פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את התפתחותם של שני נוגדנים חד-שבטיים מסוג IgG (mAbs) המגיבים חזק למיוגלובין של יונקים ימיים. mAbs אלה מיושמים על רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית המבוססת על פורמט הסנדוויץ' כדי להבדיל בין ה-Mb של יונקים ימיים לבין כלבי ים ובעלי חיים אחרים.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית המבוססת על פורמט הסנדוויץ' שניתן להשתמש בה כדי להבדיל בין המיוגלובין (Mb) של יונקים ימיים לזה של כלבי ים ובעלי חיים אחרים. הרצועה מספקת סינון מהיר ומיידי, ובכך מרסנת את הסחר והצריכה הבלתי חוקיים שלו. פותחו שני נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) עם תגובתיות כלפי ה-Mb של יונקים ימיים. רצפי חומצות האמינו של אזורים ריאקטיביים אנטיגניים של Mb מבעלי חיים שונים נותחו על מנת לתכנן שני פפטידים סינתטיים (פפטיד כללי ופפטיד ספציפי) ולאחר מכן להעלות את ה-mAbs (תת-מחלקה IgG₁). ה-mAbs נבחרו מהכלאות שנבדקו על ידי ELISA עקיף, כתם מערבי וכתם נקודות. CGF5H9 היה ספציפי ל-Mbs של ארנבות, כלבים, חזירים, פרות, עזים ויונקים ימיים, בעוד שהוא הראה זיקה חלשה עד אפסית ל-Mbs של תרנגולות, טונה וכלבי ים. CSF1H13 יכול לקשור כלבי ים ויונקים עם זיקה חזקה אך לא הראה זיקה לבעלי חיים אחרים. במחקר זה נעשה שימוש בדגימות של יונקים ימיים מארבע משפחות (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae ו-Kogiidae), והתוצאות הצביעו על כך שלשני ה-mAbs הללו יש יכולת קשירה רחבה ל-Mbs של יונקים ימיים שונים. mAbs אלה יושמו על רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית מסוג סנדוויץ'. CGF5H9, המזהה מינים רבים, סומן בזהב קולואיד ושימש כנוגדן לזיהוי. CSF1H13, שצופה באזור הבדיקה, זיהה נוכחות של יונקים ימיים וכלבי ים Mbs. דגימות שריר מטונה, עוף, כלבי ים, חמישה מינים של יונקים יבשתיים ו-15 מינים של יונקים ימיים נבדקו בשלוש עותקים. כל דגימות היונקים הראו תוצאות חיוביות וכל שאר הדגימות הראו תוצאות שליליות.

מבוא

מבחינה היסטורית, בשר יונקים נצרך בחלקים רבים של העולם וצריכה זו נמשכת עד היום¹. בשל הרמה הטרופית של יונקים ימיים, ידוע כי רמות גבוהות של כספית ורעלים אחרים נמצאים בבשרם². לכן, צריכת בשר ימיים עלולה להוביל לבעיה בריאותית לא רק עבור קבוצות בסיכון גבוה כמו נשים בהריון אלא גם עבור האוכלוסייה הכללית³. יתר על כן, זיהום של בשר ימיים בפתוגנים זואונוטיים או בעלי פוטנציאל זואונוטי יכול להתרחש גם במהלך עיבודו ואחסונו⁴. קשה אפילו לסוכנים מנוסים לזהות בשר ימיים על פי המראה שלהם בלבד. לכן, נדרשת שיטת זיהוי מדעית אמינה כדי להבדיל בין בשר ימיים לבשרים אחרים. זה יעזור להגביל את צריכת בשר היונקים.

