הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן

26.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

31 בדצמבר 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבניית מודל תלת מימדי במבחנה של רירית חלל הצפק, המורכב מתאי מזותל אנושיים ראשוניים ופיברובלסטים בשכבות עם מטריצה חוץ-תאית, ככלי לחקירת הדבקה, פלישה והתפשטות של תאי סרטן השחלות.

תקציר

דפוס הגרורות של סרטן השחלות שונה באופן ניכר מזה של רוב גידולי האפיתל האחרים, מכיוון שהוא מתפשט לעתים רחוקות באופן המטוגני. במקום זאת, תאי סרטן השחלות שעברו פילינג מהגידול הראשוני נישאים על ידי נוזל הצפק לאתרים גרורתיים בתוך חלל הצפק. אתרים אלה, בעיקר הצפק הבטני והאומנטום, הם איברים המכוסים במשטח מרופד במזותל. כדי לחקור את תהליכי התפשטות סרטן השחלות, הרכבנו מערכת תרבית תלת מימדית מורכבת המשחזרת את רירית חלל הצפק במבחנה. פיברובלסטים אנושיים ראשוניים ותאי מזותל בודדו מאומנטום אנושי. לאחר מכן עורבבו הפיברובלסטים עם מטריצה חוץ-תאית וכוסו בשכבה של תאי המזותל האנושיים הראשוניים כדי לחקות את משטחי הצפק והאומנטל שבהם נתקלים תאי סרטן השחלות השולחים גרורות. המודל האורגנוטיפי המתקבל משמש, כפי שהוצג, לבחינת השלבים המוקדמים של התפשטות סרטן השחלות, כולל הידבקות של תאי סרטן, פלישה והתפשטות. מודל זה שימש במספר מחקרים כדי לחקור את תפקיד המיקרו-סביבה (תאית ותאית) בהפצת סרטן השחלות המוקדם. הוא גם הותאם בהצלחה לבדיקות סקר בתפוקה גבוהה ושימש לזיהוי ובדיקה של מעכבים של גרורות סרטן השחלות.

מבוא

סרטן השחלות הוא הגידול הגינקולוגי הקטלני ביותר1. רוב החולים מאובחנים לאחר שהסרטן התפשט בכל חלל הצפק. לאחר שהסרטן התפשט בכל חלל הצפק, ניתוחים ציטורדקטיים וכימותרפיה לרוב אינם טיפול מספיק כדי למנוע הישנות סרטן ועמידות לכימותרפיה, וכתוצאה מכך שיעור הישרדות של פחות מ-30% ל-5 שנים. גרורות סרטן השחלות מוגבלות בעיקר לחלל הצפק, ומספר סוגי סרטן אחרים, כולל סרטן הקיבה, הלבלב והמעי הגס, שולחים גרורות לאותם אתרים אנטומיים בחלל הצפק. באופן כללי, תאי סרטן השחלות מתנתקים מהקרצינומה באתרה בחצוצרה או בגידול השחלות הראשוני, נעים בנוזל הצפק כתאים בודדים או ספרואידים, ונצמדים למשטחים מרופדים במזותל של האומנטום, המעי ודופן הבטן2.

המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות המחלה ובעמידות לכימותרפיה בסוגי סרטן רבים3-6. חלל הצפק הוא מיקרו-סביבה ייחודית, עם חד-שכבת תא מזותל המכסה את רוב המשטחים (איור 1A)7. רירית המזותל פועלת כמחסום היוצר משטח בעל חיכוך נמוך, הנוטה להגן מפני הידבקות תאים סרטניים8. מיד מתחת למשטח מרופד במזותל זה נמצאת שכבה העשויה בעיקר מפיברובלסטים ומטריצה חוץ-תאית (ECM), המקדמים הידבקות ופלישה של תאים סרטניים8. תאי סרטן השחלות מפרישים גורמים הגורמים לשינויים ברירית תאי המזותל המשפרים את ההידבקות, הפלישה והגרורות של תאי סרטן השחלות9,10. תאי סרטן השחלות נצמדים למשטח המזותל באמצעות מנגנונים בתיווך אינטגרין ו-CD44 (איור 1B)11-16.

