצפת שאופייני לmonolayers תא אנדותל ודומה מאוד בסמן משטח5 וגן ביטוי 9 להבשיל לתאי אנדותל.

הדור של תאי האנדותל כמו-מהדם היקפי מציע מספר יתרונות, במיוחד לחקר תפקוד התא האנדותל קשור עם הפרעות כלי דם כגון יתר לחץ דם עורקי ריאתי (PAH) 10 או פון Willebrand מחלה. 11 לפני הזמינות של BOECs, אנדותל תאים יכולים לנבוע רק מאיברי explanted בעת מוות או השתלת איבר, או מבודד מוריד הטבור בלידה. זמינות מופחת מיוצג מגבלה רצינית להבנת הביולוגיה של תאי האנדותל מחולים עם הפרעות לב וכלי דם, כמו גם את יחסי הגומלין בין תאי האנדותל וגם תאי דם או תאי ציור קיר. יתר על כן, הבידוד וculturing אוכלוסייה טהורה של תאי האנדותל ממקורות אלה הוא מאתגרים מבחינה טכנית והתאים שהופקו על ידי שיטות אלה מפגינים רק limiteיכולת שגשוג ד. BOECs לכן מציע תחליף בעל ערך לבידוד והתרבות של תאי האנדותל עיקריים הנגזר מטופל.

בנוסף ליישומים שלהם במבחנה, BOECs גם שעשוי להיות שימושי בטיפולי השתלה אוטולוגית של תאים. יישומים אלה כוללים שתי השתלת אנדותל התא לקדם neovascularization (ראה 12 והפניות בו), כמו גם את הדור של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs). 13 iPSCs נגזר BOEC יכול לשמש לדוגמנות מחלה ומציעים פוטנציאל עצום כהתחלה חומר לטיפולים בתאים אוטולוגית. BOECs לתכנת מחדש מהר יותר ועם יעילות גבוהה יותר מאשר fibroblasts עור. יתר על כן, BOECs גם לאפשר לדור של iPSCs שהם ללא חריגות karyotypic, אשר היא תכונה חיונית של כל טכנולוגיה שתהיה מתאים ליישומי translational. היכולת ליצור iPSCs מדגימת דם חולההסימפונית מבטל את הצורך בביופסיה של עור ואת הדור של fibroblasts עור, ובכך להקל על הדור של תאים מחולים עם הפרעות ריפוי פצע, או צעירות מאוד.

הפרוטוקול המפורט להלן, שאושר על ידי ונערך בהתאם להנחיות ועדת האתיקה הלאומית למחקר השירות (מזרח אנגליה), מספק שיטה פשוטה ואמינה לדור של BOECs ביעילות רבה יותר מ -90% מנפח קטן יחסית (60 מיליליטר) של דם היקפי. תאים אלה הם שגשוג מאוד ויכולים להיות passaged שוב ושוב, ומאפשרים לדור של מאה מיליון תאים מדגימת דם אחת.

פרוטוקול

סכמטי של פרוטוקול דור BOEC מוצג באיור 1.

צנטריפוגה שיפוע אוסף וצפיפות 1. דם

  1. לכל תורם, להוסיף 3 מיליליטר של נתרן ציטרט לכל אחד מצינורות צנטריפוגות חרוטי שני 50 מיליליטר. לאסוף 60 מיליליטר של דם על ידי venipuncture ולהוסיף 30 מיליליטר לכל צינור. היפוך בעדינות 2-3 פעמים כדי לערבב. השתמש קטן כמו 40 מיליליטר של דם בפרוטוקול, עם כרכי ציטראט בהתאם.
    הערה: זה חיוני כי דגימות דם מעובדות בתוך 2 שעות של אוסף. מושהה עיבוד של תוצאות דם בירידה ניכרת בתשואת מושבה תולדה.
  2. הכן צינורות חרוטי חדשים המכילים בינוני צנטריפוגה שיפוע צפיפות על ידי היפוך הראשון הבקבוק כמה פעמים כדי לערבב. במנדף סטרילי, להוסיף 15 מיליליטר של מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות לצינור חרוטי 50 מיליליטר (1 צינור לכל 10 מיליליטר של דם, 6 צינורות לתורם).
  3. לדלל דם 1: 1 עם פוספט Dulbecco שלמלוח -Buffered (DPBS). הטה את הצינור המכיל מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות לזווית של 20 מעלות עם משטח העבודה. באמצעות סיוע פיפטה וטפטף סרולוגיות 25 מיליליטר, שכבה לאט 21 מיליליטר של דם מדולל על גבי המדיום על ידי הוספת דם בהדרגה במורד הקיר של הצינור הנטוי.
    הערה: אם תעשה זאת תהיה למזער ערבוב של הדם עם שכבת שיפוע צפיפות ויפיק מעיל הדוק באפי, כמו גם תשואה משופרת.
  4. דגימות צנטריפוגה ב 400 XG במשך 35 דקות ב RT עם המאיץ והבלם מ.
  5. במהלך תקופה זו צנטריפוגה, להתחיל ציפוי קולגן המפורט בצעדים 2.1-2.4. להבטיח את השלבים הבאים כבר הושלמו לפני שימשיכו לשלב 3.1.

