מאמר שיטה

אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

DOI:

10.3791/53513

⸱

17 באפריל 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied Life Science (BK21 plus program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, 2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את השיטות לסינון גני השליטה חדירה plasmodesmal ומכאן שיפוע אוקסין במהלך התגובה טרופית. זה כולל מדידת מידת התגובה הטרופית ב hypocotyl של ארבידופסיס thaliana ובדיקת חדירות plasmodesmal ידי טעינת חומצה 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic (HPTS) ולבסוף הערכת רמת callose.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האוקסין הורמון הצמח ממלא תפקיד חשוב בתהליכי צמיחה רבים והתפתחותית, כולל תגובות טרופיות לאור הכביד. הקמת שיפוע אוקסין היא אירוע מרכזי שמוביל פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם. בעבר, תחבורת אוקסין קוטבית (PAT) הוצגה להקים שיפוע אוקסין בתחומים סלולריים שונים של צמחים. עם זאת, האן ואח '. הראו כי לאחרונה להיווצרות שיפוע אוקסין נכונה, plasmodesmal בתיווך callose קישוריות symplasmic בין תאים סמוכים הוא גם גורם קריטי. בכתב היד הזה, את האסטרטגיה כדי להבהיר את התפקיד של גנים מסוימים, אשר יכול להשפיע פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם ידי שינוי קישוריות symplasmic באמצעות ויסות סינתזת callose plasmodesmal, נדון. הצעד הראשון הוא להקרין תגובות טרופיות סוטות מן 3 ימים בת שתילים מולבנים של מוטציות או ביטוי יתר קווים של גן יחד עם הסוג הבר. סינון ראשוני זהיכול להוביל לזיהוי של מגוון רחב של גני תפקוד PAT או שליטת קישוריות symplasmic. ההקרנה השנייה כרוכה מיון מועמדים המראים תגובות טרופיות שינו ידי המשפיע קישוריות symplasmic. כדי לטפל מועמדים כאלה, את התנועה של נותב symplasmic ואת בתצהיר של callose plasmodesmal נבדקו. אסטרטגיה זו תהיה שימושית לחקור גני מועמדים חדשים שיכול לווסת קישוריות symplasmic במישרין או בעקיפין במהלך תגובות טרופות תהליכים התפתחותיים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים, כמו אורגניזמים חיים נייחים, פתחו רשת מתוחכמת מאוד של תא אל תא איתות להתייחס לגירויים סביבתיים שונים. תגובות חוג הם אחת התופעות שבו צמחים להגיב לגירויים סביבתיים. צמחים להראות שתי תגובות טרופיות ראשיות, פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם. צמחים פוטוסינתטיים לכופף לכיוון מקור האור על ידי פוטוטרופיזם לקצור אנרגיה מקסימלית. באופן דומה, גרביטרופיזם עושה לצמחים לגדול לכיוון מרכז הכובד. המנגנון הבסיסי שמוביל תגובות טרופיות כאמורות כרוך היווצרות שיפוע סימטרית של אוקסין phytohormone 1. פעולת היווצרות שיפוע אוקסין המקומית מאופיינת היטב; הגנים המעורבים במנגנון זה לספק מפת דרכים לפעולה הורמון 2-8. העמדה הספציפית של ספקים בזרימת אוקסין, כגון קודי PIN הבנוי (PIN) ו- P-גליקופרוטאינים, מבצעת תנועת אוקסין מן הציטופלסמה אל דופן התא של תאי תורם 9,10. Furthermore, על ידי פעילות symport הפעילה H + / רשות העתיקות של ספקי זרם אוקסין, כגון AUX1 / חלבוני מש' LAX, אוקסין הועבר סוף סוף תאי המקלט הסמוך 2,11,12. התנועה של אוקסין כיוונית תופעה זו ידועה בשם תחבורה אוקסין קוטבי (PAT). PAT מוביל חלוק אוקסין הפרש במהלך שלבי התפתחות שונים בתגובה לגירויים סביבתיים שונים 13,14. יתר על כן, שיבוש בלוקליזציה או ביטוי של כל הנשאים זרם או בזרימת אוקסין אלה מוביל שינוי חמור PAT, הגורמת לשיבוש שיפוע אוקסין, שמוביל ליקויים התפתחותיים. לאחרונה, האן ואח '. גם דיווח כי תקנת plasmodesmal היא הכרחית כדי לשמור על שיפוע אוקסין 15. עד כה, יותר מ -30 חלבונים plasmodesmal זוהו 16. בין החלבונים האלה, AtGSL8 דווחה כמו אנזים המפתח לסינתזת callose ב plasmodesmata (PD) ומכאן ממלא תפקיד חיוני בשימורaining למגבלת הכללת גודל PD (SEL). ביטוי מודחק AtGSL8 הביא לדפוס שיפוע אוקסין מעוות שמוביל לשום תשובה טרופית בניגוד שתילי סוג בר 15.

