הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ"א ארבידופסיס

20.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53422

⸱

14 בינואר 2016

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

במאמר זה

סיכום

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

תקציר

רשתות ויסות גנים מורכבות מתזמרות תהליכים ביולוגיים ומעברי התפתחות בצמחים. הפעלה סלקטיבית של שעתוק והשתקה של גנים מתווכים את תגובת הצמחים לאותות סביבתיים ורמזים התפתחותיים. לכן, תובנות לגבי המנגנונים השולטים בביטוי גנים של צמחים חיוניות כדי להשיג הבנה מעמיקה של האופן שבו תהליכים ביולוגיים מווסתים בצמחים. טכניקת כרומטין אימונו-משקעים (ChIP) המתוארת כאן היא הליך לזיהוי אתרי קשירת ה-DNA של חלבונים בגנים או באזורים גנומיים של מין המודל Arabidopsis thaliana. ניתן לנתח ביעילות את האינטראקציות עם DNA של חלבונים מעניינים כגון גורמי שעתוק, חלבוני כרומטין או גרסאות ששונו לאחר התרגום של היסטונים באמצעות פרוטוקול ChIP. שיטה זו מבוססת על קיבוע אינטראקציות חלבון-DNA in vivo, פיצול אקראי של כרומטין, משקעים חיסוניים של קומפלקסים של חלבון-DNA עם נוגדנים ספציפיים, וכימות ה-DNA הקשור לחלבון המעניין על ידי טכניקות PCR. השימוש במתודולוגיה זו ב-Arabidopsis תרם באופן משמעותי לחשיפת מנגנוני ויסות שעתוק השולטים במגוון תהליכים ביולוגיים של צמחים. גישה זו אפשרה לזהות את אתרי הקישור של חלבון הכרומטין Arabidopsis EBS לאזורים מווסתים של הגן הראשי של הפריחה FT. ההשפעה של חלבון זה על הצטברות סימני היסטון מסוימים באזור הגנומי של FT התגלתה גם באמצעות ניתוח ChIP.

מבוא

בשנים האחרונות מגוון רחב של כלים גנטיים, מולקולריים והגנומי פותחו בthaliana ארבידופסיס מיני מודל. טכנולוגיה זו יש להקל מאוד את ההתקדמות בהבנה כיצד התפתחות צמח מוסדרת. בין התהליכים התפתחותיים למדו באמצעות ארבידופסיס כמודל, הבקרה הגנטית של זמן פריחה כבר נותחה בהרחבה. מחקרים אלה הראו כי צמחים לווסת בדיוק מאוד הזמן של פריחה בתגובה לרמזים אנדוגני כגון הורמונים והגיל של הצמח, וגם לאותות סביבתיים כגון photoperiod וטמפרטורה לסנכרן פריחת זמן עם מחזור הטבעי של עונות 1, 2. הבידוד והאפיון של מוטציות ארבידופסיס עם שינויים בזמן של פריחה היה הקובע בחשיפת רשת מורכבת של גנים המווסתים את זמן הפריחה בתגובה לגורמי אנדוגני והסביבתיים. מעגלים הגנטיים אלהמשולב ברמה של כמה גני הורים הפועלים כמתגים של פריחה, והעיתוי של הייזום הפרחוני המדויק תלוי באיזון של פריחת קידום ומדחיק את פעילות שעובדות במעלה הזרם של גני אינטגרטור הפרחוני 1,3.