2. קולגן ציפוי של T-75 בקבוק והכנה של תרבות בינונית

הערה: בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים.

  1. הכן פתרון קולגן / מיליליטר 50 מיקרוגרם ידי דילול המניות טאיpe אני קולגן 10 מיליליטר של 0.02M חומצה אצטית דוגמא:. למניית קולגן בריכוז של 4.05 מ"ג / מיליליטר, להוסיף 123.5 μL של קולגן 10 מיליליטר של חומצה אצטית 0.02 M. ההשעיה קולגן סינון סטרילי לפני השימוש.
  2. בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 7.5 מיליליטר של תמיסת קולגן לבקבוק תרבית תאי T-75. נפח זה נותן 5 מיקרוגרם קולגן / 2 סנטימטר (או 375 מיקרוגרם / בקבוק). בקבוק מעיל עבור שעה 1 ב RT.
  3. הכן את מדיום גידול האנדותל המשמש לייצור BOEC ידי השלמה בינונית בסיסי אנדותל עם תוספי גורם גדילה הניתנים על ידי היצרן. הוסף את כל התוספים, אבל לא להוסיף סרום. כדי להכין 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC, להוסיף 2.5 מיליליטר של סרום שור עוברי מוגדר (FBS) 12.5 מיליליטר של מדיום גידול האנדותל המכיל תוספי גורם גדילה.
  4. להמשיך בצעדים המפורטים בסעיף 3. לאחר תקופה ציפוי 1 שעה, לשאוב את פתרון קולגן ולשטוף את החומצה אצטית שייר ידי pipettingב 10 DPBS מיליליטר. לשאוב את DPBS וחזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. אם ההשעיה התא שהושגה במהלך שלב 3.3 אינה מוכנה לציפוי בשלב זה, להוסיף 5 מ"ל של מדיום דור BOEC לבקבוק כדי לשמור על ציפוי קולגן מהתייבשות.

3. איסוף וציפוי של PBMNCs

  1. בעקבות צנטריפוגה שיפוע צפיפות המתוארת בשלב 1.4, לאסוף בזהירות את שכבת מעיל באפי בעזרת פיפטה העברה פלסטיק סטרילי. אוסף של המעיל באפי אמור להניב כ 20 מיליליטר של השעיה תא ופלזמה מצינור אחד. הימנע העברה בינוני שיפוע צפיפות.
  2. לדלל את ההשעיה תא mononuclear 1: 1 בDPBS ולהפוך לערבב. צנטריפוגה ב RT במשך 20 דקות ב 300 XG עם בלם ודוושת גז במקסימום.
  3. בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את תאי supernatant וגלולים על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום דור BOEC לכל גלולה וpipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. תא בריכת השעיותהעליון עד נפח כולל ד עד 10 מיליליטר עם המדיום שנותר.
  4. כדי לקבל הערכה של מספר הכולל של תאים, מדגם 10 μl של השעיה תא ולדלל 50x עם 490 μl של הפתרון של טורק, שlyse תאי דם אדומים. רוזן מדגם 10 μl של ההשעיה התא המדולל באמצעות haemocytometer.
    הערה: 60 מ"ל של דם אמור להניב כ 100-150 x 10 6 תאי דם לבנים לציפוי.
  5. השעיה צלחת כל תא לבקבוק T-75 בודד, מצופה קולגן, נפח העליון עד בינוני ל15 מ"ל / בקבוק ותרבות על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. תאים מצופים בשלב זה מייצגים מעבר 0.
    הערה: אפשר להקפיא את PBMNCs המבודד לפני בידוד BOEC כדי לגזור את BOECs במועד מאוחר יותר או כדי להעביר את PBMNCs למעבדה שונה שבי יכול להיות שנוצרה BOECs. עם זאת, חשוב לשים לב כי PBMNCs הקפאה יכולה להפחית את היעילות של בידוד BOEC. Sסעיף 8 להלן EE לשיטה.