בכתב היד הזה, שיטות לחקור גנים מועמדים חדשים אשר עוסקות בתקנה PD מסופקים. AtGSL8 שמש חלבון מודל כדי לבדוק שיטות אלה, כפי שהוא אנזים מפתח תורם PD ביוסינתזה callose. בשל שתיל-הקטלניות של מוטציות gsl8 נוק-אאוט 17, dexamethasone (DEX) קווי RNAi -inducible שימשו בהתאם בדו"ח שפורסם בעבר 15. האסטרטגיה הניתן כאן ניתן להתאים למסך גנים מעורבים בתגובה טרופי hypocotyl בשליטת PD SEL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנת 1. של מוטאנטים עם שפנה אל האור שינו Gravitropic תגובות

  1. כן Murashige 1x ו Skoog (MS) בינוני, pH 5.7, עם 0.8% אגרו יום אחד לפני הניסוי.
    1. להוסיף 800 מיליליטר מים מזוקקים כפולים בבקבוק 2 ליטר חרוטים ומערבבים עם פס מגנטי.
    2. להוסיף 4.4 גרם מלח MS בקבוק החרוטים.
    3. הוסף 0.5 גרם של 2- (N-Morpholino) חומצה אתאן sulphonic (MES) ומערבבים עד שכל מלחים מתמוססים לחלוטין.
    4. התאם את ה- pH של המדיום כדי 5.7 עם 1 M KOH.
    5. העבר הבינוני גליל המוני ולהביא נפח סופי 1 L עם DDH 2 O.
    6. יוצק בחזרה המדיום לתוך בקבוק 2 ליטר חרוטים ולהוסיף 8 גרם של אגר צמח.
    7. עוטפים את הפה של הבקבוק חרוטי בחוזקה עם רדיד אלומיניום.
    8. החיטוי המדיום MS ו DDH 2 O למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi, ואחרי מעוקר, לשמור המדיום באינקובטור 60 ° C ואת DDH 2 O ב RT.
    9. לאחר קירור 60 ° C, לשפוך את המדיום לתוך 125 x 125 x 20 מ"מ 3 צלחות מרובעות על ספסל זרימה למינרית (50 מיליליטר בכל צלחת).
    10. אפשר אגר כדי לחזק ב RT במשך כ 1 hr על ידי שמירה על הצלחות פתוחה חלקית. אם הצלחות אינן משמשות באופן מיידי, לאטום אותם באמצעות פלסטיק לעטוף ולאחסן ב 4 ° C במקרר.
  2. משטח לעקר את הזרעים עם תת-כלורי נתרן 1.1% ונקודה הזרעים על צלחות אגר 1x MS שהוכנו בסעיף 1.1.
    הערה: כאן, thaliana ארבידופסיס {Col-0 זרעים, dsGSL8 (Col-0)} 15 משמשים התגובה טרופי, מכתים callose וטעינה HPTS thaliana ארבידופסיס {Col-0 ו dsGSL8 (Col-0) EMS מוטציה} זרעים (. לא פורסם) משמשים תגובה טרופית באיור 2.
