הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב

13.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53481

⸱

14 בינואר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Systems Biology, VIB, Ghent, 2Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מערכת השראת השורש הרוחבי (LRIS) מאפשרת אינדוקציה סינכרונית של שורשים לרוחב ומוצגת עבור Arabidopsis thaliana ותירס.

תקציר

התפתחות שורשים לרוחב תורמת משמעותית למערכת השורשים, ולכן היא חיונית לצמיחת הצמח. עם זאת, המחקר של התחלת שורש לרוחב הוא מייגע, מכיוון שהוא מתרחש רק בכמה תאים בתוך השורש ובאופן בלתי צפוי. כדי לעקוף בעיה זו, פותחה מערכת השראת שורש לרוחב (LRIS). על ידי טיפול בשתילים ברצף עם מעכב הובלת אוקסין ואוקסין סינתטי, התחלת שורש לרוחב מבוקרת מאוד מתרחשת באופן סינכרוני בשורש הראשוני, ומאפשרת דגימה בשפע של שלב התפתחותי רצוי. ה-LRIS פותח לראשונה עבור Arabidopsis thaliana, אך ניתן ליישם אותו גם על צמחים אחרים. בהתאם לכך, הוא הותאם לשימוש בתירס (Zea mays). ניתנת סקירה מפורטת של השלבים השונים של ה-LRIS בשני המפעלים. השילוב של מערכת זו עם טרנסקריפטומיקה השוואתית איפשר לזהות הומולוגים פונקציונליים של גנים להתחלת שורש לרוחב Arabidopsis במינים אחרים, כפי שמודגם כאן עבור CYCLIN B1; 1 (CYCB1; 1) גן מחזור התא בתירס. לבסוף, נדונים העקרונות שיש לקחת בחשבון בעת פיתוח LRIS עבור מיני צמחים אחרים.

מבוא

מערכת השורשים היא קריטית לצמיחת צמח, שכן הוא מבטיח מעגן וספיגה של מים וחומרים מזינים מהאדמה. בגלל ההתרחבות של מערכת שורשים בעיקר מסתמכת על הייצור של שורשים לרוחב, הייזום והקמה שלהם נחקרו בהרחבה. שורשים לרוחב הם יזמו בתת-קבוצה מסוימת של תאי pericycle, הנקראים תאי מייסד 1. ברוב dicots, כגון thaliana ארבידופסיס, תאים אלה נמצאים בקטבי protoxylem 2, ואילו בmonocots, כגון תירס, שהם נמצאים בקטבי השיפה 3. תאי מייסד מסומנים על ידי תגובת אוקסין עלה 4, ואחריו ביטוי של גני מחזור התא ספציפיים (למשל, cyclin B1; 1 / CYCB1; 1), לאחר שהם עוברים סיבוב ראשון של חטיבות anticlinal סימטריות 5. לאחר סדרה של חטיבות anticlinal וpericlinal מתואמות, primordium שורש לרוחב נוצר שסופו של דבר יתגלה כשורש לרוחב utonomous. המיקום והעיתוי של תחילת שורש לרוחב עם זאת לא צפויים, שכן אירועים אלה הם לא בשפע ולא מסונכרנים. זה מונע את השימוש של גישות מולקולריות כגון transcriptomics ללמוד את התהליך הזה.

כדי להתמודד עם זה, מערכת לרוחב שורש עין מתנהל (LRIS) פותחה 6, 7. במערכת זו, מטופלים שתילים ראשון עם N חומצת -1-naphthylphthalamic (רט"ג), אשר מעכב תחבורת אוקסין וצבירה, וכתוצאה מכך חסימת ייזום שורש לרוחב 8. על ידי המשך העברת השתיל למדיום המכיל את חומצת אוקסין הסינתטי 1-נפתלין אצטית (NAA), כל שכבת pericycle מגיבה לרמות הגבוהות אוקסין כך מסיבית חטיבות התרמה לרוחב שורש ייזום תא 6. ככזה, מערכת זו מובילה לחניכות שורשים לרוחב מהירות, סינכרוני ונרחבים, המאפשרת איסוף קל של דגימות שורש מועשרים לשלב ספציפי של מנוחפיתוח שורש RAL. בהמשך לכך, ניתן להשתמש בדוגמאות אלה כדי לקבוע פרופילי ביטוי הגנום במהלך היווצרות שורש לרוחב. LRIS הניב ידע משמעותי כבר על התחלה לרוחב שורש בארבידופסיס ותירס 9-13, אבל הצורך ליישם במערכת זו כדי מיני צמחים אחרים הופך ברור יותר ככל שיותר הגנומים רצף ויש עניין גובר להעברת ידע לחשוב חסכוניים מִין.