תרבית תאים 4. לטווח ארוך

  1. שנה בינונית כל 2 ימים על ידי הוספת 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC הטרי (5: 1 תערובת של מדיום גידול תא האנדותל ומוגדר FBS). לסופי שבוע, יכולים להתעכב שינויים בינוניים לכל 3 ימים.
    הערה: מושבות תולדה אמורות להופיע בין 7 ו -14 ימים של התרבות.
  2. צג בקבוק תרבות BOEC בימים 7-14 להופעתו של מושבות תולדה. לזהות מושבות כקבוצות מעגליות של תאים מציגות מורפולוגיה מרוצפת אנדותל קלאסית.
  3. ברגע שמושבה או במושבות מרובות מזוהות בבקבוק, תמשיך עם שינויים בינוניים ולאפשר מושבות לגדול לכ 1000-2000 תאים לכל מושבה לפני passaging. לקבוע את המספר הסלולרי למושבה דרך אומדן חזותי גס.
    הערה: כמדריך, נהוג מושבות תולדה ראשוניות מעבר שבוע לאחר זיהוי של המושבה תולדה הראשונה.
  4. תאי מעבר על ידי שטיפת צלוחיות פעמיים עם 10 מיליליטר של DPBS. הוסף 5 מיליליטר של 1X טריפסין-EDTA ודגירה בחממה 37 ° C במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, לנטרל טריפסין עם 10 מיליליטר של מדיום (המכיל FBS) ולהביא להשעית תאים עם pipetting חוזר ונשנה.
  5. ההשעיה צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, resuspend ב 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC הטרי וצלחת ההשעיה תא כולו לT-75 בקבוק חדש (המייצג מעבר 1, P1). אין ציפוי קולגן נדרש.
  6. המשך שינויים בינוניים כמתואר לעיל עד תאים (בערך 3-5 x 10 6 תאים לכל בקבוק) ומחוברות. ברגע שמחוברות, תאי מעבר כמתואר בשלב 4.3.
    הערה: ממעבר 2 ואילך, תאים כבר לא דורשים בינוני דור BOEC ויכולות להיות מתורבת במדיום גידול תא האנדותל וFBS חום מומת הסטנדרטי של 10%. ציפוי קולגן יכול לשמש כצעד אופציונאלי הולך קדימה, כמו שיש ראיות לכך שהנוכחות של קולגן יכולה לשפר prolifer BOECשיעורי ני.
  7. לpassaging המשך, צלחת לא פחות מ 750,000 תאים לכל T-75 בקבוק כצפיפות תא נמוך יכולה לגרום BOECs להפסיק מתרבים.

5. הקפאה והפשרת תרבויות BOEC

  1. Trypsinize תאים כפי שתואר בסעיף 4.3 ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר של מדיום. זה אינו דורש בינוני צמיחת תאי אנדותל; DMEM עם FBS הסטנדרטי 10% יהיה מספיק. לאסוף דגימת 10 μl של ההשעיה התא לבצע ספירת תאים ידנית באמצעות haemocytometer.
  2. צנטריפוגה שוב וגלול ב2x10 6 תאים / מיליליטר במדיום הקפאה קר כקרח (DMEM 40% FBS עם 50% ו -10% DMSO). הוסף 0.5 מיליליטר (10 6 תאים) לכל בקבוקון, בקבוקוני מקום בכלי קרח isopropanol הקרה הקפאה ומקום במקפיא -80 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני העברה לחנקן נוזלי. אל תשאירו תאים ב -80 ° C במשך יותר מ 24 שעות.
  3. להפשיר תאים, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום מראש חימם לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר.
    הערה: כאשר מפשירים את המעבר 1 תאים, להפשיר למדיום גידול תא האנדותל בתוספת 20% הגדירו FBS עבור 2 הימים הראשונים לאחר הפשרה. זה מוביל לבידוד תא יציב יותר הולך קדימה.
  4. הסרת תאים מחנקן נוזלי והפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה עד שרק גביש קרח קטן שנשאר בבקבוקון. מוסיף את תכולת בקבוקון ירידה מבחינת לצינור צנטריפוגות חרוטי וספין למטה XG ב 300 במשך 5 דקות.
  5. לשאוב supernatant ותא גלולה גלול בFBS + 10% 10 מיליליטר EGM-2MV. הוסף לבקבוק T-75 ועליון עד בינוני עד 15 מיליליטר.