    1. החיטוי 300 מ"ל של DDH 2 O בבקבוק.
    2. להוסיף כמאה זרעים עבור כל רקע, כלומר,קו מוטציה / יתר ביטוי וסוג בר (Col-0) זרעים, כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    3. להוציא צלחות 1x MS אגר ממקרר 4 ° C. ולייבש אותם על ספסל זרימה למינרית בעמדה פתוחה חלקית.
    4. משטח לעקר את הזרעים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון אקונומיקה 0.2X (חומצת נתרן 1.1%) ולשמור את צינורות microcentrifuge על שייקר ב 250 סל"ד במשך 5 דקות.
    5. תנו זרעים ליישב לתחתית ידי כוח הכבידה ולאחר מכן להסיר את הפתרון אקונומיקה על ידי micropipette.
    6. הוסף 1 מ"ל של DDH טרי 2 O (autoclaved) לזרעים ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך microcentrifuge מספר פעמים. תן הזרעים להתיישב שוב ולאחר מכן להסיר את המים.
    7. חזור על שלב 1.2.6 5-6 פעמים.
    8. להוסיף הכמות כפולה של מים בהיקף של הזרעים שנשארו לאחר השטיפה הסופית.
    9. Dot הזרעים מעוקרות על צלחת אגר חצי יבשים 1x MS באמצעות קצה micropipette 1 מ"ל המכיל 200 μl של זרעים (במי cluding).
      1. שמור כ במרחק 0.1 ס"מ בין שני זרעים מינימום של 1.8 ס"מ בין שתי שורות זרע. Dot הזרעים בחמש שורות אופקיות לכל צלחת מרובע (125 x 125 x 20 מ"מ 3). אפשר המים להתייבש מעט לפני הצבת את המכסה על הצלחת.
    10. חותם את הצלחות בעזרת פלסטר, מחסנית כל הצלחות אנכית, ועוטפים בנייר אלומיניום.
    11. מעביר את הצלחות העטופות לתיבה כהה (ללא גישת אור). לאחר מכן, לשמור על התיבה הכהה במקרר 4 מעלות צלזיוס בחדר / במשך 3 ימים.
    12. החל משלב זה, לשמור על הכיוון של צלחות ללא שינוי. לאחר 3 ימים של טיפול קר, לשמור על התיבה הכהה בחדר התרבות צמח ב 22 מעלות צלזיוס במשך 3 הימים הבאים. לאחר 3 ימים, לבדוק את מצב הנביטה של ​​הזרעים תחת אור ירוק בחדר חשוך.
      הערה: בדרך כלל 3 ימים בת Col-0 שתילים מולבן יכול לגדול עד 1.6 ס"מ אורך.
  3. לנתח א שפנה אל האור שינהnd בתגובה gravitropic מוטנטים או ביטוי יתר הקווים של גן מסוים. בחר רק בגודל דומה ואנכי גדלו שתילים ישר תחת אור ירוק בחדר חשוך. עבר שתילים שנבחרו לצלחת אגרה 1x MS טרי באמצעות הקצה של קיסם מעוקר.
    1. בעדינות לבחור את השתילים מהחלק הנמוך ביותר של hypocotyl שלהם בלי לגעת בשום בחלקים אחרים. ודא כי כל יש השתילים באותו כיוון טבורית / וו, ולאחר ההעברה, כי הכיוון של ווי שתיל נשאר אותו הדבר. השתמש מינימום של 20 שתילים של כל רקע בכל שורת מינימום של שתי צלחות עבור כל נקודת זמן לניתוח נוסף.
      הערה: ארבעה מרקעים שונים ניתן להשוות בכל צלחת (4 שורות).
      אופציונלי: בעוד באמצעות dexamethasone (DEX) -inducible RNAi / יתר ביטוי שורות, להעביר את השתילים מעל ל MS 1x צלחת יחד עם צלחת + DEX MS (צלחת המכילה 1x MS, 0.8% בינוני אגר בתוספת 20 מיקרומטר DEX) FOhr r 3 ולשמור על הצלחות אנכיות בתיבה כהה.