השיטות הנוכחיות לזיהוי מינים כוללות טכניקות מולקולריות ושיטות אימונולוגיות. ניתן להשתמש בטכניקות מולקולריות, כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) וריצוף DNA, כדי לזהות דגימות לא רק מבשר נא⁵ ודגימות מפורקות⁶ אלא גם ממזונות מעובדים כגון נקניק מבושל ודברי מזון^7,8. שיטות אימונולוגיות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA), מיושמות בדרך כלל בייצור מזון כדי לזהות את תכולת הבשר של, למשל, חזיר⁹, בקר¹⁰ ושפמנון¹¹. ניתוח DNA מבוסס PCR לזיהוי בשר יונקים זמין¹², וסייע במניעת סחר בינלאומי בלתי חוקי של בשר יונקים ימיים ביפן, דרום קוריאה, הפיליפינים, טייוואן, הונג קונג, רוסיה, נורבגיה^{וארצות הברית}. שיטות אלו יעילות ואמינות, אך הן יכולות להימשך שעות או ימים וכרוכות בשלבים מייגעים. זיהוי בשר יונקים מבוסס בדרך כלל על טכניקות מולקולריות וכיום אין שיטה אימונולוגית זמינה. עבור סוכנויות רגולטוריות, רצוי מאוד לפתח טכניקה אמינה ומהירה שניתן להשתמש בה בשטח לזיהוי בשר ימי.

רצועות אימונוכרומטוגרפיות משמשות ככלי גילוי עם היתרון של הפקת תוצאה מהירה באמצעות פרוטוקול פשוט המתאים לשימוש בשטח. העקרונות של הרצועה האימונוכרומטוגרפית ו-ELISA דומים מאוד, וכוללים נוגדנים, אנטיגנים ותוויות. תוויות רבות ושונות כגון זהב קולואידי, פחמן ולטקס שימשו בפיתוח רצועות אימונוכרומטוגרפיות. נכון לעכשיו, שיטה זו משמשת בדרך כלל לאיתור אנטיביוטיקה, רעלנים, חיידקים ווירוסים¹³, אך לעתים רחוקות היא משמשת לזיהוי חלבונים בבשר^14,15. כאן אנו מציעים בדיקה חיסונית של אנזים כרומטוגרפי בזרימה רוחבית לזיהוי מהיר של מיוגלובין ימיים (Mb).

פרוטוקול

משפט ואתיקה: המחקר בוצע בהתאם להנחיות בינלאומיות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC) של לאום Chiayi אונ' מזהה אישור: 99022. שימוש מדגם cetacean הותר על ידי מועצת החקלאות של טייוואן (הרשאת מחקר 100M-02.1-C-99).

1. הכנת שרירים לדוגמא SDS-PAGE

הערה: דגימות שריר מ -23 מינים, כולל 16 מינים של יונקים ימיים, 5 מינים של יונקים יבשתיים, טונה עוף שימשו במחקר זה (טבלה 1). דגימות שריר cetacean התקבלו מיחידים מפותלים bycatch דוגה, והחרמה. שפן, חולדה, כלב, ורקמות השריר עוף התקבלו מרכז לאבחון מחלות בעלי חיים של לאומי Chiayi האוניברסיטה. דוגמאות של בשר בקר, חזיר, כבש, וטונה נרכשו מסופרמרקט מקומי. מדגם השרירים של חותם נמל (Phoca vitulina ) סופק על ידי פארק האוקיינוס ​​Farglory. נתרן dodecyl אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל סולפט (SDS-PAGE) שימש להפריד חלבונים מסיסים עם משקולות מולקולריים שונים בדגימות שריר.