מבחינה היסטורית, פותחו מספר מודלים תלת-ממדיים כדי לחקור אינטראקציות של סרטן השחלות עם המיקרו-סביבה. חלק מהמודלים הראשונים חקרו ממשק סרטן השחלות-ECM17-21, תקשורת בין סרטן השחלות לתאי מזותל13,14,21-24, או שניהם25 (נסקר על ידינו 26). Niedbala et al. גילה שתאי סרטן השחלות מציגים הידבקות מהירה ומוצקה יותר ל-ECM מאשר לתאי מזותל או לפלסטיק בלבד25. עם זאת, מודלים אלה לא דמו מבחינה היסטולוגית למיקרו-סביבה הצפקית. לכן, הקמנו מודל אורגנוטיפי תלת מימדי כדי לשכפל בצורה יסודית יותר את המיקרו-סביבה של סרטן השחלות. על מנת להבין טוב יותר את תפקיד המיקרו-סביבה ואת האינטראקציה בין תאי סרטן ותאי צפק, פיתחנו מודל תלת מימדי של תרבית אורגנוטיפית במבחנה של רירית חלל הצפק (סכמטי באיור 1C). המודל המוצע מורכב מפיברובלסטים אנושיים ראשוניים ו-ECM, מכוסים בשכבה של תאי מזותל אנושיים ראשוניים - כל סוג תא מבודד מאומנטום אנושי. מבחינה היסטולוגית, מודל זה דומה לרירית הצפק או האומנטלית הרגילה, ומספק משטח שעליו אנו יכולים לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול, את האינטראקציה בין תאים סרטניים לרקמה תקינה, ואת תהליכי ההדבקה, הפלישה וההתפשטות של תאי סרטן8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי המחקר המתוארים נבדקו על ידי אוניברסיטת שיקגו Institutional Review Board (IRB). הסכמה מדעת שהתקבלה מכל מטופל לפני הניתוח והמחקר אושר על ידי אוניברסיטת שיקגו IRB. יש להשתמש בסוג בטיחות ביולוגית קבינט 2 וכפפות בעת טיפול רקמות אנושיות להגנה וכדי להפחית את הסיכון של זיהום תאים.