    2. כדי לבדוק בתגובה שפנה אל האור, להעביר את הצלחות מעל אנכית כדי קופסה שחורה עם רק צד אחד נפתח. מעביר את הקופסה השחורה המכילה צלחות בתא גידול צמחים עם אור לבן חד-צדדי. כדי להבטיח אור חד צדדי, הנח את השולים צלחת לכיוון מקור האור (לא בצד הקדמי). עיין ההתקנה באיור 1.
    3. באופן דומה, כדי לבדוק את התגובה gravitropic, לשמור על צלחות עם מועברים השתילים אנכי, ומכסים ברדיד אלומיניום. לאחר מכן, לשנות את כיוון הצלחת אנכי 90 ° ולשמור אותו בתוך הקופסה השחורה מכוסה מכל הצדדים. עיין ההתקנה באיור 1.
    4. לאחר שהוחלט על נקודות זמן נתון, (בדרך כלל 1.5 שעות, 3 שעות, 6 שעות, ו -12 שעות) ולסרוק את הלוחות עם סורק, ולשמור את התמונות בפורמט JPEG.
    5. מדוד את זווית הכיפוף של שתילים באמצעות תוכנת ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (איוריור 2).
      1. הפעילו את תוכנית ImageJ על ידי לחיצה כפולה (איור 2 א).
        הערה: הכלים העיקריים ששימשו למדידת זווית מוצגים באיור 2B.
      2. לחץ על האפשרות "קובץ" ואחריו-אפשרות תת "פתוחה" בסרגל כלי ImageJ, ותמונות פתוחות שנשמרו בתבנית קובץ JPEG כדי למדוד את זווית כיפוף הטרופית (איור 2 ג).
      3. לחץ על כלי המגדלת כדי להגדיל או להקטין על התמונה על ידי לחיצה על כפתור העכבר שמאלה או ימינה, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 2B.
      4. לחץ על כלי גלילה לגרור ולמקם את התמונה (איור 2 ד) .Next, לחץ על כלי זווית כדי למדוד את זווית ההטיה (איור 2E).
        1. בצע קליק שמאלי כפול על hypocotyl המקורי נקודת כיוון גדל 'a', גרור את העכבר לנקודה ייזום כיפוף ב '(איור 2F), ולחץ התחת שמאלהעל מנת למתוח את הקו הראשון (איור 2G).
        2. גרור את העכבר מ b הצבע על 'ג' נקודת הסיום כיפוף, ולחץ על הלחצן השמאלי כדי לצייר את הקו השני (איור 2H) ויוצרים קבוע figure-protocol-1 הערת א: זווית הכיפוף האמיתית היא figure-protocol-2 B, אשר שווה 180 מעלות - figure-protocol-3 א (איור 2F).
        3. מדוד ורשום figure-protocol-4 A על ידי לחיצה 'm' במקלדת. קובץ התוצאה יפתח בנפרד כפי שמוצג באיור 2I. מדוד ורשום את כל אחד השתילים על ידי אחד. לדוגמא, ראשון למדוד את זווית כיפוף לכל hypocotyls מ Col-0 ולאחר מכן לקווי מוטציה.
    6. מעבירים את הנתונים מן ImageJ לקובץ גיליון אלקטרוני כדי להפוך את average של כיפוף זוויות של כל רקע.
    7. לניתוח כמוני, לבצע תרשים גרף עמודות עם תוצאות מבחן סטטיסטיות, כוללים ברי סטיית התקן וערכי הסתברות (ראה איור 2).
      1. חשבתי את הכיפוף הנכון figure-protocol-5 B, ולעצב נוסחה באמצעות גיליון אלקטרוני, כלומר, figure-protocol-6 B = 180 ° - figure-protocol-7 פתק: figure-protocol-8 A הוא ערך כי נגזר ניתוח ImageJ.