האפיון הפונקציונלי של הגנים שזוהו על תפקידם בשליטה של ​​ייזום פריחה, נעזר בשימוש האחרון של גישות הגנומי, חשפו את התפקיד המרכזי של רגולציה תעתיק באפנון של זמן פריחה. למעשה, רבים מהגנים ההורים של שעתוק לקודד פריחת גורמי 4. בנוסף, מספר מתחמי חלבון שיפוץ הכרומטין להשפיע על הביטוי של גני הורים של פריחה. מספר מוטציות ארבידופסיס המבודדים לזמן הפריחה שינה התברר לשאת מוטציות בגני מקודדי מגוון של מכפילי הכרומטין. remodelers הכרומטין שונה שמציג את השינויים בposttranslational Histonדואר זנבות, למקם nucleosomes ביחס ל- DNA או להחליף ההיסטונים הקנונית על ידי גרסאות היסטון נחוצים לוויסות הנכונה של הפריחה בארבידופסיס 5,6. חלק מפעילויות שיפוץ הכרומטין אלה לזרז את התצהיר או הסרת שינויים קוולנטיים כגון acetylation או מתילציה בשאריות היסטון ספציפיות. סימני היסטון אלה מוכרים במיוחד על ידי effectors מיוחדת שמגייסות מתחמים אחרים שיפוץ הכרומטין, גורמי שעתוק או רכיבים של מכונות תעתיק להסדיר את פעילות תעתיק של גנים פורחים.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מאפשר זיהוי של in vivo אתרים לחלבונים של עניין מחייב DNA (איור 1). הליך זה מנצל את היכולת של כימיקלים מסוימים לקישור צולב חלבונים לדנ"א. מתחמי DNA החלבון וכתוצאה מכך ניתן immunoprecipitated אז באמצעות אגא נוגדנים הספציפיגורמי שעתוק Inst, מחייב חלבוני הכרומטין, או שינויים מסוימים וepitopes Heterologous (המכונים "תגים" בדרך כלל) שצורפו לחלבון של בחירה. ה- DNA מטוהר מimmunoprecipitates אלה יכול לשמש כתבנית בתגובות PCR (qPCR) כדי להעריך להעשרה של רצפים מסוימים של עניין. בדרך זו, ניתן להקים אתרי הקישור של גורמי שעתוק או ההפצה של סימני היסטון בגנים מסוימים 7,8. בנוסף, בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS) המאפשר רצף מקביל מאסיבי, טכנולוגיית שבבים הפכה אפשרית זיהוי הגנום של אתרי הקישור של גורמי שעתוק כמו גם נופי epigenomic הסרת לוט משינויי היסטון. יתר על כן, הניתוח בו זמני של ביטוי גנים מאפשר ניטור איך המחייב של רגולטורי תעתיק או התצהיר של סימני היסטון מסוימים לתאם עם תעתיק פעילויותיוty של גנים 9.

השימוש בפרוטוקולי שבב בארבידופסיס אפשר להעריך את ההשפעה שמגוון של רגולטורי תעתיק יש בארגון הכרומטין של גני הורים של פריחה וכיצד שינויים המבניים אלה משפיעים על ביטוי גני 5,6. תוצאות קודמות הראו כי הנעילה מוקד ארבידופסיס מוקדם בימים קצרים (EBS) פועלת כמדכאת של פריחה ומוטציות בגן זה מופע ההאצה של פריחה וגברת ביטוי של גן ההורים של FT פריחה. בנוסף, מוטציות פסד של הפונקציה בFT לדכא באופן מלא את הפנוטיפ הפריחה המוקדם של הצמחים מוטנטים EBS, המצביע על כך FT דרוש לפריחה המוקדמת של מוטציות EBS ושEBS הוא הכרחי לדיכוי של גן הורים זה של פריחת 10 , 11. EBS מקודד חלבון המכיל PHD שיכול להיקשר באופן ספציפי di- היסטון H3 וtrimethylated בהליזין דואר 4 שאריות (H3K4me2 / 3), המצביעות על תפקיד לEBS בדיכוי בתיווך הכרומטין של 12 FT. השימוש בגישת השבב הוכיח כי EBS החלבון המכיל PHD ארבידופסיס 10,11 נקשר אזורי רגולציה של FT גן אינטגרטור הפרחוני להדחיק ביטויה 12. נתונים נוספים שהושגו באמצעות השימוש בטכנולוגיית השבבים הראו כי נדרש חלבון זה כדי לשמור על רמות נמוכות של acetylation היסטון, סימן היכר של שעתוק פעיל, בהכרומטין של גן הורים זה של פריחה בשלבים ראשוניים של פיתוח ארבידופסיס. תצפיות אלה, יחד עם נתונים ביטוי גנטי וגן, להוכיח שיש חלבון זה ארבידופסיס PHD המכיל תפקיד מרכזי בכוונון העדין של זמן פריחה על ידי ויסות הביטוי של גן אינטגרטור הפרחוני 12 FT. העבודה המוצגת כאן מספקת שיטה מותאמת שימושית לא רק לניתוח של ההיסטונים אלא גם לאחריםהכרומטין קשורים חלבונים, ועם התייעלות וצמצום זמן ניסוי. יתר על כן, דו"ח זה מדגים כיצד השימוש בפרוטוקולי שבב סיפק תובנות חדשות את הקשר בין שינויים בשינויי הכרומטין ומדינות תעתיק של גני צמח, וכיצד מנגנונים אלה בתיווך הכרומטין של השפעת שליטת ביטוי גנים בתחילת הפריחה בארבידופסיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Crosslinking של צמח החומר (1 שעה)