1. אחסן את כל דגימות ב -20 ° C עד השימוש.
2. טרום מגניב מרגמה ב -20 ° C. ואז לשים 3 גרם של מדגם שרירים קפוא לתוכו.
3. Homogenize המדגם עם 10 מ"ל של בופר פוספט מגניב (PBS) באמצעות homogenizer רקמות.
4. צנטריפוגה מדגם הומוגני ב XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 °. אסוף את supernatants ולאחסן אותו ב -20 ° C עד השימוש.
5. הכן 5 מ"ל של 5% לערום ג'ל (3.07 מ"ל של מים מזוקקים, 1.25 מ"ל של חיץ ג'ל העליון 4x של pH 6.8, 625 μl של acrylamide 40%, 50 μl של persulfate אמוניום 10% (APS), ו -5 μl של tetramethylethylenediamine ( TEMED)) ו -10 מ"ל של ג'ל המפריד 15% (3.65 מ"ל של מים מזוקקים, 2.5 מ"ל של 4x חיץ ג'ל נמוך של 8.8 pH, 3.75 מ"ל של acrylamide 40%, 100 μl של APS 10%,ו -4 μl של TEMED).
   1. בתא אלקטרופורזה, יוצקים לערום ג'ל (acrylamide 5%) על גבי הג'ל הפרדה (acrylamide 15%), לאחר שזו התגבשה. הכנס מסרק ג'ל הג'ל הערימה.
6. בצע עמוד פי התנאים הבאים: מצב הריצה הראשונית: 100 וולט, 20 דקות ו מצב סופי: 120 וולט, 40 דק '.
7. הכתם ג'ל עם כחול מבריק Coomassie בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עד ג'ל הוא כחול אחיד בצבע.
   הערה: המכתים יושלם כאשר הג'ל אינו גלוי הפתרון לצבוע.
8. Destain זה עם פתרון חומצה אצטית (10%) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. להקות תתחלנה להופיע. המשך destaining ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד רקע ברור.