6. אפיון BOECs ידי cytometry הזרימה

  1. ברגע שמושבות BOEC המתואר בסעיף 4 כבר מותרת להרחיב, trypsinize תאים כפי שתוארו בסעיף 4.4 וגלול בריכוז של 10 6 תאים למ"ל במאגר מכתים (שנינות DPBSh 2% FBS ו -2 מ"מ EDTA).
  2. לשלב 10 5 תאים עם נוגדני fluorochrome מצומדות המכוונים נגד (כל שעת 1:20 דילול שימוש) CD45, CD14, CD34, CD31 או VEGFR2 (לדלל 01:10) (ראה טבלה 1 לפרטים מלאים). דגירה של 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
  3. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר מכתים חיץ צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וגלול ב400 חיץ מכתים μl לניתוח. שמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור לפני הניתוח.
  4. ביצוע ניתוח cytometric על cytometer המצויד כדי לזהות את הנוגדנים מצומדות fluorescently בשימוש assay.
  5. השתמש במדגם BOEC בלא כתם לזהות אוכלוסיית התא על cytometer ידי התאמה קדימה ומתחי צד פיזור, כמו גם המתחים לערוצי FITC וAPC.
  6. לקבוע gating ספים באמצעות תאי אלוטיפ מוכתם לכל fluorochrome. להעריך חיובי עבור כל סמן פני תא המבוסס על presencדואר של משמרת שיא בעוצמת הקרינה לעומת שליטת אלוטיפ לfluorochrome להיות מנותח.

7. אפיון BOECs ידי Immunofluorescent מיקרוסקופית

  1. BOECs צלחת ב24-היטב, צלחת תרבית רקמה שטוח תחתונה ללא coverslips בצפיפות של 5 x 10 4 תאים ב500 μl של מדיום גידול תא האנדותל + 10% FBS בכל טוב ולהשאיר לדבוק ולגדול ב 37 חום מומת מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד תאים לכסות לפחות 70-80% משטח הפנים של כל טוב (confluency הערכה על ידי בדיקה ויזואלית תחת microsope אור).
  2. לשטוף את התאים בכל טוב במשך 5 דקות עם 1 מיליליטר של DPBS.
  3. תקן תאי O / N ב 4 ° C עם 500 μl של 4% פתרון paraformaldehyde בDPBS.
  4. לשטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם 1 מיליליטר של DPBS בכל טוב. הוספה והסרה של DPBS בעזרת פיפטה וaspirator, בהתאמה.
  5. Permeabilize תאים עבור 3 x 10 דקות עם 0.2% polysorbate 20 בDPBS.
  6. דגירה תאים עבור שעה 1 ב RT בחסימת מאגר המכיל 10% FBS בDPBS.
  7. תאי כתם על 4 מעלות CO / N 300 μl של חיץ דילול נוגדן (0.1% אלבומין בסרום השור בDPBS) המכיל נוגדנים עיקריים המכוונים נגד CD34 (10 מיקרוגרם / מיליליטר), CD144 (1: 300) או vWF (1: 250) . ראה טבלת 1 לפרטים מלאים.
  8. לשטוף את הנוגדנים מאוגד עיקריים במשך 5 x 10 דקות עם DPBS.
  9. דגירה תאים עבור שעה 1 ב RT עם הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently המתאימים, כמפורט בטבלה 1 (כל יום 1: 200).
  10. לשטוף את הנוגדנים משני מאוגד ל5 x 10 דקות עם DPBS.
  11. דגירה תאים עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בDPBS במשך 10 דקות ב RT.
  12. לשטוף את התאים עם DPBS לדקות 3 x 5 נוספות.
  13. תאי תמונה בהגדלה 100x באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במקור אור חיצוני לעירור הקרינה, וללכוד תמונות באמצעות לצרףמצלמה דיגיטלית אד למחובר ניתוח שלאחר מכן.