  1. לגדול קווי ארבידופסיס השתמשו בניסוי (הסוג בר - WT - לעומת מוטציות, ו / או קווים המבטאים את הגרסה מתויגת של חלבון עניין שלך לעומת קווים המבטאים את התג לא התמזגו לכל חלבון) ל12-18 ימים בצלחות פטרי גדולים (150 מ"מ) עם (1 ליטר: מלחי 1x Murashige & Skoog, סוכרוז 10 גרם, MES 0.5 גרם, pH 5.7 (KOH), אגר 1%) הבינוני MS-אגר. לחלופין, לגדל צמחים בעציצים המכילים 3: 1 תערובת של אדמה ורמיקוליט.
    זהירות! פורמלדהיד הוא רעיל על ידי שאיפה, במגע עם עור ואם נבלע, ויש לטפל במנדף כימי לובש ציוד מגן אישי מתאים. צעדים 1.2-1.6 צריכים להתבצע מתחת למכסת מנוע קטר.
  2. לעשות חורים קטנים במכסה של 50 מיליליטר הצינורות עם מחט מבערים מחוממים מעבדה. הוסף 40 מיליליטר של 1x PBS חיץ ו1.08 מיליליטר של פורמלדהיד לריכוז סופי של 1% (של 37% מניותolution). לאסוף 1.5 גרם של חומר צמחי בצינורות 50 מיליליטר אלה. שמור את הצינורות על קרח במהלך crosslinking.
  3. סגור את הצינורות 50 מיליליטר עם המכסה. מניחים את הצינורות בתא ייבוש ולהחיל ואקום. אבק לחדור את הרקמה למשך 10 דקות, ואז לשחרר את הוואקום בזהירות, כדי למנוע געשו את הפתרון. מערבבים את המדגם. חזור פעמיים. לאחר חדירה, להתבונן החומר הצמחי ולאשר שהוא הופך להיות מעט שקוף ונוטה לשקוע לתחתית של התחתית (איור 2).
  4. להוסיף 2.5 מיליליטר של 2 מ 'גליצין כדי להשיג ריכוז סופי של 0.125 מ' החל ואקום במשך 5 דקות. גליצין פועל כמעכב תחרותי של crosslinking פורמלדהיד.
  5. מחק את פתרון פורמלדהיד-גליצין PBS על ידי צינור היפוך 50 מיליליטר הסגור עם חורים במכסה.
  6. יש לשטוף את שתילי פעמיים עם PBS 1x ופעם עם מים השלכת פתרון הכביסה כמתואר בשלב 1.5. לייבש אותם על מגבת נייר ולהקפיא בnitroge הנוזליn.
    הערה: רקמה קפוא יכולה להישמר ב -80 ° C במשך שבועות.

2. הכנת הנוגדנים (יום 1)

הערה: לimmunoprecipitation, השימוש בחרוזים מגנטיים מצומדות עם נוגדנים באמצעות חלבון G או חלבון מקשר עם זיקה גבוהה לתחום הקבוע של השרשרת הכבדה הנוגדן מומלץ. מתחמי חלבון דנ"א יכולים לצרף unspecifically אל פני השטח של conjugates חרוזים-הנוגדן. מסיבה זו, יש צורך לבצע בקרות ללא נוגדנים ספציפיים לכמת את הרקע שאינו ספציפי מחייב.