סינתזת פפטיד 2. חד-שבטי ייצור נוגדנים

1. תחזר את רצף חומצות האמינו של Mb מ GenBank כולל טונה, עוף, יען, יונקים מקומיים, חותם ו -18 מיניםשל יונקים ימיים (טבלה 2).
2. יישר את הרצפים באמצעות תוכנה נכונה ^16:
   1. הפעל את סייר המערך על ידי בחירת יישר: הערוך / בניית מערך על סרגל הפתיחה; בחר צור חדש מערך ולחץ על אישור. תיבת דו-שיח תופיע שואל "אתה בונה יישור רצף DNA או חלבון?"
   2. לחץ על הלחצן שכותרתו "חלבון"; בחר נתונים: פתוח: תחזרו רצפים מקובצים לקובץ רצף בחר; בחר עריכה: בחר הכל פקודת התפריט כדי לבחור את כל האתרים על כל רצף בנתונים להגדיר ליצירת יישור רצף מרובה.
   3. מערך בחר: יישר ידי ClustalW מהתפריט הראשי כדי ליישר את נתוני רצפים שנבחרו באמצעות אלגוריתם ClustalW; בחר "BLOSUM" כמו חלבון מטריקס משקל ולאחר מכן לחץ על הלחצן אישור.
3. ניתוח יישור רצף:
   1. דגש על 5 סי תגובתי אנטיגניtes ^17: אתר 1 (AKVEADVA, 15-22), אתר 2 (KASEDLK, 56-62), אתר 3 (ATKHKI, 94-99), אתר 4 (HVLHSRH, 113-119) והאתר 5 (KYKELGY, 145- 151) ולמצוא את השבר נשמר בקרב יונקים ימיים. ב- * (כוכבית; סמל קונסנסוס היישור (פרוטוקול 2.2.3)) מציינת מיקומים בם יש שאריות יחידות, משומר במלואו. שברי משומר הבאים יונקים ימיים נמצאו: רצף KASEDLKKHG (הכולל אתר 2) ורצף HVLHSRHP (הכולל אתר 4).
4. לסנתז שברי רצף מועמד על פי ניתוח רצף, ו המצומד עם חלבון ovalbumin (OVA) כמו חלבון המוביל באמצעות שירותים מסחריים.
   1. הוספת חומצות אמינו הידרופוביות (למשל, מתיונין) אל N-terminal של האתר תגובתי אנטיגני למניעת הפפטיד מן הפירוק (למשל, M-KASEDLKKHG).
   2. להאריך את בטרמינל C-אתר תגובתי אנטיגני על חשיפת אתר אנטיגני ליבת immunocyte. יתר על כן, conjuהשער הפפטיד עם OVA ידי הוספת ציסטאין (Cys, ג) C-terminal (למשל, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. ת חלב adjuvant של פרוינד המלא ל אימונוגן 1 או משלים של פרוינד שלם עבור אימונוגן 2 עם נפח שווה של כל פפטיד סינתטי ב PBS (3 מ"ל, μl ריכוז 30-50 הסופי מיקרוגרם / 100).
6. לחסן אימונוגן 1 (0.1 מ"ג) מתחת לעור לתוך כל אחד העכברים 5 נקבה BALB / ג.
7. בצע זריקות המאיץ תת עורית חמש פעמים באמצעות אימונוגן 2 במרווחים של שבועות ולאסוף מבחן סר על ידי דגימת קליפ זנב של עכברים לפני כל מגבר.
8. לקבוע כייל סר להקרנה הראשונה.
   1. ממיסים 100 מיקרוגרם של הפפטיד חופשית 25 מ"ל של חיץ התגובה aliquot 50 μl של פתרון זה לתוך זה גם צלחת 96-היטב. הוסף פתרון מגיב צימוד 10 μl לבאר כל ומערבבים הצלחת. דגירה את הצלחת למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר את התוכן של הבאר,לשטוף היטב כל 3 פעמים עם מים מזוקקים, ולחסום את הצלחת על ידי הוספת 200 μl של פתרון לחסימה. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. הסר את התוכן ולשטוף היטב כל 3 פעמים עם מים מזוקקים.
   3. בצע ELISA העקיף (פרוטוקול 5.1-5.7) לקביעת כייל סר להקרנה הראשונה. בחר את העכבר עם כייל הגבוה ביותר (הצפיפות האופטית הגבוהה ביותר) לאיסוף טחול.
9. שלושה ימים לפני לאוסף טחול, לחסן 0.1 מ"ג אימונוגן 1 מתחת לעור לתוך עכבר הצגת כייל הגבוה ביותר.
10. אוספים את התאים הטחול מן העכברים שחוסנו נבחרים בנתיך F0 תאי מיאלומה בעכברים (SP2 / 0-Ag14) להשיג תאים hybridoma עבור הדור מב ^18.
11. 14 ימים לאחר ההיתוך, בחר שיבוטים החיוביים על ידי הקרנת תגובתיות של supernatants hybridoma לקראת פפטיד הסינטטי בחינם באמצעות ELISA העקיף (פרוטוקול 5.1-5.7).
12. לדלל את תאי מספר מתאים לכל טוב עבור maximizing שיעור בארות המכילות רק שיבוט אחד אחד (שיבוט דילול).
    1. הוספת 100 μl של מדיום תרבית תאים לכל הבארות בצלחת 96-טובה, למעט A1 היטב אשר נותר ריק.
    2. הוסף 200 μl של ההשעיה התא היטב A1. ואז במהירות להעביר 100 μl מ- A1 ל- B1 ומערבבים ידי pipetting בעדינות. חזור על 1 הבא: דילולים 2 לאורך הטור כולו, ולאחר מכן למחוק 100 μl מ H1 כך זה מסתיים עם אותו הנפח כמו הבארות מעליו.
    3. הוסף 100 μl נוסף של מדיום לעמודה 1 עם micropipette 8 ערוצים. ואז במהירות להעביר 100 μl מכל אחת הבארות בטור 1 לאלה בטור 2 באמצעות פיפטה אותו, ומערבבים על ידי pipetting בעדינות.
    4. באמצעות הטיפים אותו, חזור 1 הבא: דילולים 2 על פני הצלחת כולה. מחק 100 μl מכל אחת הבארות בעמודה האחרונה.
    5. תביאו את הנפח הסופי של כל בארות 200 μl ידי הוספת 100 בינוני μl היטב כל אחד. דגירת PLAte באין מפריע על 37 מעלות צלזיוס CO ₂ באינקובטור humidified.
    6. בדקו היטב כל ולסמן כל הבארות המכילות רק מושבה אחת. לבצע שתיים או יותר clonings עד> 90% מהבארות המכילות שיבוטים יחידים הם חיוביים עבור ייצור נוגדנים.
13. מסך שיבוטים על ידי כתם המערבי כתם נקודה (פרוטוקול 3.1-4.6). אז מושבות תת מבאר לתוך כלי גדול יותר כדי להרחיב את התאים לקבלת מב. בדרך כלל כל שיבוט מועבר לתוך באר אחד בצלחת 12 או 24 גם.
14. מדוד את הזיקה בין מבז ואת תמציות שריר פרה, עז, חזיר, כלב, ארנב, טונה, עוף, חותם, וארבעה מינים cetacean מייצג על ידי כתם המערבי כתם נקודה (פרוטוקול 3.1-4.6).
15. לחסן תאים hybridoma שנבחרו (עד 3 x 10 ⁶⁾ intraperitoneally לעכברים לגרום מיימת. נפיחות בטן היא בדרך כלל ברורות בתוך 7-10 ימים שלאחר הזרקת hybridoma. אסוף נוזל באמצעות מחט מזרק(פחות מ 20 מד).
16. נוזל מיימת צנטריפוגה (10,000 XG במשך 10 דקות) כדי להסיר תאים ופסולת. סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. להוסיף 1 עד 20 מ"ל של המדגם, 15 מ"ל חיץ מחייב, ו 3 עד 5 מ"ל של חיץ elution לתוך הטור חלבון G Sepharose. אסוף את שבריר elution המכיל נוגדנים מטוהרים מן נוזל מיימת עכברים.
17. קבע את אלוטיפ נוגדנים על ידי ערכת isotyping נוגדן באמצעות הוראות היצרן.

