מאמר זה מתאר את השיטות לסינון גני השליטה חדירה plasmodesmal ומכאן שיפוע אוקסין במהלך התגובה טרופית. זה כולל מדידת מידת התגובה הטרופית ב hypocotyl של ארבידופסיס thaliana ובדיקת חדירות plasmodesmal ידי טעינת חומצה 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic (HPTS) ולבסוף הערכת רמת callose.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
האוקסין הורמון הצמח ממלא תפקיד חשוב בתהליכי צמיחה רבים והתפתחותית, כולל תגובות טרופיות לאור הכביד. הקמת שיפוע אוקסין היא אירוע מרכזי שמוביל פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם. בעבר, תחבורת אוקסין קוטבית (PAT) הוצגה להקים שיפוע אוקסין בתחומים סלולריים שונים של צמחים. עם זאת, האן ואח '. הראו כי לאחרונה להיווצרות שיפוע אוקסין נכונה, plasmodesmal בתיווך callose קישוריות symplasmic בין תאים סמוכים הוא גם גורם קריטי. בכתב היד הזה, את האסטרטגיה כדי להבהיר את התפקיד של גנים מסוימים, אשר יכול להשפיע פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם ידי שינוי קישוריות symplasmic באמצעות ויסות סינתזת callose plasmodesmal, נדון. הצעד הראשון הוא להקרין תגובות טרופיות סוטות מן 3 ימים בת שתילים מולבנים של מוטציות או ביטוי יתר קווים של גן יחד עם הסוג הבר. סינון ראשוני זהיכול להוביל לזיהוי של מגוון רחב של גני תפקוד PAT או שליטת קישוריות symplasmic. ההקרנה השנייה כרוכה מיון מועמדים המראים תגובות טרופיות שינו ידי המשפיע קישוריות symplasmic. כדי לטפל מועמדים כאלה, את התנועה של נותב symplasmic ואת בתצהיר של callose plasmodesmal נבדקו. אסטרטגיה זו תהיה שימושית לחקור גני מועמדים חדשים שיכול לווסת קישוריות symplasmic במישרין או בעקיפין במהלך תגובות טרופות תהליכים התפתחותיים אחרים.
מבוא
צמחים, כמו אורגניזמים חיים נייחים, פתחו רשת מתוחכמת מאוד של תא אל תא איתות להתייחס לגירויים סביבתיים שונים. תגובות חוג הם אחת התופעות שבו צמחים להגיב לגירויים סביבתיים. צמחים להראות שתי תגובות טרופיות ראשיות, פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם. צמחים פוטוסינתטיים לכופף לכיוון מקור האור על ידי פוטוטרופיזם לקצור אנרגיה מקסימלית. באופן דומה, גרביטרופיזם עושה לצמחים לגדול לכיוון מרכז הכובד. המנגנון הבסיסי שמוביל תגובות טרופיות כאמורות כרוך היווצרות שיפוע סימטרית של אוקסין phytohormone 1. פעולת היווצרות שיפוע אוקסין המקומית מאופיינת היטב; הגנים המעורבים במנגנון זה לספק מפת דרכים לפעולה הורמון 2-8. העמדה הספציפית של ספקי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הקרנת 1. של מוטאנטים עם שפנה אל האור שינו Gravitropic תגובות
- כן Murashige 1x ו Skoog (MS) בינוני, pH 5.7, עם 0.8% אגרו יום אחד לפני הניסוי.
- להוסיף 800 מיליליטר מים מזוקקים כפולים בבקבוק 2 ליטר חרוטים ומערבבים עם פס מגנטי.
- להוסיף 4.4 גרם מלח MS בקבוק החרוטים.