  1. עבור כל immunoprecipitation, להכין 15 μl של חרוזים מגנטיים בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הסכום של חרוזים תלויים בכמות של הכרומטין משמש לimmunoprecipitation וגם על הנוגדנים.
  2. לשטוף, להוסיף 1 מיליליטר של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) חיץ דילול לחרוזים, מערבב על ידי סיבוב ולמקם את microcentrifuge 1.5 מיליליטר ט"ולהיות במעמד מגנטי. לחכות 1 דקות כדי לתת לחרוזים לצרף המגנט. עם 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge עדיין במעמד, להסיר את supernatant ידי pipetting. חזור פעמיים.
    הערה: לקו כל צמח יש צורך בשתי מערכות immunoprecipitation: אחד עם חרוזים ונוגדן (AB) ושני לא נוגדן (לא-Ab) שליטה עם חרוזים מגנטיים בלבד.
  3. Resuspend את החרוזים 200 μl של חיץ דילול שבב. להוסיף את הכמות הנדרשת של Ab הספציפי לאחד משני הצינורות שהוכנו עבור כל קו צמח (הדילול המדויק שונה עבור כל Ab וצריך להיות מותאמים באופן ניסיוני או, במקרה של נוגדנים מסחריים, בצע את ההוראות של היצרן). השתמש בדוגמה זו לimmunoprecipitation. מוסיף את אותה הכמות של IgG נוקבים לצינור האחר, אשר ישמש כביקורת שלילית.
  4. דגירה O / N על גלגל מסתובב ב 4 ° C כדי לאפשר הנוגדנים לצרף את החרוזים.

3. הכרומטין הפקה (4 שעות)

  1. לטחון ביסודיות החומר הצמחי הקפוא בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי עד שהאבקה הופכת הומוגנית והאור ירוק. העבר את האבקה לשפופרת 50 מיליליטר חדש.
  2. לצעדים 3.2-3.6, עבודה מתחת למכסת מנוע קטר. להוסיף 30 מיליליטר של חיץ הפקת 1 (1 ExB), ומערבבים היטב להשרות את אבקת הרקמה. מהצעד הזה ב, לשמור את הדגימות ב 4 ° C בכל העת. רקמה קפוא ושאריות חנקן נוזליים יגרמו החיץ להקפיא. הקפד להפשיר את הרקמה הקפואה לחלוטין על ידי היפוך הצינורות 4-5 פעמים בכל 2 דקות.
  3. נקה את התרחיף ידי העברתו דרך רקמת סינון עם גודל נקבובית של 22-25 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר חדש צנטריפוגות זה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, גרעינים וכל האברונים יהיו גלולה. 1 ExB מכיל מספיק סוכרוז לספק צפיפות גבוהה ולמנוע את ההפרעה של מבנה אברון.
  4. בעדינות להסיר את supernatant על ידי decantation. בSTA זהGE, להתבונן גלולה ירוקה של כ 2 מיליליטר.
  5. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר של ExB 2. Resuspension של גלולה יהיה קשה בשלב זה. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ExB 2 מכיל 1% Triton X-100 כדי לעזור פרצו כלורופלסטים פתוחים ולהסיר כלורופיל.
  6. Resuspend גלולה ב300 μl של הפקת הצפת 3 (ExB 3).
  7. בצינור microfuge נקי, להוסיף 600 μl של ExB 3. קח גלולה resuspended מהצעד 3.6 ובזהירות שכבה זה על גבי ExB הנקי 3.
  8. ספין עבור שעה 1 ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: פעולה זו מסייעת להסיר את חומר הניקוי מהמדגם.
  9. הסר את supernatant על ידי aspirating עם טפטפת. Resuspend גלולה הגרעיני ב300 μl של חיץ sonication ידי pipetting לאט למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות בועה, אשר עשוי להשפיע על יעילות sonication. פיפטה בזהירות את כל ההשעיה החוצה ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר.
    הערה: זהמאגר מכיל SDS, לlyse הגרעינים ולשחרר את הכרומטין.
  10. Sonicate ההשעיה לlyse גרעינים ואקראיים גזירה הכרומטין לרסיסים קטנים. השתמש בתנאים ההופכים את sonication הכרומטין מועשר בשברי בין 200-800 נ"ב (20-30 מחזורים עם ההגדרות 30 שניות ON / OFF 30 שניות ב 4 ° C עבור המכשיר זמין sonication המתואר בטבלה של חומרים / ריאגנטים). בדוק את היעילות של sonication על ידי הפרדת electrophoretic של קטעי DNA המתקבלים על ג'ל agarose 13, טעינת 2 μl של הכרומטין sonicated (איור 3).
    זהירות! הקפד ללבוש ציוד הגנת אוזן במהלך שלב sonication במקרה מכשיר אולטרסאונד לא כלול בממשלה אטומה לרעש.
    צעד חיוני! פיצול הכרומטין תלוי במידה רבה בציוד sonication. צריכים להיות מותאמים לתנאי sonication להשיג העשרה בגדלי DNA המתאימים. לִרְאוֹתאיור 3 לדוגמא של איך לייעל את פיצול הכרומטין.
  11. ספין הפתרון פעם אחת ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant ידי pipetting לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר נקי. זורק את הכדור. קח 1/10 של supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש, לסמן אותו כקלט והקפאה ב -20 ° C.
  12. לדלל את הכרומטין 10x עם חיץ דילול השבב לדלל SDS לריכוז סופי של 0.1%.
    הערה: אפשר להקפיא דוגמאות ומאוחסנות ב -20 ° C למשך מספר שבועות.