3. כתם המערבי

1. הכן חיץ טעינת 2x המכיל mercaptoethanol β (BME) על ידי ערבוב 950 μl של חיץ מדגם 2x Laemmli עם 50 μl של BME. לדלל את supernatants השריר (פרוטוקול 1.1-1.4) במאגר טעינה עם יחס מתאים לקבלת קליטה טובה: 01:50 (יונקים ימיים חותם) ו -1: 5 (חיות בית וטונה) בעת שימוש ארנב polyclonal נוגדן Mb אנטי אנושי, ו 1: 1 (חזיר, ארנבת, עוף וטונה), 1: 5 (פרה, עז וכלב), ו 01:25 (יונקים ימיים ואת החותם) כאשרntibody הוא מ- supernatant hybridoma.
2. מדגם מחמם על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דגימות טען לתוך הבארות של ג'ל SDS-PAGE (לערום acrylamide 4% ומפריד acrylamide 12%) יחד עם סמנים משקל מולקולרי. הרץ את הג'ל במשך 5 דקות ב 50 V ואז להגביר את המתח ל -150 V כדי לסיים את הריצה ב כ -1 שעה.
3. מניחים את הג'ל במאגר העברת 1x במשך 15 דקות. מעביר את החלבון המופרד כדי ניטרוצלולוזה (NC) ממברנות לאחר שהם מופרדים על ידי עמוד. העברה ניתן לעשות זאת ב -100 V עבור 60-90 דקות.
4. כן פתרון לחסימה: 1x PBS המכיל 0.1% Tween 20 עם 5% חלב יבש ללא שומן. חסום את הממברנה NC ב 25 מ"ל של חסימת פתרון בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 15 מ"ל תמיסת מלח פוספט שנאגרו עם Tween 20 (PBST).
5. דגירה הממברנה נוגדן ראשוני (נוזל מיימת או supernatant hybridoma) ב 10 מ"ל מדולל חיץ דילול נוגדן עם פתרון חסימת 5% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
6. שטפו את membranדואר שלוש פעמים שוב עם PBST לנקות את הנוגדן מוגזם.
7. דגירה הממברנה עם IgG אנטי עכבר עז phosphatase מצומדות אלקליין ב 1: 1,250 בתמיסה חוסם עם תסיסה עדינה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
8. לשטוף את הממברנה שוב דגירה אותו כלוריד 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט / p-nitroblue tetrazolium תערובת המצע phosphatase (BCIP / NBT) במשך 10 עד 20 דקות עד ופיתוח צבע.
9. עצור את התגובה על ידי שטיפת הממברנה בכמה שינויים של מים מזוקקים.