הנה, הפרוטוקולים מפורטים של ארבידופסיס וLRISs התירס מקבלים. בשלב הבא, דוגמא של השימוש במערכת מסופקת, על ידי הממחיש כיצד ניתן להשתמש בנתוני transcriptomics צברו מLRIS התירס לזהות homologs הפונקציונלי שיש להם תפקיד שימור בייזום שורש לרוחב על פני מיני צמחים שונים. לבסוף, הנחיות כדי לייעל את LRIS למיני צמחים אחרים מוצעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ארבידופסיס LRIS פרוטוקול

הערה: הטקסט מתייחס לניסויים בקנה מידה "קטנים" או "גדולים". ניסויים בקנה מידה קטנים, כגון ניתוח קו הסמן וצביעה היסטולוגית 6, 14, דורשים רק כמה דוגמאות. ניסויים בקנה מידה גדולים, כגון בזמן אמת כמותי qRT-PCR, מיקרו-מערכי 9-11 או רצף RNA, דורשים כמות גדולה יותר של דגימות. ככזה, סכום של ~ 1000 שתילים לדגימה שימש אל Vanneste et. 11 לבצע ניסוי microarray לאחר נתיחת קטע השורש.

יום 1

  1. עיקור של זרעי ארבידופסיס
    הערה: בחר באחד מההליכים לעיקור הזרע הבאים. כל אחד מהם מתאים לשלבים הבאים של הפרוטוקול. עיקור גז (1.1.2) מציג שני יתרונות עיקריים על פני עיקור נוזלי (1.1.1): זה לוקח פחות זמן בעת ​​טיפול בתחושה גדולהאה של זרעים, שכן אין pipetting צריך להתרחש לדגימות בודדות; וניתן לאחסן את הזרעים המעוקרים לתקופה ארוכה יותר. עם זאת, זה דורש ייבוש וטיפול זהיר.
    1. עיקור נוזל
      1. יוצקים את המספר הרצוי של זרעים בצינורות מיקרו צנטריפוגות. השתמש עד 20 מ"ג (~ 800 זרעים) בצינור 1.5 מיליליטר או 40 מ"ג (~ 1,600 זרעים) ב2 צינורות מיליליטר מיקרו צנטריפוגות.
      2. הוסף 1 מיליליטר של אתנול 70%. היפוך או בעדינות לנער במשך 2 דקות.
      3. החלף את אתנול 70% עם פתרון עיקור 1 מיליליטר במשך 15 דקות. (הכן פתרון עיקור טרי: 3.85 מיליליטר hypochlorite נתרן (מניית NaOCl) (12%) (זהירות: שימוש בעשן מכסה המנוע), 5 μl 20 Tween, עד 10 מיליליטר עם מים להפוך את הצינורות כמה פעמים כדי לוודא שכל הזרעים לבוא. במגע עם הפתרון.
      4. בזרימה אוויר קבינט מינרית, להחליף את פתרון העיקור במים מזוקקים סטריליים 1 מיליליטר ולשטוף את הזרעים 5 פעמים במשך 5 דקות על ידי חוזר ונשנהly החלפה עם 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים טריים.
    2. עיקור גז
      1. יוצקים את המספר הרצוי של זרעים בצינור מיקרו צנטריפוגות 2 מיליליטר. השתמש בצינורות בודדים כאשר עובדים עם כמה שורות עצמאיות, ולסדר אותם פתח בתיבת צינורות מיקרו צנטריפוגות פלסטיק או בעל. אם מספר הזרעים בצינור אחד עולה על 500 (12.5 מ"ג), לחלק את הזרעים במספר המתאים של צינורות כדי להבטיח עיקור מוצלח. ודא כמוסות של צינורות שכנים לא לכסות אחד את השני. מתאים זה לזה את המכסה של התיבה בתחתית, כפי שהוא צריך להיות בתא הייבוש, כמו גם לעיקור.
      2. מניחים את התיבה בקערה של ייבוש, יחד עם כוס זכוכית (זהירות: שימוש בעשן מכסה המנוע).
      3. מלא את הכוס עם 12% NaOCl 100 מיליליטר (זהירות: מנדף שימוש). שים את המכסה על הייבוש, אבל להשאיר פתח קטן שבו הכוס ממוקמת.