      2. מדוד את זווית הכיפוף הממוצעת figure-protocol-9 B עבור כל כלי גיליון אלקטרוני באמצעות הרקע (איור 2J).
      3. נתח את סטיית התקן בין משכפל לכל מדידה שימוש באפשרות "נוסחאות" גיליון אלקטרוני (איור 2J).
      4. בדוק את significance של התוצאות על ידי החלת מבחן t לזווית כיפוף הממוצע וערכים סטיית התקן המחושבת כאמור לעיל.
      5. צייר תרשים בר באמצעות הערכים הנ"ל לייצג את ההפרש הכמותי גרפי זווית הכיפוף בין שני מרקעים שונים באמצעות כלי הגיליון האלקטרוני "יבוא" (האיור 2K).
        הערה: Mutant / יתר ביטוי שורות של גני מועמדים חזקים תיראינה הבדלים ברורים ביחס סוג בר, כגון אין כיפוף, מהיר כיפוף או כיפוף איטי.

2. קווי הצמח מסך עם תגובות פגומים חוג עקב שינוי PD SEL עם רמה שבוצע בהם שינוי PD Callose

  1. בצע Assay טוען Hypocotyl ידי 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic חומצה (HPTS) טוען דיי על החלק העליון של שתילים עם HPTS Agarose בלוקים השווה את התנועה של דיי בין Mutant / Over-ביטוי קווים Col-0.
    1. כן HPTS agarose בלוקים עבור assay טעינת hypocotyl.
      1. קח 10 מ"ל של DDH 2 O בבקבוק 50 מ"ל חרוטי ולהוסיף 0.1 גרם של agarose להכין ג'ל agarose 1%. מרתיחים את agarose במיקרוגל במשך 1-2 דקות עם רעד לסירוגין, ולאפשר לו להתקרר במשך 5 דקות.
      2. הוסף 50 מ"ג של HPTS עד 10 מ"ל של תמיסת 1% agarose, ומערבבים היטב עד הפתרון הופך ירוק.
      3. יוצקים את התערובת מעל לצלחת 10 מ"מ פטרי, ולאפשר לו לחזק במשך 15 דקות.
      4. חותכים את HPTS הקרושה agarose עם להב לנתיחה חדה לעשות בלוקים agarose קטן (0.5 x 2 ס"מ 2).
    2. הכינו דגימות צמח עבור assay צבען טעינת HPTS.
      1. גדר פלטפורמה עבור assay צבע טעינת HPTS; המקום שקופיות כיסוי מיקרוסקופ (24 x 50 מ"מ 2) על צלחת מדיום חדש MS כפי שמוצג באיור 3 א.
      2. בלו 3 שתילים מולבנים בן יום מהבסיס של הקרס באמצעות מספריים כירורגית חדים.
      3. מידלהעביר את השתילים לעיל (מינימום של 5 שתילים מכל רקע) אל פני השטח של זכוכית מכסה מיקרוסקופית בצורה כזאת שרק 0.5 סנטימטר של hypocotyl מעמדת הכריתה צריך להישאר בשקופית לכסות, ואת שאר hypocotyl צריך לגעת המדיום כפי שמוצג באיור 3 ב.
      4. מניח את גוש agarose HPTS על גבי hypocotyl (עם וו ניכר) במשך 5 דקות בצורה כזו כי האזור הניכר נוגע לחסום agarose HPTS.
      5. אחרי 5 דקות של טעינה, מסירה את החסימה agarose מפני השטח hypocotyl, להעביר את hypocotyls אל צלחת 10 מ"מ פטרי המכילה DDH 2 O לשטוף hypocotyls DDH 2 O למשך 15 דקות עם רעד מתמשך.
    3. הכינו דגימות למיקרוסקופיה Confocal.
      1. יש לבחור לפחות 5 שתילים מכל רקע להסתכלות במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.
      2. באפיק הליזר, להגדיר את אורך הגל 488 ננומטר עבור EXC הספציפיitation ו -500 כדי 550 ננומטר עבור פליטת הלהקה עוברים.
