בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

סיכום

פותחה שיטה לזיהוי אנדוספורים חיידקיים מקהילות מיקרוביאליות מורכבות לביצוע תרבית מותאמת אישית או מחקרים מולקולריים של קבוצת חיידקים זו.

תקציר

היווצרות אנדוספור היא אסטרטגיית הישרדות הנמצאת בקרב חיידקים מסוימים ממשפחת Firmicutes. במהלך היווצרות נבגי אנדוספור, חיידקים אלה נכנסים למצב מנוחה מורפו-פיזיולוגי המשפר את ההישרדות בתנאים סביבתיים קשים. למרות ש-Firmicutes יוצרי אנדוספורים הם אחת מקבוצות החיידקים המועשרות והמבודדות בתדירות הגבוהה ביותר במחקרי תרבות, הם נעדרים לעתים קרובות ממחקרי גיוון המבוססים על שיטות מולקולריות. ההתנגדות של ליבת הנבגים נחשבת לאחד הגורמים המגבילים את התאוששות ה- DNA מאנדוספורים. פיתחנו שיטה המנצלת את העמידות הגבוהה יותר של אנדוספורים כדי להפריד אותם מתאים אחרים בקהילה מיקרוביאלית מורכבת בשיטות ליזה פיזיקליות, אנזימטיות וכימיות. התכשיר האנדוספורי בלבד המתקבל כך יכול לשמש לתרבית מחדש או לביצוע ניתוח במורד הזרם כגון מיצוי DNA מותאם אישית המותאם לאנדוספורים וריצוף DNA לאחר מכן. שיטה זו, המיושמת על דגימות משקעים, אפשרה העשרה של אנדוספורים ולאחר ריצוף, חשפה מגוון גדול של יוצרי אנדוספורים במשקעי אגמי מים מתוקים. אנו מצפים כי יישום שיטה זו על דגימות אחרות יניב תוצאה דומה.

מבוא

המטרה של עבודה זו היא לספק פרוטוקול להפרדת endospores חיידקים מתאי חיידקים וגטטיבי בדגימות סביבתיות. ההיווצרות של endospores חיידקים היא אסטרטגיית הישרדות, בדרך כלל מופעל על ידי רעב, שנמצאה במספר קבוצות חיידקים המשתייכות למשפחה החסרה ¹ Firmicutes. חיידקי יוצרי Endospore נלמדים היטב, בעיקר בגלל מספר זני פתוגנים ומכאן חשיבות רפואית (למשל, anthracis Bacillus או קלוסטרידיום). זני סביבה של חיידקי יוצרי endospore היו מבודדים מכמעט כל סביבה (קרקע, מים, משקעים, בטן חיות אוויר, קרח, מעיים אנושיים, ועוד) ^1-3. לכן, Firmicutes הוא המערכה הזאת השנייה בשכיחותו באוספי תרבות ^4.

פרוטוקול

1. הכנת כימיקלים וציוד

1. הפוך 500 מיליליטר של 1% hexametaphosphate נתרן (SHMP) (Napo _{3) n} פתרון ולעקר ידי מעוקר.
2. מסננים לעקר nitrocellulose (NC) (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 47 מ"מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה.
3. לעקר מסנני NC (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 25 מ"מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה.
4. לשקול ולב המשקל הריק של 50 מיליליטר צינורות סטרילי ....

תוצאות

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן ^10,21. אנא עיין במאמרים אלה לפרשנות והדיון הסביבתיים של נתונים.

ההליך הכולל מסוכם באיור 1 ומתאים לשלושה שלבים עיקריים: ראשון, ההפרדה של ביומסה ממשקעים או כל מטריצה ​​סביבתית אחרת; שני, ההרס של תאים של צמח; והשלישי, הניתוח במורד הזרם של endospores המופרד. ניתוח במורד הזרם יכול להיות מורכב, למשל, של מיצוי DNA ורצף amplicon לקבוע גיוון. מיצוי DNA צרי.......

דיון

ההתנגדות של endospores לגורמים חיצוניים אגרסיביים physicochemical (למשל, טמפרטורה או בדטרגנטים) שימשה כדי להמציא שיטה להפריד endospores חיידקים מהתאים של צמח בדגימות סביבתיות. זוהי השיטה המקיפה הראשונה לבודד endospores מדגימות סביבתיות באופן שאינו הרסני. שיטות קודמות לכמת, לזהות או לנתח endospores בדגימות המבוססות על המדידה של פרוקסי הספציפי לendospores כגון חומצת dipicolinic או גני סמן ספציפיים. לעומת זאת, בפרוטוקול שהוצג כאן, רכיבי מדגם אחרים מאשר endospores יוסרו וכך e.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסנני קרום ניטרוצלולוזה של Whatman, 0.2 & # 956; גודל נקבוביות מ', קוטר 47 מ"מ	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
ליזוזים מחלבון ביצת עוף	סיגמא-אולדריץ'	62971 אבקת פלוקה	, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax הומוגנייזר T18 בסיסי	IKA	3720000
מחזיקי מסנני זכוכית ל 47  ממברנות מ"מ, זכוכית פיירקס	EMD Millipore	XX10 047 00
משאבת ואקום כימית	Millipore	WP6122050	220 V/50 הרץ
סעפת דגימה סינון עבור 25  ממברנות מ"מ	Millipore	1225 סעפת דגימה	פוליפרופילן
Dnase	ניו אינגלנד Biolabs	M0303S	ללא Rnase
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
נתרן דודציל סולפט (SDS)	סיגמא-אולדריץ'	L3771 סיגמא
מסנני קרום ניטרוצלולוזה של Whatman, 0.2 & # 956; גודל נקבוביות מ', קוטר 25 מ"מ	סיגמא-אולדריץ'	WHA7182002 אולדריץ'