      4. להוסיף 3 מיליליטר של 37% חומצה הידרוכלורית (רותח) (CAUהמוזכרות: השתמשו עשן מכסה המנוע) לכוס דרך פתח הקטן ולסגור את הייבוש במהירות. בועת הפתרון לכמה זמן עקב היווצרות Cl 2 -gas. השאר את המערכת סגורה O / N (או לפחות 8 שעות).
      5. הסר את מכסה תא ייבוש. קח את הקופסה ולכסות אותו עם המכסה, כדי למנוע זיהום במהלך הובלה.
      6. לשים את הקופסה בזרימה אוויר קבינט מינרית, להסיר את המכסה ולהשאיר את הזרעים כ 1 שעות על RT כדי לאפשר שחרור גז.
        הערה: זרעים יכולים להיות מאוחסנים בבטחה יבש בצינורות מיקרו צנטריפוגות סגורים עד 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. אינדוקציה שורש לרוחב בארבידופסיס
    1. רוחב שורש עיכוב (רשות הטבע והגנים טיפול)
      1. הכן מדיום גידול לצמיחה במבחנה. הבינוני מכיל מחצית כוח תערובת Murashige וSkoog מלח 15, מיו-אינוסיטול L / 0.1 G, 10 גר '/ סוכרוז L, והוא נאגר עם 0.5g / L חומצת ethanesulfonic 2 (N-morpholino) (MES).
      2. התאם את ה- pH 5.7 עם 1 M KOH. הוסף 8 גרם / L של אגר רקמות צמח וחיטוי הבינוני במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
      3. הכן פתרון מניות מ"מ 25 של רשות הטבע והגנים בdimethylsulfoxide (DMSO) (זהירות: כפפות שימוש). בזרימה אוויר קבינט מינרית, לקרר את מדיום autoclaved עד כ 65 מעלות צלזיוס (שהיא הטמפרטורה בה הבקבוק יכול להיות מוחזק ביד), ולהוסיף 25 פתרון מניות מ"מ רשות הטבע והגנים כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר רשות הטבע והגנים.
      4. Homogenize על ידי בעדינות רועדת בנוסף הבקבוק במשך 10 שניות. יוצקים 50 מיליליטר של מדיום לצלחת פטרי רבוע (12 סנטימטרים X 12 סנטימטרים).
        הערה: במקרה של ניסוי בקנה מידה גדול, תחול רשת ניילון (20 מיקרומטר) כדי להבטיח העברה קלה. הכן רשת (9 סנטימטרים x 9 סנטימטרים) למעוקר (איור 1 א). כאשר autoclaved, להחיל את הרשת למדיום הגידול באמצעות פינצטה סטרילית (איור 1). דחף בעדינות את הרשת למדיום הגידול באמצעות STErilized drigalsky כדי לוודא שהוא נמצא בקשר טוב עם מדיום הגידול (איור 1) (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים).
      5. לזרוע את הזרעים ברשות הטבע והגנים-הצלחות.
        הערה: במקרה ניסוי בקנה מידה גדול מתוכנן, לזרוע 2 שורות צפופות ומיושרים היטב של 50 זרעים כדי להקל על הדגימה (ראה 1.2.2.3).
        1. במקרה של עיקור נוזל, לזרוע את הזרעים ברשות טבע וגנים-צלחות באמצעות pipet 200 μl. חותך את 3 - 4 מ"מ של סוף הטיפים pipetting בתנאים סטריליים (או לפני העיקור של הטיפים) כדי להיות מסוגל pipet הזרעים. Pipet למעלה ולמטה כמה פעמים מחדש להשעות את הזרעים, ואז pipet מים כ 150 μl סטרילי עם 10 - 20 זרעים ולחכות עד משקעי זרעים בתחתית של הקצה. (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים)
          הערה: כאשר נוגע באגרה או הרשת בעדינות עם הקצה, טיפת מים עם זרע תשוחרר ממנו (איור 1 ג).