      3. שתילי העברה 2 סטים (אחד Col-0 + אחד מוטנטי) לשקופית מיקרוסקופית חדשה לאחר שטיפה עם DDH 2 O. הוסף 100-150 μl של מים מזוקקים פעמיים לשקופית, ומכסים שקופיות כיסוי. Shift השקופית לשלב של המיקרוסקופ confocal.
      4. פוקוס באזור hypocotyl (עם עדשה אובייקטיבי 20X או 40X) באמצעות תאורה שדה בהיר (אור לבן). לאחר מכן, לסרוק את השקופיות עבור פלואורסצנטי.
      5. קח תמונות למשך תקופה מינימלית של 10 סטים, להשוות בין שני הרקעים על ידי בדיקת היקף התנועה לצבוע מנקודת הטעינה.
        הערה: Mutant / יתר ביטוי קווים עם תנועת symplasmic שינתה ייראו דפוסים שונים של צבע טעינה לעומת סוג בר Col-0.
  2. נתח את רמת Callose ב Mutant / קווי יתר ביטוי מציג שפנה אל אור שיניתי Gravitropic ענות מציג הברור HPTS דיי תנועת compared עם הקולונל-0.
    1. הכן לצבוע מכתים callose כחול אנילין.
      1. הפוך 1 M גליצין, pH 9.5 ו -0.1% (W / V) כחול אנילין ב autoclaved DDH 2 O.
      2. הפוך את החיץ מכתים ידי ערבוב כחול 0.1% אנילין ו -1 M גליצין ב 2: 3 יחס נפח. לדוגמה, עבור 50 מ"ל של חיץ מכתים, לקחת 20 מ"ל של אנילין 0.1% כחול 30 מ"ל של 1 M גליצין. הערה: הפוך את מכתים חיץ מינימום של 48 שעות לפני השימוש ולאחסן אותו בחושך.
    2. כתם bended או שאינו bended שתילים עם צבע כחול callose הספציפי אנילין.
      1. כדי לעכב את דה נובו callose סינתזה במהלך תהליך מכתים, מוסיפים את נפח סופי של 1.5 מ"מ 2-deoxy-D- גלוקוז (DDG) 50 מ"ל של חיץ מכתים.
      2. קח שתילים מולבנים בן 3 ימים עבור מכתים callose (עם או בלי תגובה טרופית).
      3. חותך את השתילים מאזור הוו שלהם באמצעות מספרי כירורגיות דקים.
      4. מעבירים את השתילים בצלחת קטנה פטרי המכילותing 2 מ"ל של חיץ מכתים באמצעות קצה של קיסם.
      5. דגירה את השתילים עם חיץ מכתים בחושך במשך שעה 2 עם רעד מתמשך ב 30 סל"ד.
      6. לאחר מכתים, לשטוף את השתילים עם DDH 2 O למשך 2 דקות כדי להסיר חיץ מכתים עודף.
      7. יש לבחור לפחות 5 שתילים לכל רקע צמח להסתכלות במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.
    3. הכינו דגימות במיקרוסקופ confocal:
      1. מעבירים את השתילים סט (אחד Col-0 + אחד מוטנטי) לניקוי שקופיות מיקרוסקופ לאחר שטיפה עם DDH 2 O.
      2. הוסף 100-150 μl של DDH 2 O ומכסים שקופית כיסוי. Shift השקופית לשלב של המיקרוסקופ confocal.
      3. בשנת ערוץ ליזר, להגדיר את אורך הגל 405 ננומטר עבור עירור ספציפי ו -500 עד 550 ננומטר פליטה עבור ההדמיה של קרינה הכחולה אנילין.
      4. לדרדר את האזור hypocotyl אל המוקד, הראשון עם 10X ומאוחרr עם עדשות אובייקטיבי 20X או 40X באמצעות בהיר שדה (אור לבן) תאורה.
      5. לאחר מכן, לעבור על אור מסונן, לסרוק את השקופיות עבור קרינה, ולשמור את התמונות.