8. PBMNCs ההקפאה להפשרה

  1. בסופו של שלב 3.2, בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וידני לשבש את התא גלולה עם pipetting למעלה חזר ולמטה באמצעות קצה פיפטה P1000. הוסף 1 מיליליטר של מדיום הקפאה, סרום 90% וDMSO 10%, והקפד לערבב בעדינות כדי לייצר השעיה תא. מעבירים את ההשעיה התא לcryovial ולהקפיא ולהפשיר כאמור בסעיף 5.

תוצאות

בידוד של תאי mononuclear המעיל באפי מ- 60 מיליליטר של דם בדרך כלל תשואות 100-150x10 6 תאי דם לבנים הכולל. כאשר מצופה לתוך T-75 בקבוק אחד, המספר הגדול של תאים בתרחיף תאי unlysed מקשה לפתור תאים חסיד פרט באמצעות מיקרוסקופ brightfield. שינויים בינוניים חזרו לגרום לשחרור של תאים שאינם חסיד ולאפשר להדמיה של האוכלוסייה חסיד של monocytic "מוקדם" EPCs. ביום 7, T-75 יכילו כ 7x10 6 תאים חסיד המוארכים אלה. מיום 7 עד 14, מושבות של BOECs אמורות להופיע בתוך הבקבוק (איור 2 א). מושבות יופיעו כ3 עד 5 תאים סמוכים ראשונה. מספר מושבה תולדה יכול להשתנות 1-10 מושבות בכל 60 מיליליטר של דם. בדרך כלל, תורמים צעירים (כלומר, 20-25 שנים) נוטים לייצר מספר גדול יותר של מושבות תולדה, שגם מופיעות מוקדם יותר בתרבות.BOECs להתרבות מקבוצה מרכזית זו של תאים ליצור מושבות עגולות בהיקף של כמה מאה תאים. תאים בתוך מושבות אלה מפגינים מורפולוגיה מרוצפת אנדותל קלאסית.

עדיף מושבות ראשוניות מעבר כאשר הם מכילים כ 1000 תאים לכל מושבה. מושבות תולדה בדרך כלל להגיע לגודל זה 7 ימים לאחר ההופעה המקורית שלהם בתרבות. ברגע שהמושבות המקוריות passaged לתוך T-75 בקבוק חדש, הם צריכים להתרבות בצורת monolayer ומחוברות (3-5x10 6 תאים לכל בקבוק) בתוך 5 ימים או פחות (איור 2). באחוז קטן של בידודים (<10%), מושבות תולדה אינן מופיעות, או לא מספיק להתרבות הבא צעד passaging ראשוני זה. BOECs כי התערוכה התפשטות נמוכה לאחר passaging הראשון שלהם כמעט ולא ללכת על מנת להפוך בידודי BOEC יציבים ולעתים קרובות להפסיק מתרבים בתוך שנים עד שלושה קטעים. MonocyticEPCs המוקדם בתוך תרבויות BOEC הינו ללא שגשוג ונמחקים בדרך כלל מהתרבויות בתוך 1-2 קטעים. חיסול של תאים מוקדמים אלו נובע מוות של תאים, כישלון של התאים המוקדמים מחדש לדבוק לאחר passaging ודילול של EPCs המוקדם אינו השגשוג עם passaging חוזר ונשנה.

או יכולים להיות passaged תאי 1 מעבר נוסף בתרבות או קפוא מטה לשימוש מאוחר יותר. ברגע שבידוד יציב שנוצר, ניתן passaged תאים בשיעור של בקבוק ומחוברות 1 עד 3-5 T-75 צלוחיות חדשות עד מעבר 8 או 9 לפני שהפכתם שקט. שוב, צפיפות תאים היא קריטית בכל תרבות. מניסיוננו, צריכים להיות מצופים לא פחות מ 750,000 תאים בבקבוק T-75, כפי שצפיפות תא תחתונה יכול לגרום למעצר צמיחה. למרות פוטנציאל השגשוג הגבוה של BOECs, צריכים גם לא יורשו תאים להפוך overconfluent (כלומר.,> 5x10 6 תאים לכל בקבוק) כמו זה יכול לגרום convers יון של BOECs לפנוטיפ הלא שגשוג.