- הוסף 0.5 גרם של 2- (N-Morpholino) חומצה אתאן sulphonic (MES) ומערבבים עד שכל מלחים מתמוססים לחלו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בשנת ההגדרה הנוכחית, dexamethasone (DEX) קווי RNAi -inducible של AtGSL8 [להלן dsGSL8 (+ DEX / -dex)] שימשו, כמו מוטציות הכניסה הומוזיגוטים gsl8 T-DNA הם שתיל 18 קטלני. שלושה ימים בת שתילים מולבנים של dsGSL8 ושתילי סוג ברים עם DEX ± נחשפו לגירויים שפנה אל אור ואת gravitropic. מצאנו כי dsGSL8 (+ DEX) שתילים היו פגומים ב פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם 15. איור 5 מראה בבירור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בכתב היד הזה, אסטרטגיה להקרין מוטציה / יתר ביטוי קווים פגומים בתגובות שפנה אל אור ואת gravitropic בשל callose PD שינה, ומכאן, פ"ד SEL מתואר בפירוט. סינתזה השפלה callose PD מושגת בעיקר על ידי synthases callose ו β-1,3-Glucanases, אבל הרגולציה של אנזימים אלה נשלטת על ידי גורמים רבים במעלה הזרם. כדי לחפש את הגורמים או מועמדים במעלה כגון אשר מעורבים באופן ישיר בתקנה PD, הקמנו שיטה זו להקרנה. זה להגדיר יש מספר מגבלות כמו מוטציות של כמה אנזימים מפתח בוויסות ביוסינתזה PD callose
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים לא וגילויים.
תודות
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF-2015R1A2A1A10053576), ועל ידי מענק מטעם התוכנית הדור הבא BioGreen 21 (SSAC, להעניק PJ01137901), מינהל ופיתוח הכפר, הרפובליקה של קוריאה. RK, WS, ABB ו DK נתמכו המוח קוריאה 21 תוכנית פלוס (BK21 +).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| HPTS (8-הידרוקסיפירן -1,3,6-חומצה טריסולפונית מלח טריסודיום) | Sigma | H1529-1G | צבע פלואורסצנטי כעוקב סימפלזמי |
| LE אגרוז | דונגין-גנומי | GEL001-500G | משמש עבור HPTS agarose בלוק |
| תנור מיקרוגל | מכונת LG-Goldstar | לרתיחת ג'ל אגרוז | |
| 100 מ"ל בקבוק חרוטי זכוכית | דונג קוואנג | A0205 | משמש להרתחת HPTS agarose צלחת פטרי ג'ל |
| (35 מ"מ x 10 מ"מ) | SPL מדעי החיים | SPL10035 | משמש לייצור בלוקים של אגרוז HPTS ושטיפת דגימות צמחים |
| שקופיות כיסוי מיקרוסקופ ושקופיות זכוכית (24 מ"מ x 50 מ"מ) | 101222 כלי זכוכית מעבדה של מרינפלד | משמש לבלוקים של HPTS אגרוז והכנת דגימות מיקרוסקופיות | |
| צלחות בינוניות MS 125 מ"מ x 125 מ"מ x 20 מ"מ | SPL מדעי החיים | SPL11125 | צלחות לייצור מספריים בינוניות MS אגר |
| גרמניה נירוסטה | HSB 942-11 | משמש לבלו אזור וו של דגימות צמחים | |
| תערובת מלח בסיסי Murashige ו- Skoog (MS) | Duchefa | P10453.01 | MS בינוני כולל ויטמינים. |
| (N-מורפולינו) חומצה אתנסולפונית (MES) מונוהידראט | Bioshop | 3G30212 | לייצור מדיה של טרשת נפוצה. |
| צמחים אגר | Duchefa | P1001.1000 | למיצוק מדיה MS. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | כדי לשטוף את מאגר הצביעה הכחול אנילין וצבע HPTS בצורה רגועה. |
| 1 מ"ל טיפים כחולים | Sorenson | 10040 | |
| 1 מ"ל פיפטה | BioPette | L-1101-2 | |
| סרט כירורגי | MIcropore | 1530-0 | לאיטום צלחת |
| MS כחול אנילין (כחול מתיל) | Sigma | M5528-25G | משמש להכנת מאגר צביעה כחול אנילין. |
| גליצין | ביושופ | GLN001 | משמש להכנת מאגר צביעה כחול אנילין. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | משמש לעיכוב סינתאזות קלוז. |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס | FV1000MPE SIM | כדי לבדוק צביעה כחולה אנילין ותוצאת טעינת צבע HPTS. |
| בוחש | אני מעבדה | K400 | לערבב פתרון מדיה. |
| רדיד אלומיניום | רדיד בישול | לעטוף צלחות במצב חשוך. | |
| נתרן היפוכלוריט | תעשיית | לזרעים מעוקרים על פני השטח |
מקורות
- Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christe....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