        2. במקרה של עיקור גז, לזרוע את הזרעים באמצעות toothpicks.Pinch autoclaved הקיסם לתוך אגר לפני שלקח את הזרעים על מנת להבטיח משטח דביק. להרים את הזרעים האחד אחד באמצעות הקיסם ולהפיץ את הזרעים על הצלחות (1D איור). לחלופין, להוסיף מים סטריליים לזרעים, ולזרוע כמתואר ב1.2.1.5.1 (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים).
      6. לאטום את הצלחות עם נייר דבק לנשימה ולאחסן אותם צלחות על 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך לפחות 2 ימים ובשבוע אחד לכל היותר. זה נחוץ לריבוד ומבטיח מסונכרנים ונביטה יעילה יותר.
        הערה: לחלופין, ניתן ריבוד זרעים לפני הזריעה, שקועים במים מזוקקים בצינורות מיקרו צנטריפוגות, אשר דורש מרחב מקרר פחות. במקרה זה, לאחסן הצינורות לפחות שבוע אחד ב 4 ° C, ולהעביר את הצלחות לארון הצמיחה מייד לאחר הזריעה (ראה 1.2.1.7).
        יום 3
      7. הזז את הצלחות לארון הגידול (אור רציף (110 מטר של -2 -1), ג '21 ° μE) במשך 5 ימים (2 ימים של נביטה וצמיחה של 3 ימים) במצב כמעט אנכי (80 עד 90 מעלות) על מנת להבטיח צמיחת שורש ב, ולא בטווח הבינוני.
        יום 8
    2. רוחב שורש אינדוקציה (NAA טיפול)
      1. הכן את אותו מדיום הגידול כפי שתואר ב1.2.1.1 ו1.2.1.2. הכן פתרון 50 מ"מ מניות של NAA בDMSO (זהירות: כפפות שימוש). מגניב בינוני autoclaved עד 65 מעלות צלזיוס ולהוסיף פתרון NAA למדיום כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר NAA (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים).
        1. Homogenize על ידי בעדינות רועדת בנוסף הבקבוק במשך 10 שניות. יוצקים 50 מיליליטר של מדיום לצלחת פטרי רבוע (12 סנטימטרים X 12 סנטימטרים).
      2. העבר את השתילים מהצלחות המכילות מדיום גידול בתוספת 10 מיקרומטר רשות הטבע והגנים לsup אלהליישמם עם 10 מיקרומטר NAA.
        1. הוק זרועות פינצטה מעוקלת תחת הפסיגים של השתיל ובעדינות מסירה אותו מהצלחת. להעביר רק שתילים שהשורשים גדלו כולו במגע עם רשות הטבע והגנים בינוניים-צמיחה ורצוי כלפי מטה.
        2. לרחף השורש על פני מדיום גידול המכיל NAA על פני מרחק קטן. ודא ששורשי הצמח נמצאים בקשר טוב עם מדיום הגידול. במידת הצורך, לחץ על השורש בעדינות אל פני השטח מדיום גידול עם פינצטה.
          הערה: במקרה של ניסוי בקנה מידה גדולה, להסיר את כל השתילים שאינם במגע עם הרשת והעברה על ידי הרמת הרשת בשתי פינות העליונות עם פינצטה. ודא הרשת נמצאת בקשר טוב עם המדיום המכיל NAA על ידי רפרוף הרשת על פני אגר על פני מרחק קטן (איור 1E).
      3. לאטום את הצלחות החדשות עם קלטת לנשימה ולמקם אותם בארון הצמיחה (קוןאור tinuous (110 מטר של -2 -1 μE), ג '21 °) במצב אנכי לזמן הרצוי לאחר אינדוקציה עד דגימה.
        הערה: במקרה של ניסוי בקנה מידה גדולה, להשתמש באזמל כדי לחתוך קטעי השורש בבת אחת ישירות על הרשת ולדגום אותם בעדינות על ידי גירוד פני השטח של הרשת.