4. דוט כתם

1. לדלל את supernatants שריר (פרוטוקול 1.1-1.4) ב אלבומין 5% שור (BSA) ב PBST עם יחס מתאים לקבלת קליטה טובה: 1: 5 חיות בית וטונה, ו 01:25 עבור יונקים ימיים ואוטמים. ספוט 5 μl של דגימות על הממברנה. לצמצם את השטח שהפתרון חודר (בדרך כלל 3-4 מ"מ קוטר) על ידי יישום זה לאט.
2. לייבש את הממברנה בטמפרטורת החדר (למשל, </ Em> בזרימה למינרית במשך 30-60 דקות), לחסום אותו עם פתרון חסימת בצלחת פטרי עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר, לשטוף אותו עם PBST.
3. דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני (מב מ supernatant hybridoma ב 1: 10,000 או נוזל מיימת ב 1: 100,000 מדולל פתרון חסימת 5%) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
4. השתמש PBST כדי לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל להסיר נוגדן עודף ולאחר מכן דגירה אותו עם נוגדנים משני (אלקליין פוספטאז מצומדות העז IgG אנטי עכבר בבית 1: 1,250 ב 5% פתרון חוסם) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר .
5. לשטוף את הממברנה שוב דגירה אותו בתערובת המצע phosphatase BCIP / NBT בתוך 10 עד 20 דקות עד ופיתוח צבע.
6. עצור את התגובה על ידי שטיפת הממברנה בכמה שינויים של מים מזוקקים.

5. עקיפה ELISA

1. הכן חיץ כביסה (0.002 M בופר imidazole עם 0.02% Tween 20). לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם כביסהחיץ בין כל שלב הבא (פרוטוקול 5.2-5.5).
2. כן 01:25 דילול של supernatants שריר (פרוטוקול 1.1-1.4) במאגר ציפוי. מעיל צלחת ELISA 96-היטב עם 100 μl supernatants מדולל ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולחסום אותו עם חיץ חסימת (BSA 1% ב PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
3. כן 1: 2,000 דילול של מב מטוהר עם חיץ מדולל ולהוסיף 100 μl של בדילול מב היטב כל אחד. דגירה את הצלחת עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
4. הוסף עז נגד העכבר IgG מצומדות עם peroxidase חזרת (1: 200 דילול חיץ בדילול) עבור הדגירה נוספת.
5. הוסף מצע peroxidase היטב כל (100 μl / טוב) ו דגירה של 10-15 דקות.
6. עצור את תגובת האנזים ידי פתרון peroxidase stop (100 μl / טוב) כאשר פיתוח צבע הוא ציין.
7. קראו את הצפיפות האופטית ב 450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate.

6. הכנת קולואיד זהב שכותרתו מב

הערה: הצבע של פתרון זהב colloidal ואת התערובת צריך תמיד להיות אדום. התאם את ה- pH, ריכוז של מב, מהירות צנטריפוגות כאשר משקע שחור לב. צעדים 6.1 ו 6.2 הם צעדים אופטימיזציה.