אנו מציעים שכל תא שכותרתו כBOEC צריך להציג פני תא מתאים וצביעה תאית לסמנים האנדותל. אפיון של BOECs יכול להיות מושגת על ידי cytometry זרימה (איור 3) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4), הבא מכתים עבור סמני תא האנדותל טיפוסיים. BOECs הם חיוביים עבור CD31 סמני משטח אנדותל וVEGFR2 ושליליים עבור CD14 סמן מונוציטים וCD45 הסמן פאן-יקוציט. BOECs גם posess גופי Weibel-Palade ובכך להביע את פון Willebrand פקטור (vWF) כמכתים בדיד, punctate cytoplasmic. בניגוד לסוגים אחרים בוגרים אנדותל תא, כגון עורק ריאה או תאי האנדותל אב העורקים, BOECs גם להביע את האב וCD34 סמן הפעלה על פני השטח שלהם.

ftp_upload / 53,384 / 53384fig1.jpg "/>
איור 1. תרשים סכמטי של פרוטוקול דור BOEC. תאי דם היקפי mononuclear מבודדים מהדם ורידים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ותרבותי על צלחות מצופים קולגן במדיום גידול האנדותל מכיל מוגדר FBS. מושבות BOEC מופיעות בתוך 7-14 ימים של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-1
איור 2. תמונות Brightfield של תרבויות BOEC נציג. () מושבות תולדה מופיעות בתרבויות בין ימים 7 ו -14 מושבות הנוכחיים כאוספים של תאי האנדותל כמו-, אשר מסודרים בשכבה מרוצפת ולהתרבות רדיאלית החוצה מתוך נקודה מרכזית. המקיף את מושבות תולדה הן מונו חסידתאי cytic שמרכיבים את הרוב המכריע של תאים בתרביות מוקדמות. תאים אלה, שתוארו בעבר כ" מוקדם "ותאים אנדותל, יש מורפולוגיה כמו ציר-ולהביע CD14 סמן monocytic. (ב) בעקבות passaging, BOECs השגשוג מאוד להשתלט על תרבויות, כמו התאים monocytic הלא השגשוג או למות או להיכשל לצרף מחדש לאחר passaging. 250μm בר סולם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 3. אפיון של BOECs ידי cytometry זרימה. BOECs היה trypsinized ומוכתם עם נוגדני fluorescently- מצומדות שליטת אלוטיפ (אפור שיא מלא) או נוגדנים מכוונים נגד סמנים ספציפיים משטח (קו אדום). סמני משטח לאפיון cytometricכולל סמני hematopoietic CD45 וCD14, הסמנים האנדותל CD31 וVEGFR2 וprogentior וסמן הפעלת האנדותל CD34. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 4. מכתים Immunofluorescent של BOECs לסמני תא האנדותל. תמונות immunofluorescence נציג של BOECs immunostained עם נוגדנים המכוונים נגד הסמן פני תא אנדותל CD144 (VE-cadherin, פנל ימני עליון) וגליקופרוטאין הדם פון Willebrand פקטור (vWF, פנל ימני תחתון) . לוחות מקבילים מראים מכתים DAPI גרעיני מוצגים בצד השמאל. 50μm בר סולם. לCD144. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של נתון זה.