4. Immunoprecipitation של החלבון של עניין וההצלה של ה- DNA (יום 1, 3 שעות)

  1. שטוף את החרוזים מצופים Ab מצעד 2.4 שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של חיץ דילול שבב כדי להסיר את העודפים של נוגדן כמתואר בשלב 2.2. גלול ב200 μl של חיץ דילול שבב. הוסף 50 μl של הכרומטין המבודד. דגירה O / N על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בדוק שהריכוזעל של הכרומטין בUV-Vis microvolume ספקטרופוטומטר. 50 μl של הכרומטין המבודד צריך להכיל יותר מ -10 מיקרוגרם של ה- DNA.
  2. לעבודה 4.2-4.5 שלבים ב 4 מעלות צלזיוס. שטוף את החרוזים פעמיים ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה דל מלח כמתואר בשלב 2.2.
  3. שטוף את החרוזים פעם ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה מלח הגבוה.
  4. שטוף את החרוזים פעם ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה LiCl.
  5. שטוף את החרוזים פעמיים ב 1 מיליליטר של חיץ TE. לאחר השטיפה האחרונה, הקפד להסיר באופן מלא את מאגר TE עזב בצינור על ידי שאיפה עם טפטפת.
  6. קח את דגימות INPUT (שלב 3.9). העברת 5 μl של הקלט לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש ולהמשיך כעם דגימות השבב. הפוך crosslinking ידי הוספת 200 μl של 5% שרף חילוף יונים chelating, ודגירה של 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס רועדות כל דקות 2-3. ספין למטה ב16,000 XG במשך 30 שניות ולהעביר בזהירות את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש על ידי pipetting.
    הערה: בעוד traשיטת ditional לcrosslinking היפוך כרוכה O / דגירה N עם NaCl, הדגירה עם שרף יון chelating על 95 מעלות צלזיוס מאפשרת לdecrosslinking וelution של DNA ב 10 דקות יעילים, ולכן עושה ביום אחד פרוטוקולים קצרים יותר.
  7. הוסף 2 μl של proteinase K (10 מ"ג / מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לעכל חלבונים ולשחרר DNA.
  8. לעצור את התגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  9. מהירות ספין ב16,000 XG במשך 30 שניות ולהעביר supernatant לצינור חדש על ידי pipetting.
  10. נקה את ה- DNA מבודד באמצעות ערכת טיהור שברי DNA סטנדרטית.
    הערה: המשך על פי הוראות היצרן.
  11. העבר את העמודה מחייבת DNA מהערכה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש. Elute DNA מטוהר על ידי הוספת 20 μl מים ללא DNase למרכז הטור ומסתובב ב16,000 XG במשך 60 שניות. תפסיק נקודה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -80 ° C למשך מספר שבועות.

5. מדידת שפע של אתרי קישור ב- DNA immunoprecipitated ידי qPCR (4 שעות)

יש DNA מבודד מהכרומטין זירז להיות מנותח על מנת לקבוע שה- DNA שברים היה שבב אד מהכרומטין הכולל, בשלה מחייב את החלבון של עניין: הערה.