2. LRIS תירס פרוטוקול

  1. ריבוד של גרעיני תירס
    1. דגירה גרעיני התירס ב 4 ° C בחושך במשך השבוע לפחות 1.
      הערה: פרוטוקול זה פותח באמצעות הקו טהור תירס B73.
  2. עיקור של גרעיני תירס
    יום 1
    הערה: למרות ששתילי תירס לא צריכים להיות מבוגרים בתנאים סטריליים, מומלץ לעקר את גרעיני התירס ולעבוד עם חומר סטרילי כדי למנוע צמיחת פטרייה בגליל הניירמַעֲרֶכֶת.
    1. שים את המספר הדרוש של גרעיני תירס בכוס זכוכית מעוקרת.
    2. להוסיף לפתרון עיקור (6% NaOCl במים) (זהירות: מנדף שימוש) 100 מיליליטר.
    3. הוסף בר ומערבבים מגנטיים ומניח את הכוס על בוחש מגנטי במהירות ערבוב נמוכה (כ 250 סל"ד) על RT במשך 5 דקות.
    4. לשטוף חמש פעמים במשך 5 דקות על ידי החלפת הפתרון עם מים סטריליים טריים 100 מיליליטר.
  3. זריעת גרעיני תירס
    1. שים את כפפות כדי להפחית את הסיכון לזיהום, ולקחת גליל של מגבות נייר.
    2. לקרוע את שתי רצועות של נייר מגבת יד באורך כולל של שני גיליונות (כ 92 סנטימטרים X 24 סנטימטרים) ומניח אותם על גבי זה על משטח נקי (איור 2 א).
    3. מקפלים את היריעות להכפיל על פני האורך (92 סנטימטרים X 12 סנטימטרים בערך) (איור 2 א).
    4. להשתמש בפינצטה כדי להפיץ 10 גרעינים בכ 2 סנטימטר מהחלק העליון מעל tהוא כל אורך הנייר, תוך שמירה על חלל ביניים של 8 סנטימטר בין כל ליבה ו8 סנטימטר חופשי בשני קצותיו (איור 2). ודא radicle של הקרנל פונה כלפי מטה וכלפי הנייר (איור 2).
    5. בעדינות לגלגל את הנייר על פני האורך, תוך שמירה על הזרעים במקום (איור 2). כדי להקל על הגלגול, זה הוא אופציונלי לראשון לרסס את הנייר עם מים סטריליים.
    6. שים את גלילי נייר בצינורות זכוכית מעוקרות של כ 6 סנטימטרים קוטר וגובה סנטימטר 14 (לדוגמא, 250 צינורות צנטריפוגה מיליליטר) ולמקם אותם במעמד (איור 2 ג).
  4. אינדוקציה שורש לרוחב בתירס
    1. הכן פתרון 50 מ"מ רשות הטבע והגנים מניות (מומס DMSO) (זהירות: כפפות שימוש).
    2. לכל צינור, להפוך את רשות הטבע והגנים פתרון 50 מיקרומטר על ידי הוספת 125 μl מפתרון מניות מ"מ רשות הטבע והגנים 50 עד 125 מיליליטר מים סטריליים בכוס זכוכית מעוקרת.
    3. מערבבים היטב ולשפוך 125 מיליליטר של פתרון רט"ג 50 מיקרומטר על גליל נייר בצינור. גליל הנייר יספוג את הפתרון ולהיות ספוגים לגמרי.
      הערה: כאשר משתמשים בגלילי נייר וצינורות עם ממדים אחרים, להתאים את עוצמת הקול בהתאם. הנוזל צריך להגיע באמצע הצינור כדי להבטיח ספיגה מספיקה.
    4. הנח את מערכת גליל נייר בקבינט צמיחה במשך שלושה ימים (27 מעלות צלזיוס, אור רציף, 70% לחות יחסית). ודא שגלילי הנייר יישארו ספוגים על ידי הוספת פתרון רט"ג 50 מיקרומטר נוספים, שכן הפתרון מתאדה לאורך הזמן (איור 2 ד).