דיון

אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר גזירה חזקה ויעילה של BOECs מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי בוגר (PBMNCs). הפרוטוקול שלנו כולל שני חידודים חשובים המייצגים התקדמות בשיטות קודמות של בידוד BOEC. 14-16 אלה כוללים היעדר הפרין במדיום התרבית הראשוני של PBMNC ושימוש בסרום מוגדר ומוסמך לתאי גזע עובריים. לעידון האחרון הזה יש חשיבות מיוחדת. סרום מוסמך לתאי גזע עובריים (ESC) הוא דרגה עקבית יותר של סרום, ולמרות שעדיין לא ידוע אילו רכיבים מועשרים בסרום המועילים לבידוד BOEC, ההשפעה של סרום מוגדר זה על יעילות ייצור BOEC ברורה בידינו. בנוסף, הייתה לנו הצלחה גם בבידוד BOECs באמצעות סרום אנושי, ובכך אפשרנו יצירת BOECs לתרגום קליני. בידינו, פרוטוקול מעודן זה מביא לבידוד מוצלח של תרביות BOEC יציבות מיותר מ-90% מהתורמים, מה שהופך אותו לאחת משיטות יצירת ה-BOEC האמינות ביותר שדווחו עד כה. למרות שהשימוש בנסיוב מסוים הוא קריטי ליצירת BOEC, הוא גם מייצג מגבלה ראשונית של הפרוטוקול הנוכחי. שיפורים עתידיים בטכניקה יכולים לכלול יצירת תאים אלה בתנאי תרבית מוגדרים ללא סרום.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים עיבוד דגימות דם בהקדם האפשרי לאחר האיסוף, קציר מלא של תאי הפרווה של באפי לאחר צנטריפוגה בשיפוע צפיפות ומעבר בזמן של מושבות ראשוניות מ-P0 ל-P1. צעד מעבר זה הוא קריטי לביסוס בידוד יציב. כמו תאי אנדותל אחרים, נראה כי BOECs רגישים מאוד לצפיפות הציפוי. אם צפיפות הציפוי לאחר המעבר נמוכה מדי, ה-BOECs לא יתרבו. לעומת זאת, אם נותנים למושבות להתכנס יתר על המידה לפני המעבר, התאים גם יפסיקו להתרבות ותהיה להם נטייה להפוך לפנוטיפ תאים מוארך ומזנכימלי. אם מופיעות מעט מושבות בין הימים 7 עד 14, או אם המושבות קטנות בגודלן, פתרון בעיות יכול לכלול הגדלת צפיפות התאים על ידי העברת מושבות P0 לבקבוק T-25 במקום T-75.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשתמש ב-BOECs המתקבלים במספר יישומים, כולל מחקרי מבחנה של ביולוגיה של תאי אנדותל, מידול מחלות וסינון תרופות, כמו גם טיפולי השתלת תאים in vivo . שיקול חשוב להתפתחות של כל תהליך טיפול תאי הוא שימוש בתאים נקיים ממוטציות פתוגניות. הראינו בעבר כי BOECs שבודדו באמצעות הפרוטוקול שלנו מכילים גנומים נקיים משינויים במספר העותקים ולכן מייצגים את האדם שממנו הם נאספו. בנוסף, הוכחנו גם שרוב קווי ה-iPSC שמקורם ב-BOEC נקיים משינויים במספר העותקים. 13 זה מנוגד לדיווחים קודמים על שונות במספר העותקים ב-iPSCs שמקורם בפיברובלסטים. נכון להיום, תאים אלה נותרו ה-iPSCs היחידים שעבורם דווח על רמה זו של נאמנות גנומית. תכונה זו חשובה לתחום הביולוגיה של iPSC והשימוש ב-iPSCs במודלים של מחלות, סינון תרופות וטיפולים עתידיים להשתלת תאים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שמומנו על ידי קרן הלב הבריטית (BHF), קרן הדינוזאורים, קרן מקאלפין, Fondation Leducq, Fight for Sight, מרכז המחקר הביו-רפואי של קיימברידג', המכון הלאומי לחקר הבריאות כולל (i) מרכז BHF אוקסברידג' לרפואה רגנרטיבית [RM/13/3/30159], (ii) מרכז BHF קיימברידג' למצוינות במחקר, (iii) בית החולים של אדנברוק, קרן NHS של בתי החולים האוניברסיטאיים של קיימברידג' ו-(iv) בית החולים פפוורת' NHS Foundation Trust, ותמכה במרכז הפנוטיפינג של תאים BRC של קיימברידג'. MLO ממומן על ידי מלגת ביניים של BHF. FNK ממומן על ידי סטודנטים לדוקטורט של BHF.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>לאיסוף דם