1. להוסיף מטוהרים גילוי מב (50 מיקרוגרם / מ"ל, 3 μl) 100 μl של פתרון זהב colloidal עם ערכי pH הנעים בין 5-9. ה- pH המינימום שמחזיק את הצבע האדום למשך שעות נחשב pH האופטימלי. הערה: במחקר זה, 0.1 M אשלגן פחמתי שימש להתאים זהב קולואיד (40 ננומטר) הפתרון 8.0 pH (pH אופטימלי).
2. להוסיף סכום שונה של גילוי מטוהר מב (500 מיקרוגרם / מיליליטר, 1-20 μl) 100 μl של פתרון זהב colloidal ב- pH 8.0. הערה: הריכוז האופטימלי במחקר זה הוא 6 מיקרוגרם / מיליליטר (ללא משקע שחור).
3. על פי התוצאות הנ"ל, להוסיף 60 מיקרוגרם של גילוי טיפה חכמה מב מטוהר 10 מיליליטר של תמיסת זהב קולואיד. חלב את התערובת בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוֹדָעָהד 2 מ"ל של תמיסת BSA 5% ב PBS (pH 7.4) לתערובת ו ת חלב בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להפחית הפרעות רקע.
4. צנטריפוגה את התערובת על XG 10,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C..
5. הסר את supernatant עם נוגדן unconjugated בזהירות להשעות את כדורי וכתוצאה מכך 4 מ"ל PBST המכיל% BSA 1% ו -0.1 Tween 20, וחזור פעמים צנטריפוגה ההשעיה כמה.
6. להשעות את המשקעים הסופיים ב 1 מיליליטר PBST ולאחסן אותו ב 4 ° C עד בשימוש.

7. בניית רצועת החיסון

הערה: איור 1 מציג את עיצוב רצועה החיסוני. הכן ולהרכיב את הרצועות במצב סביבת מעבדה נמוכה לחות (<20% לחות יחסית) לכל חי אחסון ממושכים (> yr 1). מידות של רפידות הממברנה הם: 300 כרית המצומד מ"מ x 10 מ"מ, משטח סופג 300 מ"מ x 24 מ"מ, כרית מדגם 300 מ"מ x 24 מ"מ, קרום NC 300 מ"מ x 25 מ"מ, קרטון 300מ"מ x 80 מ"מ.

1. הוסף פתרון מב זהב שכותרתו קולואיד משלב 6.6 עם micropipette כדי להרוות את כרית המצומד ולאחר מכן לייבש אותו על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לפני הרכבה.
2. הפץ את מב הספציפי לכיד אנטיגן (500 מיקרוגרם / מיליליטר) על אזור הבדיקה, ארנב IgG אנטי העכבר (500 מיקרוגרם / מיליליטר) על האזור המלא לאיתור מב על הממברנה NC באמצעות מדפסת פיפטה או immunostrip. שמירה על מרחק (> 5 מ"מ) בין שני האזורים כדי למנוע הפרעה.
3. הדבק את כרית מצומדות, כרית ספיגה NC קרום על קרטון עם דבק דו-צדדי.
   הערה: חופף את הרפידות בכל צד של הממברנה NC בכ -2 מ"מ. בניית רצועה מתאימה תגרום מבחן שלם.
4. מניח את משטח המדגם על המשטח המצומד (2 מ"מ) ולהדביק אותו על הקרטון.
5. צור רצועות ברוחב 6 מ"מ עם חותך נייר. ארוז את הרצועות בשקית נייר האלומיניום עם יבוש, ולאחסן אותם ב 4 ° C עד בשימוש.

מבחן חוצה תגובתיות 8.

1. Homogenize 0.03 גרם של המדגם שרירים גלם עם 1 מ"ל PBS (המכיל BSA 0.1%) בצינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות בעזרת מקל במבוק או שחיקה מוט.
2. החזק את הרצועה ידי ההפך קץ באזורי הבדיקה טובל את חלק כרית מדגם לתוך הדגימה למשך 5-10 דקות ולבחון את התוצאה ישירות.
   1. אופציונלי: לאסוף 500 μl supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגות חדשות.
      הערה: שלב זה הוא הציע אם האות אינה מובנת מאליה כאשר רצועת ספוג ישירות לתוך supernatant.
3. בחן דגימות שריר שונות בשלושה עותקים.
   הערה: כאן בדקנו טונה, עוף, חותם, 15 מינים של יונקים ימיים ו -5 מינים של יונקים יבשתיים.
4. יש חמישה פקחים עצמאיים לחזור 8.3 במשך חמש פעמים, כלומר, להשתמש 575 רצועות בסך הכל.