      6. מדוד את עוצמת אות callose עם תוכנת ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (ראה איור 4).
        1. לשנות את הפורמט של תמונות מיקרוסקופיה confocal מהתבנית בינארי תמונת אולימפוס (* .oib) לפורמט קובץ JPEG. הערה: רק בפורמט JPEG נתמך על ידי תוכנת ImageJ.
        2. הפעילו את תוכנית ImageJ על ידי לחיצה כפולה (איור 4 א). הערה: החצים מצביעים על כלי מלבן לשמש למדידת עוצמת callose (איור 4B).
        3. לחץ על האפשרות "קובץ" ואחריו-האפשרות תת "הפתוחה" בסרגל כלי ImageJ, ותמונות מיקרוסקופיה פתוחות שנשמרו בפורמט קובץ JPEG כדי למדוד את עוצמת callose (האיור 4C).
        4. לחץ על הסמל המלבני על האמאסרגל הכלים GEJ (איור 4D).
        5. כדי לנתח את עוצמת האות, וגרור את הסמן מעל התמונה ובחר את האזור להיבדק (איור 4E)
        6. מדוד ורשום את הערכים המספריים עבור עוצמת האות על ידי לחיצה על 'M' במקלדת (איור 4E). הערה: קובץ התוצאה יפתח בנפרד (איור 4F).
        7. מדוד ורשום את עוצמת ערכים אחד אחד עבור כל השתילים מכל רקע צמח.
          הערה: ב ImageJ, קובץ התוצאה "Mean" מציין את עוצמת האות של "השטח" שנבחר.
      7. העתק את הערכים הממוצעים מקובץ תוצאה ImageJ, ולהדביק בקובץ הגיליון על ניתוח כמותי.
      8. לניתוח כמותי, לבצע תרשים גרף עמודות עם מבחנים סטטיסטיים, כולל ברים סטיית התקן וערכי הסתברות (איור 4).
        1. מדוד את עוצמת האות הממוצעת(זאת אומרת, לפי ImageJ) עבור כל רקע שימוש באפשרות "נוסחאות" גיליון אלקטרוני (איור 4G).
        2. נתח את סטיית התקן בין משכפל לכל מדידה שימוש באפשרות "נוסחאות" גיליון אלקטרוני (איור 4G).
        3. חשב את סטיית התקן (SE) באמצעות thespreadsheet באפשרות "נוסחאות".
          הערה: s = SE / √ n, שם (ים) הוא סטיית התקן של האוכלוסייה, ו (n) הוא בגודל (מספר התצפיות) של המדגם.
        4. בדוק את המשמעות של התוצאות על ידי החלת מבחן t לעוצמת האות הממוצעת וערכי סטיית התקן מחושבים כאמור לעיל.
        5. צייר תרשים גרף עמודות באמצעות הערכים הנ"ל לייצג את ההפרש הכמותי גרפי ברמת callose בין שני מרקעים שונים באמצעות כלי הגיליון האלקטרוני "יבוא" (האיור 4H).