  1. פריימרים עיצוב לאזורים הגנומי של עניין עם טמפרטורת התכה (TM) של 60 מעלות צלזיוס ותוכן GC של 30% -80%. כהכרומטין הוא מקוטע על ידי sonication, אורכו של רצף מוגבר לא צריך להיות ארוך יותר מ150-200 נוקלאוטידים (טבלת 1).
    הערה: כלי שימושי לעיצוב פריימר פריימר היא 3 תכנית (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). הנחיות נוספות לעיצוב פריימר זמינות בדוחות קודמים 8, 14,15.
  2. השתמש בתכנית תפציץ לוודא כי פריימרים ספציפיים (במיוחד יזמים יכולים לשתף TF דומה מחייבים רצפים) ולבדוק את יעילות usin פריימרז דילולים 1:10 במים של ה- DNA הקלט (שלב 4.9). אזורים מסוימים של הגנום יהיו מטוהרים יותר טובים מאחרים. לכן חשוב לתכנן פריימרים PCR ולבדוק אותם על ה- DNA הקלט בדילול מלא.
  3. לדלל את ה- DNA המטוהר 1:10 עם מים ופיפטה 5 μl של ה- DNA המדולל בצינור PCR לכל תגובה.
    הערה: לדלל רק את הסכום הדרוש, כמו ה- DNA יכול לצרף לקירות של 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. מחזורי הקפאה-הפשרה מרובה להגדיל את מספר מולקולות ה- DNA המצורפים. עבור כל זוג פריימר, הגברה בקלט, Ab-השבב ולא-Ab השבב להיות מנותח.
  4. כדי להשלים את תערובת PCR, להוסיף תערובת אמן Sybr גרין PCR לריכוז סופי של 1X, ו 0.5 מיקרומטר של כל צבע יסוד. מלא עד 20 μl עם מים ללא DNase.
  5. בצע את תגובת qPCR ביצוע ההוראות של יצרן תערובת אמן Sybr גרין PCR.

ניתוח 6. נתונים

הערה: בין לשעברisting דרכים של ניתוח שבב נתונים, שתיים הנפוצים ביותר. הראשון שבם הוא שיטת ההעשרה פי, גם בשם כמו "העשרה היחסית ',' אות על רקע" או "ביחס לשליטה לא-הנוגדן". השיטה השנייה נקראת כמו "% של קלט".