תוצאות

מאפיינים חד-שבטיים נוגדנים

פיתחנו שני מבז IgG ₁ (CGF5H9 ו CSF1H13) הכרה שני פפטידים סינתטיים (MKASEDLKKHGNTVLC ו AIIHVLHSRHPAEFGC), בהתאמה, של cetacean Mb, ואלה שימשו לבניית פס הבדיקה immunochromatographic זהב colloidal כריך סוג עבור איתור מהיר של Mb cetacean. איור 2 מראה כי CGF5H9 מזהה יונקים ימיים ויונקים אחרים כלהקה צבעונית אחת בכל משקל מולקולרי החזוי של 17 kDa למיד...

דיון

באמצעות פפטיד סינטטי מצומדות לחלבון מוביל להפליא יעיל יותר בהשוואה לחלבון מאותו המקור שלה. עבור טכניקת כריך מבוסס, כי מב מפותחת באמצעות אפיטופים עם מיקומים יחסיים ידועים, שני מהבז במחקר זה אינו צפוי להפריע זה אינטראקציה של אחרים עם epitope אנטיגן היעד. יתר על כן, תגובתיות בין חלבון יליד הנוגדן של עכברים שחוסנו עם פפטיד סינתטי המצומד עשוי להיות חזק יותר תגובתיות בין חלבון יליד הנוגדן המופק חלבון יליד ^19. השימוש conjugates פפטיד סינתטי מומלץ ולכן לפרוצדורות חיסון יעיל דור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט חוצץ	מלח AMRESCO	J373
חלבון G HP SpinTrap	GE  בריאות	28-9031-34	עמודת ספין המכילה חלבון G Sepharose
IsoStrip עכבר ערכת איזוטיפ נוגדנים חד שבטיים	של Roche	11493027001	, מצופות מראש בנוגדנים נגד Ig ספציפיים לתת-מחלקה ושרשרת קלה
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
קרום ניטרוצלולוז	Whatman	Z613630
נוגדן פתרון חוסם	LTK BioLaboratories		למזער אינטראקציות קשירה לא ספציפיות של IgG לא ספציפי בדגימות
BCIP/NBT פוספטאז מצע	KPL	50-81-00
גלאי חלבון HRP Microwell Kit, נגד עכבר	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate	Thermo  פישר סיינטיפיק	EW-01928-08
מולטיסקאן  קורא EX ELISA	תרמו  אלקטרון  תאגיד	51118170
תמיסת זהב קולואיד (40 ננומטר)	REGA ביוטכנולוגיה בע"מ		40-50 ננומטר מתאים
לאלבומין סרום בקר	Gibco	15561-020
מדפסת רצועות בדיקה מהירה	REGA ביוטכנולוגיה בע"מ.	AGISMART RP-1000	מתאים רק לייצור בקנה מידה קטן של רצועות חיסון למטרות מחקר ופיתוח
רכיבי רצועה (ממברנות NC, רפידות דגימה (#33 זכוכית, S& S), רפידות מצומדות (#16S, S& S) ורפידות סופגות (CF6, Whatman))REGA	biotechnology Inc.
פרוינד' s אדג'ובנט ופרוינד לא שלם' s adjuvant	סיגמא-אולדריץ'	F5881, F5506	משמש לייצור תחליבי מים בשמן של אימונוגנים
אקרילאמיד, מאגר ג'ל, אמוניום פרסולפט (APS), טטרמתיל-אתילנדיאמין (TEMED)	הכנת		ל-SDS-PAGE
Coomassie כחול מבריק R-250	Bio-Rad	1610436	צביעת חלבון בג'ל SDS-PAGE
בופר דגימת Laemmli ו-β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	לדלל דגימות חלבון לפני הטעינה על ג'ל SDS-PAGE