          הערה: Mutant / יתר ביטוי שורות של מועמדים חזקים יהיה יםכמה שונה רמות של callose לעומת סוג בר, כגון לא callose, callose מעט או הצטברות callose PD hyper.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת ההגדרה הנוכחית, dexamethasone (DEX) קווי RNAi -inducible של AtGSL8 [להלן dsGSL8 (+ DEX / -dex)] שימשו, כמו מוטציות הכניסה הומוזיגוטים gsl8 T-DNA הם שתיל 18 קטלני. שלושה ימים בת שתילים מולבנים של dsGSL8 ושתילי סוג ברים עם DEX ± נחשפו לגירויים שפנה אל אור ואת gravitropic. מצאנו כי dsGSL8 (+ DEX) שתילים היו פגומים ב פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם 15. איור 5 מראה בבירור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב היד הזה, אסטרטגיה להקרין מוטציה / יתר ביטוי קווים פגומים בתגובות שפנה אל אור ואת gravitropic בשל callose PD שינה, ומכאן, פ"ד SEL מתואר בפירוט. סינתזה השפלה callose PD מושגת בעיקר על ידי synthases callose ו β-1,3-Glucanases, אבל הרגולציה של אנזימים אלה נשלטת על ידי גורמים רבים במעלה הזרם. כדי לחפש את הגורמים או מועמדים במעלה כגון אשר מעורבים באופן ישיר בתקנה PD, הקמנו שיטה זו להקרנה. זה להגדיר יש מספר מגבלות כמו מוטציות של כמה אנזימים מפתח בוויסות ביוסינתזה PD callose

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים לא וגילויים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF-2015R1A2A1A10053576), ועל ידי מענק מטעם התוכנית הדור הבא BioGreen 21 (SSAC, להעניק PJ01137901), מינהל ופיתוח הכפר, הרפובליקה של קוריאה. RK, WS, ABB ו DK נתמכו המוח קוריאה 21 תוכנית פלוס (BK21 +).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HPTS (8-הידרוקסיפירן -1,3,6-חומצה טריסולפונית מלח טריסודיום)SigmaH1529-1Gצבע פלואורסצנטי כעוקב סימפלזמי
LE אגרוזדונגין-גנומיGEL001-500Gמשמש עבור HPTS agarose בלוק
תנור מיקרוגלמכונת LG-Goldstarלרתיחת ג'ל אגרוז
100 מ"ל בקבוק חרוטי זכוכיתדונג קוואנגA0205משמש להרתחת HPTS agarose צלחת פטרי ג'ל
(35 מ"מ x 10 מ"מ)SPL מדעי החייםSPL10035משמש לייצור בלוקים של אגרוז HPTS ושטיפת דגימות צמחים 
שקופיות כיסוי מיקרוסקופ ושקופיות זכוכית (24 מ"מ x 50 מ"מ)101222 כלי זכוכית מעבדה של מרינפלדמשמש לבלוקים של HPTS אגרוז והכנת דגימות מיקרוסקופיות
צלחות בינוניות MS 125 מ"מ x 125 מ"מ x 20 מ"מSPL מדעי החייםSPL11125צלחות לייצור מספריים בינוניות MS אגר
גרמניה נירוסטהHSB 942-11משמש לבלו אזור וו של דגימות צמחים
תערובת מלח בסיסי Murashige ו- Skoog (MS)DuchefaP10453.01MS בינוני כולל ויטמינים.
(N-מורפולינו) חומצה אתנסולפונית (MES) מונוהידראטBioshop3G30212לייצור מדיה של טרשת נפוצה.
צמחים אגרDuchefaP1001.1000למיצוק מדיה MS.
AutoclaveALPCL-40L
ShakerWise MixSHO-1Dכדי לשטוף את מאגר הצביעה הכחול אנילין וצבע HPTS בצורה רגועה.
1 מ"ל טיפים כחוליםSorenson10040
1 מ"ל פיפטהBioPetteL-1101-2
סרט כירורגיMIcropore1530-0לאיטום צלחת
MS כחול אנילין (כחול מתיל)SigmaM5528-25Gמשמש להכנת מאגר צביעה כחול אנילין.
גליציןביושופGLN001משמש להכנת מאגר צביעה כחול אנילין.
DDGSigmaD8375-1Gמשמש לעיכוב סינתאזות קלוז.
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסFV1000MPE SIMכדי לבדוק צביעה כחולה אנילין ותוצאת טעינת צבע HPTS.
בוחש אני מעבדה K400לערבב פתרון מדיה.
רדיד אלומיניוםרדיד בישוללעטוף צלחות במצב חשוך.
נתרן היפוכלוריטתעשייתלזרעים מעוקרים על פני השטח
SW סמג'ין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).
  2. Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
  3. Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
  4. Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
  5. Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
  6. Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
  7. Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
  8. Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883(2006).
  9. Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
  10. Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
  11. Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
  12. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  13. Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
  14. Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
  15. Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
  16. Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
  17. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPTSArabidopsis

מאמרים קשורים