      יום 4
    5. הכן פתרון 50 מ"מ NAA מניות (מומס DMSO) (זהירות: כפפות שימוש).
    6. לכל צינור, להכין פתרון NAA 50 מיקרומטר על ידי הוספת 125 μl ממניות 50 מ"מ NAA למים סטריליים 125 מיליליטר בכוס זכוכית מעוקרת.
    7. יש ללחוץ בעדינות את רוב פתרון רט"ג שנותר מגלילי נייר ומניחמ 'במים סטריליים במשך 5 דקות כדי לשטוף אותו החוצה (זהירות: כפפות שימוש). יש ללחוץ בעדינות את רוב המים מגלילי הנייר. חזור על שלב זה כביסה שלוש פעמים.
    8. מערבבים היטב ויוצקים את פתרון NAA 50 מיקרומטר מעל גלילי נייר בצינורות. לוודא שהם ספוגים לגמרי.
    9. הנח את מערכת גליל נייר בקבינט הצמיחה (27 מעלות צלזיוס, אור רציף, 70% לחות יחסית) למשך הרצוי לאחר אינדוקציה.
  5. אינדוקציה שורש לרוחב בשורשים adventitious כתר של תירס
    הערה: LRIS כפי שתואר לעיל גורם שורשים לרוחב בשורש הראשוני. עם זאת, בתירס וmonocotyledons אחר, השורש היסודי ושורשי הזרע העובריים, יחד עם השורשים לרוחבם, הם בעיקר חשובים בשתיל פיתוח. בשלב מאוחר יותר בגידול צמחים, שורשי adventitious פוסט-עובריים להתעורר על הגזע וגם לפתח שורשים לרוחב כדי ליצור מערכת שורשים חדשה 16. LRIS יכול להיות גם שימושד כדי לגרום לשורשים לרוחב על שורשי כתר adventitious פוסט-עובריים אלה על ידי ביצוע כמה שינויים קלים לLRIS על השורש העיקרי העוברי.
    1. כדי להפוך את גלילי נייר, ליצור כריך של ניירות עם בהתאמה שתי שכבות של נייר מגבת יד בצד החיצוני, ושתי שכבות של נייר נביטה בתוך. מניחים את הגרעינים המעוקרים (ראה צעדים 2.1-2.2) בין שני גיליונות נייר נביטה. נייר נביטה, בהשוואה לנייר מגבת, יהיה פחות נוטה לעבירות לשערות שורש ושורשים לרוחב, אשר תהפוך את הפתיחה של הנייר מתגלגלת קלה יותר בהמשך. מצד השני, שתי שכבות חיצוניות של נייר מגבת יד תקל קליטה של ​​הנוזל.
    2. הכנס את הלחמניות ב700 מיליליטר צינורות זכוכית ויוצקים מים סטריליים ללא רשות הטבע והגנים עליהם. לוודא שהם ספוגים לגמרי.
    3. לנבוט גרעינים המעוקרים בקבינט הצמיחה (ראה שלב 2.4.9).
    4. לגדול השתילים עד שורשי כתר adventitiousמתחיל לצוץ (6 ימים לB73). ודא גלילי נייר נשמרים רטובים כל הזמן על ידי הוספת מים סטריליים בעת צורך.
    5. העברה לפתרון 25 מיקרומטר רשות הטבע והגנים במשך 4 ימים (ראה צעדים 2.4.1 ל2.4.4), ואחריו אינדוקציה דומה חניכה שורש לרוחב על ידי החלפת פתרון רט"ג עם פתרון NAA 50 מיקרומטר לאחר שלב כביסה (ראה שלב 2.4 .5 ל2.4.9).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יישום של LRIS לבצע transcriptomics השוואתי של תהליך רוט ייזום הרוחב

