Method Article

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב C. elegans שימוש בכלי קוד פתוח

DOI:

10.3791/53469

⸱

December 16th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמותית לכידת תהליכים התפתחותיים היא חיונית כדי להפיק מודלים ומפתח מכניסטית לזהות ולתאר פנוטיפים מוטציה. כאן פרוטוקולים מוצגים להכנת עוברים וג הבוגר elegans בעלי חיים למיקרוסקופיה זמן לשגות טווח קצר וארוך ושיטות למעקב וכימות של תהליכים התפתחותיים. כל השיטות שהוצגו מבוססות על ג זנים זמינים במרכז לגנטיקת Caenorhabditis ועל תוכנת קוד פתוח elegans שניתן ליישם בקלות בכל מעבדה עצמאית של מערכת מיקרוסקופיה בשימוש. בנייה מחדש של מודל תא-צורת 3D באמצעות IMOD תוכנת דוגמנות, (velocimetry תמונה דיגיטלי חלקיקים זמן נפתר מעקב ידני של מבני subcellular fluorescently שכותרתו באמצעות התכנית רב תכליתי ניתוח תמונת Endrov, וניתוח של זרימת התכווצות בקליפת המוח באמצעות PIVlab כלי לMATLAB) מוצג. הוא דן כיצד גם ניתן לפרוס שיטות אלה לאo ללכוד כמותית תהליכים התפתחותיים אחרים בדגמים שונים, לדוגמא, מעקב תא ושושלת ההתחקות, מעקב של זרימת שלפוחית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם השיפורים מתמידים של חלבוני ניאון, הנדסה גנטית, מיקרוסקופ אור, ורך מחשב וחומרה, עכשיו זה אפשרי להקליט פיתוח של אורגניזמים מודל רבים ברזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. הדבר מאפשר לחוקרים לשאול שאלות שלא ניתן לטפל בעבר או לבקר תהליכים התפתחותיים ידועים כדי לחפש את היבטים התעלמו. התקדמות זו עוררה את תחום הביולוגיה התפתחותית כמותיים, שמטרתה להפוך את הדגמים איכותיים, פורמליים למודלים כמותיים על ידי מדידות יסודיות וניתוחים סטטיסטיים.

תאי מעקב ומבני subcellular הפכו אותו ניתן להפיק מודלים כמותיים של התפתחות עוברית, פעילות מערכת עצבים, או תא חלוקה 1-12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ג elegans עוברים לזמן לשגות מיקרוסקופית באמצעות microbeads

  1. העבר את התולעים בוגרות הרות להולדת באמצעות איסוף תולעת (חוט פלטינה) לירידה של חיץ M9 ולנקות את החיידקים על ידי התססה הראשונה במרץ ולאחר מכן העברה כל תולעת לירידה הסמוכה M9 באמצעות שוט עין רכוב על גבי טנדר שן / טיפ פיפטה או להשתמש בנימי זכוכית מחודדות.
  2. לדלל את הפיזור המכיל 20 מיקרומטר חרוזי פוליסטירן בקוטר של פי 10 במאגר M9 (1 חיץ L M9 מכיל 3 גרם KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HP....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי שימוש בפרוטוקולים 2, 3, ו -4, הזמן לשגות הדמיה של בלוטות מין בג הסוג בר elegans מבוגרים מתבצע (OD58 מתח (UNC-119 () III ed3; ltIs38 [pAA1; עוגה-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), מבטא את סמן קרום מאמרגן germline ). התמקדות בתור של בלוטת המין, מודל 3D של תאי הנבט נוצר מנתונים מיקרוסקופ (איור 2). מודל זה מאפשר לנתח שינויים בגודל תא בזמן מעבר התאים יוצר דיסטלי הזרוע הפרוקסימלית, חושף את הארגון של rachis והגודל של אנשי הקשר של תאים ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מעקב אחר אובייקט בפיתוח, במעקב גרעיני מסוים, זה כבר אפשרי להבהיר מנגנוני דפוסים מרכזיים של ג elegans עובר 1,23,24. הרחבת אסטרטגיה זו לתפוקה גבוהה יותר, זה כבר אפשרי לאחרונה לחשוף כללי דפוסים נוספים ולהציע שיטה איך להסיק דפוסים שולטת דה נובו 10. למוטציות רבות, עם זאת, פגמי דפוסים המדויקים עדיין אינם ידועים. השיטות שתוארו כאן הן כלים שיכולים להיות אינסטרומנטלי בהבהרתם. חשוב לציין, זה הפך להיות ברור בשנים האחרונות שלמרות שרבי מערכות מוד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר במעבדה ל-CP ממומן על ידי ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) ורשתות יוביקוויטין של אשכול המחקר LOEWE. CP נתמך גם על ידי תוכנית המסגרת של האיחוד האירופי 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופ סטריאוMotic/VWROT4005Sמיקרוסקופ סטריאו לדיסקציה והרכבה
של מיקרוספירות פוליסטירן פוליחרוזים, Polysciences18329הרכבה של עוברים
20 ומיקרו; m
מיקרוספירות פוליסטירן פוליסטירן, Polysciences876בעלי חיים בוגרים הרכבה
0.1 ומיקרו; m
שקופיות מיקרוסקופVWR631-0902הרכבה לבעלי חיים בוגרים
כיסוי זכוכית 18x18 מ"מVWR631-1331הרכבה לעובר/מבוגר
זכוכית כיסוי 24x60 מ"מVWR631-1339הרכבה לעובר
VWR233-5455נתיחת עובר
צינורות סיליקוןVWR228-1501צינורות לפיפטה
פה 30 מ"מ PTFE ממברנה מסנןNeoLabJul-01מסנן לפיפטה
צינורות נימייםVWR621-0003קצה פיפטה לפיפטה פה
וזליןרוט E746.1עובר/מבוגר הרכבה
אגררוט5210.5בעלי חיים בוגרים הרכבה
אשלגן-די-הידרוגנפוספטרוטP018.2M9 מאגר
די-נתרן-מימן פוספטרוטP030.2M9 מאגר
נתרן כלורירוט3957.1M9 מאגר
VisiScope מסתובב דיסק קונפוקלימערכות Visitron n/aמיקרוסקופיה קונפוקלית
אזמל פה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
  2. Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans Developmental BiologyTime lapse MicroscopyOpen source Software3D Cell Shape ModelingFluorescent TrackingParticle Image VelocimetryCortical Contractile FlowCell Lineage TracingVesicle Flow TrackingQuantitative Image Analysis

Related Articles