  1. ניתוח נתונים בשיטת העשרה פי.
    1. צור גיליון אלקטרוני עם דגימות שמות וערכי ה- CT גלם שהתקבלו לאחר תגובת qPCR.
    2. עבור כל דגימה, לגרוע מן ערך ה- CT הגלם שלה ערך ה- CT גלם המתקבל לשליטה המקבילה לא-Ab. הערה: לאחר פעולה מתמטית זה, ערך ה- CT למדגם לא-Ab יהיה שווה 0.
    3. חישוב העשרה פי ידי פעולת exponentiation עם בסיס 2 ומעריך (כוח) שווה ליתרה השלילית שהושגה בשלב 6.1.2 (טבלה 2).
      לקפל העשרה = 2 - (CT (לדוגמא) - CT (לא-Ab))
      הערה: בmetho זהד השפע של קטע DNA ספציפי במדגם שבב אד הוא בהשוואה לשפע של בר זה בשליטה לא-Ab. ההנחה של שיטה זו היא שהרמה של אות רקע היא שחזור בין סטים שונים פריימר, דגימות, וניסויים לשכפל. עם זאת, רמות אות'noise' זה לא משתנות בין קבוצות פריימר, דגימות, וניסויים.
  2. ניתוח נתונים על ידי% משיטת קלט.
    1. צור גיליון אלקטרוני עם דגימות שמות וערכי ה- CT גלם שהתקבלו עבורם לאחר תגובת qPCR.
    2. התאם ערכי ה- CT גלם לדגימות קלט על ידי הפחתת ערך של לוגריתם בסיס 2 מהחלק של הכרומטין חילוץ הכולל שנלקח כקלט.
      הערה: בפרוטוקול זה הערך המופחת שווה 3.32, כ-10% מהכרומטין הכולל נלקחו כקלט בפרוטוקול זה. התחבר 2 (10) שווים 3.32.
    3. לחשב% מתשומות על ידי הכפלה ב -100 הערך של פעולת exponentiation עם בASE 2 ומעריך (כוח) שווה לשאר ערכי קלט מותאמים מופחתים ערכי ה- CT גלם של המדגם (לוח 3).
      % מקלט = 100 * 2 (קלט מותאם - CT (לדוגמא))
      הערה: עם הליך זה, את הקשר בין שפע DNA הספציפי במדגם שבב אד לסך הכל הכרומטין המבודד (מדגם הקלט) מחושב. ניתן למצוא פרטים נוספים על ניתוח נתונים שבב בהרינג et al. 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן בחרו לצאת שמונה שלבים עיקריים בפרוטוקול שבב זה לזיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ"א in vivo, כוללים גידול וקציר של חומר צמחי, cross-linking של הכרומטין, בידוד הכרומטין, פיצול הכרומטין, בידוד סלקטיבי של המתחמים בין ה- DNA ו החלבון של עניין על ידי immunoprecipitation, עיכול חלבון, טיהור DNA, וניתוח qPCR (איור 1). צעד מכריע בפרוטוקול השבב הוא הקיבעון של אינטראקציות חלבון דנ"א בתגובת cross-linking. בדרך כלל, cross-linking פורמלדהיד משמש במפעל שבב....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול השבב המתואר כאן הוא טכניקה לשחזור ורבה עוצמה כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA ספציפיים in vivo בצמחי ארבידופסיס. זיהוי מוצלח של אתרי קישור לחלבונים של עניין מחייב בחירה נאותה של איברי צמח או שלבי התפתחות שבו האינטראקציות הרלוונטיות למעשה מתרחשות. בנוסף, זה קריטי כדי להשיג קיבוע מתאים של החומר הצמחי וגז אופטימלי של הכרומטין ידי sonication. נוגדנים מאוד ספציפיים לimmunoprecipitation יעיל של החלבון / התג שנבחר גם הם חיוניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים רוצים להודות לתא הצמח על כך שאפשר להשתמש בכמה נתונים שפורסמו בכתב עת זה כדי לפרט את התוצאות המייצגות המתוארות כאן באיור 4. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי 7FP Marie Curie-Initial Training Network 316965EpiTRAITS, ועל ידי המשרד הספרדי לכלכלה ותחרות (מענקים BIO2010-15589 ו-BIO2013-43098-R).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MESSigmaM8250
MS (תערובת מלח בסיסי Murashige ו-Skoog)SigmaM5524
פורמלדהיד 37% SigmaF8775-25השתמש מתחת למכסה המנוע
תערובת מעכבי פרוטאז cOmplete ULTRA טבליות, מיני, ללא EDTA, EASYpackRoche
Bioruptor מכשיר סוניקציה סטנדרטידיאגנודB01010002 (UCD200TO)
גליציןסיגמא50046
QIAquick PCR ערכת טיהורQiagen28104
חרוזים מגנטיים של Dynabeads בשילוב עם חלבון A או חלבון GLife Technologies10003D/10001Dבדוק את היצרן s manual לזיקה לנוגדנים
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution LifeTechnologies85112
(עכבר, חולדה, ארנב והליפ;)-IgGDiagenodeC15400001, C15420001, C15410206
מתלה מגנטי - DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9/14ac נוגדן פוליקלונלי - פרימיום DiagenodeC15410200-10
Chelex 100 שרףBio-Rad142-2832
Proteinase KLife Technologies17916
נוגדן Anti-Myc Tag, שיבוט 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Green I מאסטררוש4707516001
5892791001

מקורות

  1. Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
  2. Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
  3. Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
  4. Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
  5. He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
  6. Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
  7. Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).
  9. Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
  10. Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
  11. Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
  12. Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998(2012).
  15. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  16. Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
  17. Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
  18. Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
  19. Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).
  20. Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
  21. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  22. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  23. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
  24. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  25. Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Arabidopsis Thalianaקישור גורמי שעתוקניתוח מודיפיקציות של היסטוניםפרוצדורת קישור צולבפרגמנטציה באמצעות סוניקציהאימונו-השקעה באמצעות חרוזים מגנטייםכימות באמצעות qPCRבקרה של הגן FT
הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ"א ארבידופסיס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.