אחד יישומים של LRIS הוא ההשוואה וההתאמה של פרופילי ביטוי גנים במהלך היווצרות שורש לרוחב במינים שונים. transcriptomics השוואתי גישות ליצור את האפשרות להצביע גני orthologous המעורבים בתהליך פיתוח השורש לרוחב במינים שונים. חניכה לרוחב שורש, אשר מורכבת מההיווצרות של אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול ארבידופסיס LRIS, חשוב להעביר רק את השתילים שצמחו כולו במגע עם מדיום גידול רשות הטבע והגנים המכיל. הדבר מבטיח כי ייזום שורש לרוחב חסום על אורך השורש כל. כדי למנוע פציעת שתילי במהלך העברה, זרועות המלקחיים המעוקלים יכולות להיות מכור תחת הפסיגים של השתיל. עם ההעברה, לוודא כי שורשי השתיל נמצאים בקשר עם מספיק הבינוני אגר המכיל NAA. זו יכולה להיות מושגת על ידי רפרוף השורש על פני אגר על פני מרחק קטן. זה יבטיח אינדוקציה מסונכרנת יעילה של ייזום שורש לרוחב על סך אורך השורש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים לדייבי אופדנקר על הסיוע הטכני והצילום. אנו מודים מאוד לד"ר אניק בלייס על הצעות מועילות לשיפור כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי התוכנית הבין-אוניברסיטאית לקטבי משיכה IUAP P7/29 'MARS' מהמשרד הפדרלי למדיניות המדע בבלגיה, על ידי G027313N המענקים של FWO ועל ידי הסוכנות לחדשנות על ידי מדע וטכנולוגיה, IWT (IR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ARABIDOPSIS LRIS
<זרעים>חזקים ארבידופסיס חזקים>
אקוטיפCol-0
<חזק>עיקור גז של זרעים
1.5 מ"לSIGMA-ALDRICH0030 125.215Eppendorf מיקרו-צינורות 3810X,
צינורות מיקרו-צנטריפוגה נקיים PCR 2 מ"לSIGMA-ALDRICH0030 120.094צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf Safe-Lock
חומצה הידרוכלוריתMerck KGaA1,003,171,00037% (אדים) לניתוח EMSURE ACS,ISO,REAG. Ph Eu
מייבש זכוכיתSIGMA-ALDRICH
פלסטיק מיקרו-צנטריפוגה צינורות קופסה או מחזיק
<חזק>אקונומיקה עיקור זרעים
אתנולChem-Lab nvCL00.0505.1000אתנול, abs. 100% a.r. מדלל ל-70%
נתרן היפוכלוריט (NaOCl)Carl Roth9062.312%
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379
מים
<חזק>מדיום גידול
תערובת מלח Murashige ו-SkoogDUCHEFA Biochemie B.V.M0221-0050
אינוזיטולSIGMA-ALDRICHI5125-100G
2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES)DUCHEFA Biochemie B.V.M1503.0100
סוכרוזVWR, Internation LLC27483.294D(+)-סוכרוז Ph. Eur.
KOHMerck KGaA1050211000כדורים לניתוח (מקסימום 0.002% Na) EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
תרבית רקמות צמחים AgarLabM LimitedMC029
<חזק>כימיקלים אינדוקציה שורש לרוחב
N-1-חומצה נפתילפתלמי (NPA)DUCHEFA Biochemie B.V.מס' N0926.025010 ומיקרו; M (Arabidopsis)
1-חומצה אצטית נפתלין (NAA)DUCHEFA Biochemie B.V.מס' N0903.005010 ומיקרו; M (Arabidopsis)
dimethylsulfoxide (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
<חזק>יצירת רשת להעברה
רשת ניילוןProsep bybaרשת ניילון סינטטית 20 ומיקרו; m
<חזק>זריעה וטיפול בשתילים
מרובעותGOSSELINBP124-0512 x 12 ס"מ
50 מ"ל צינורות דוראןSIGMA-ALDRICHCLS430304קורנינג  50 מ"ל צינורות צנטריפוגה
דריגלסקיקארל רוטK732.1
קצות פיפטה חתוכיםDaslab162001XUniversal 200, חתכו 5 מ"מ מהקצה לפני חיטוי
סרט נושם 3M Deutschland GmbHמס' 1530-1
פינצטהFiers nv/saK342.1; פינצטה K344.1דומונט מסוג A מס' 5; פינצטה דומונט סוג e מס' 7
<תנאי גידול חזקים>
חדר21 ° C, רציף קל
<חזק>חומרים<חזק>חברה<חזק>קטלוג<חזק>הערות
><חזק>תירס LRIS
<חזק>זרעים<>
חזקיםגרעיניB-73
<עיקור חזק>אקונומיקה של גרעינים זכוכית חזקה>
Fiers nv/saC267.1
נתרן היפוכלוריט (NaOCl)קארל רות'9062.312%
מים
<חזקים>כימיקלים לאינדוקציה שורש לרוחב
N-1-חומצה נפתילפתלמי (NPA)DUCHEFA Biochemie B.V.מס' N0926.025050 ומיקרו; M (שורש ראשוני של תירס), 25 ומיקרו; M (שורש תירס הרפתקני)
1-נפתלין חומצה אצטית (NAA)DUCHEFA Biochemie B.V.מס' N0903.005050 ומיקרו; M (תירס)
דימתילסולפוקסיד (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
<חזק>זריעה וטיפול בשתילים
נייר מגבות ידייםKimberly-Clark Professional*6681SCOTT מגבות ידיים - גליל / לבן; גודל גיליון (24X46 ס"מ)
נייר נביטת זרעיםחברת10 X 15 38# נייר נביטת זרעים
פינצטהFiers nv/saK342.1; פינצטה K344.1דומונט מסוג A מס' 5; פינצטה מסוג E מס' 7
צינורות 250 מ"ל (צנטריפוגה)SCHOTT DURAN2160136בקוטר של כ-5.6 ס"מ ובגובה 14.7 ס"מ 
צינורות 700 מ"לDURAN GROUP213994609צילינדרים, צינור רגל עגול, D 60  x 250
מתלהלצינורות תירס,
סטריליים
<>תנאי גידול חזקים
ארון27 ° C, אור רציף, 70% לחות יחסית
זכוכית פיירקס סטריליים תירס מערבל מגנטי  סטריליים נייר עוגן מים תוצרת בית צמיחה חזק