60 מ"ל מזרק עם קצה לואר-לוקBD309653
19G Surflo Winged Infusion SetTerumoSV-19BL
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיStarLabE14502 לכל תורם
נתרן ציטראטMartindale Pharmaceuticals270541
NameCompanyCatalog NumberComments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)Sigma-AldrichD8537
פיפטות העברת פלסטיק עטופות סטריליותאפלטוןוודס KC231
Turk' s SolutionMillipore1.093E+09
NameCompanyCatalog NumberComments
לתרבית תאים, מעבר והקפאת תאים
קולגן מסוג 1 (נגזר מזנב חולדה)BD Biosciences35-4236
דולבקו s PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)Sigma-AldrichD8537
0.02M חומצה אצטית סיגמא-אולדריץ'A6283מוכן במים בדרגת ריאגנט
גידול אנדותל בינוני-2MV
(מכיל ערכת כדורים, אך לא סרום)		LonzaCC-3202הערה: חיוני שהמדיום לא יכיל הפרין.   
אין להשתמש EGM-2.
סרום בקר עוברי (ארה"ב), מוגדרתHycloneSH30070
10x Trypsin EDTAGibcoT4174לדלל ל-1x ב-PBS לפני השימוש ב-FBS
Gibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty מיכלהקפאהSigma-AldrichC1562
Name>CompanyCatalog Number>Comments
>לאפיון ציטומטרי זרימה>
מצומד עכבר אנטי אנושי CD14BD Biosciences555397עכבר IgG1k, שיבוט: WM59
דילול: 1:20
עכבר מצומד FITC אנטי אנושי CD31BD Biosciences555445עכבר IgG1k, שיבוט: WM59
דילול: 1:20
עכבר מצומד APC אנטי אנושי CD34BD Biosciences555824עכבר IgG1k, שיבוט: 581/CD34
דילול: 1:20
עכבר מצומד FITC אנטי אנושי CD45BD Biosciences560976עכבר IgG1k, שיבוט: HI30
דילול: 1:20
  עכבר מצומד APC אנטי אנושי VEGFR2R& D SystemsFAB357Aעכבר IgG1, שיבוט: 89106
דילול: 1:10
עכבר מצומד FITC IgG1k בקרת איזוטיפBD Biosciences555748שיבוט: MOPC-21
דילול: 1:20
עכבר מצומד APC IgG1k בקרת איזוטיפBD Biosciences555751שיבוט: MOPC-21
דילול: 1:20
עכבר מצומד APC IgG1k בקרת איזוטיפR& D SystemsIC002A
דילול: 1:10		שיבוט: 11711
EDTA, תמיסה 0.5MSigma-AldrichE7889
NameCompanyCatalogComments
עבור מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית&;
Corning Costar 24-well צלחת תרבית רקמותסיגמא-אולדריץ'CLS3527
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'158127
BSAסיגמא-אולדריץ'A7906
פוליסורבט 20סיגמא-אולדריץ'P2287
עכבר חד-שבטי אנטי אנושי CD34 נוגדןR& D SystemsMAB72271Clone 756510, IgG1, שימוש ב-10 μ גרם/מ"ל
עז פוליקלונלית אנטי-אנושית VE-cadherin (CD144)R& D SystemsAF938Antigen affinity- IgG מטוהר , שימוש ב-1:300
ארנב חד-שבטי אנטי-אנושי Von Willebrand Factor (vWF)Abcamab154193Clone EPSISR15, שימוש ב-1:250
נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר חמור, Alexa Fluor 488 מצומדLife TechnologiesA-21202פוליקלונלי, 2 מ"ג/מ"ל, שימוש ב-1:200
נוגדן משני IgG נגד עזים (H+L) חמור, מצומדAlexa Fluor 488Life TechnologiesA-11055פוליקלונלי, 2 מ"ג/מ"ל, 1:200
נוגדן משני IgG (H+L) נגד ארנב חמור, Alexa Fluor 568 מצומדLife TechnologiesA-10042פוליקלונלי,  2 מ"ג/מ"ל, 1:200
DAPI (4&פריים;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד)Sigma-AldrichD9542שימוש ב-1 μ גרם/מ"ל

מקורות

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד דם פריפריסנטריפוגה במדרג צפיפותציפוי קולגןמצע להפקת BOECפרוטוקול תרבית תאיםסממנים של תאי אנדותלאימונופלואורסצנציה של CD144צביעה לגורם פון וילברנדשיטת הקפאה לשימור (קריו-שימור)
דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.