מקורות

  1. Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
  2. Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development. 119, 71-84 (1993).
  3. Bell, J. K., McCully, M. E. A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays. Protoplasma. 70, 179-205 (1970).
  4. Benkova, E., et al. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell. 115, 591-602 (2003).
  5. Beeckman, T., Burssens, S., Inzé, D. The peri-cell-cycle in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).
  6. Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inzé, D., Beeckman, T. Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).
  7. Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize. Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).
  8. Casimiro, I., et al. Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell. 13, 843-852 (2001).
  9. Himanen, K., et al. Transcript profiling of early lateral root initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).
  10. De Smet, I., et al. Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root. Science. 322, 594-597 (2008).
  11. Vanneste, S., et al. Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).
  12. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).
  13. Jansen, L., et al. Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize. Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).
  14. Parizot, B., et al. Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation. Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  16. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  17. Grunewald, W., Parizot, B., Inzé, D., Gheysen, G., Beeckman, T. Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms? Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).
  18. Parizot, B., Beeckman, T. Genomics of root development. Root Genomics and Soil Interactions. Crespi, M. , 3-28 (2012).
  19. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  20. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15, 583-596 (2003).
  21. Ludwig, Y., Hochholdinger, F. Laser microdissection of plant cells. Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).
  22. Beeckman, T., Engler, G. An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).
  23. Ditengou, F. A., et al. Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).
  24. Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation. J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).
  25. Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid. Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).
  26. Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings. J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).
  27. Beyer, E. M., Morgan, P. W. Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C. Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).
  28. Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells. Planta. 198, 532-541 (1996).
  29. Bailey-Serres, J. Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers. Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).
  30. Perez-Torres, C. A., et al. Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor. Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Arabidopsis thalianaZea maysNPA NAACYCB1 1
מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.