1. בידוד והתרבות של תאי סטרומה לא הותמר הראשיים

  1. אוסף אדם רקמה והכנה.
    1. להשיג דגימות של omentum האנושי, 2 סנטימטר 3, הוסר במהלך ניתוח בבטן, ולטבול מייד רקמה מלוחים RT-פוספט (PBS) (איור 2 א). חתיכת omentum 3 סנטימטרים X 2 סנטימטר בדרך כלל מניבה 1 מיליון תאים ראשוניים אדם mesothelial (HPMC) ו200,000 fibroblasts אדם ראשוני או fibroblasts הנורמלי omental (נוף).
    2. ספין למטה PBS הרקמה הייתה שקועה ברמה של 0.5 XG במשך 3דקות בהקדם האפשרי לאחר איסוף (<2 שעות בPBS) ולהעביר את הרקמה עד 20 מיליליטר PBS הטרי בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לחתוך את הרקמה לתוך 3 חתיכות 5 מ"מ על ידי מיותר עם ​​אזמלים בקוטר 15 סנטימטר, צלחת תרבות סטרילי (איור 2).
  2. בידוד תא mesothelial האנושי ראשוני 8
    1. כדי לבודד HPMC, להעביר את הרקמות טחונות לתוך צינורות חרוטי 50 מיליליטר ולחכות 1 דקות לחתיכות מוצקות ללצוף למעלה (איור 2 ג & D). HPMC ותאי דם אדומים (RBC) יהיו נוכחים בנוזל שבתחתית. השתמש pipet כדי להסיר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור ולתוך צינור חרוטי חדש. ספין הנוזל מטה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות ולשאוב supernatant מגלולת HPMC / RBC.
      1. חזור על התהליך שלוש פעמים: להוסיף 20 מיליליטר PBS לרקמות טחונות, לאפשר רקמה לעלות, להסיר נוזל מהתחתית עם טפטפת ולתוך צינור HPMC / RBC, ספין למטה, ולהסיר אתsupernatant. אחרי הכל הספינים הושלמו וsupernatant הוא aspirated, גלולה תכיל HPMC וRBC.
    2. צלחת כל התאים מהגלולה לבקבוק 2 75 סנטימטר ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה (DMEM עם סרום 10% שור עוברי [FBS], ויטמיני ממ 1% [93 מ"ג / ליטר], חומצות אמינו החיוני ממ 1% [81.4 מ"ג / ליטר], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]).
    3. בצע לשטוף PBS משניים לבודד HPMCs נוסף.
      1. לPBS המשני לשטוף, לנער את הרקמה המוצקה שנותרה על 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן לחכות 1 דקות לרקמות ללצוף למעלה. הסר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור לתוך צינור חדש, צנטריפוגות ב 0.5 XG במשך 3 דקות, ולשאוב supernatant.
      2. פלייט כל HPMC / RBC מPBS המשני לשטוף בבקבוק 2 75 סנטימטר נפרד ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
    4. כדי לבודד כל remaining HPMC, לנער את הרקמות טחונות ב 200 סל"ד, 37 ° מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20 מיליליטר של 1: 1 0.25% טריפסין EDTA 25 מ"מ: פתרון PBS לפי נפח. לאפשר לרקמות לעלות, לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור לתוך צינור 50 מיליליטר חדש, וספין למטה ברמה של 0.5 GX 3 דקות.
      1. לשאוב supernatant וצלחת כל HPMC / RBC בבקבוק 2 75 סנטימטר נפרד ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
    5. תרבות התאים המצופה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בסביבה humidified. תאי הזנה מצופים על ידי הוספת 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה בימים 3 ו -5 מבלי להסיר את התקשורת בילתה. HPMC יכול להיות מתורבת במשך 5-7 ימים לפני הפיצול.
      1. השתמש HPMC נמוך מעבר (עד למעבר 2) בכל הניסויים כדי למזער dedifferentiation ושינוי של פנוטיפ המקורי. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב רצוי עם מטרת 20x עם יכולות ההפרש פלסטיק ניגוד להפרעה או אובייקטיבי 4-20x עם capabilitie ניגוד שלבs (מסנני שלב ניגוד למיקרוסקופ) לקחת את כל התמונות של תאים, ומטרת 10x () בשדה בהיר לנתח immunohistochemical 3,3' diaminobenzidine מכתים (DAB).
    6. ודא שHPMC הוא cuboidal ולהביע cytokeratin 8 וvimentin על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה 8 (איור 3 א, ג, ה).
  3. בידוד NOF 8
    1. הכן 10 מיליליטר של המניה של פתרון מסוג collagenase III (10x) על ידי שילוב של 1: 1 תערובת של 100x פן-דלקת: 1 פעילות יחידות 1500 / מיליליטר של סוג collagenase השלישי: פעילות 714 יחידות / מיליליטר של hyaluronidase ב PBS.
    2. לנער את הרקמות טחונות omentum שנותרו לאחר בידוד HPMC ב 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ב 10 מיליליטר של הפתרון מסוג 10x collagenase III המדולל בסרום ללא מדיה (DMEM עם ויטמיני 1% ממ [93 מ"ג / ליטר], חומצות 1% ממ אמינו החיוני [81.4 מ"ג / L], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין והמ"ל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]). רקמה מתעכל תיראה אטומה ואולי קצת פסולת סיבית (איור 2E).
    3. צנטריפוגה תאי NOF התמיסה המכילה בהשעיה על 0.5 XG במשך 3 דקות ב RT, לשאוב supernatant וצלחת גלולה בבקבוק 2 75 סנטימטר ב -13 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
    4. הסר המדיה ישנה ולהחליף עם 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה הטרי לאחר 24 שעות. NOF יכול להיות מתורבת ל1-3 ימים לפני הפיצול. התפשטות הערה של NOF תחדל כאשר התאים מגיעים confluency.
    5. ודא שfibroblasts האדם העיקרי הם תאים שטוחים, מוארכים ולהביע vimentin אבל לא cytokeratin 8 על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה 8 (איור 3, D, F). השתמש NOF נמוך מעבר לניסויים (באופן אידיאלי לפני המעבר 3) כדי למזער dedifferentiation ושינוי של פנוטיפ המקורי. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב עם מטרת 20x עם יכולות דסק"ש פלסטיק ללוקח את כל תמונות השלב של תאים,ומטרת 10x בשדה בהיר לנתח צביעת DAB immunohistochemical.

2. ציפוי Organotypic תרבות 8

  1. NOF שחרור מהבקבוק תרבות 75 סנטימטרים על ידי שטיפה עם 10 מיליליטר של PBS ואחרי 3 מיליליטר של 0.25% טריפסין / 25 מ"מ EDTA ללא יותר מ 5 דקות. לנטרל טריפסין עם לפחות 3 פעמים את נפח תקשורת צמיחה מלאה.
  2. העבר את תאי trypsinized לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומסובב את ברמה של 0.5 GX 3 דקות. הסר supernatant ולהביא תאים לגבות ב 5 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה. השתמש בדלפק תא לספור את התאים התאוששו מהבקבוק התרבות.
  3. לדלל תאים בנפח המתאים של תקשורת צמיחה מלאה לצלחת 2,000-4,000 NOF לכל 100 μl על צלחת שחורה, עם תחתית ברורה, 96-היטב. להוסיף 0.5 מיקרוגרם / μl 100 של קולגן אני עכברוש זנב לתערובת התא לפני ציפוי. בואו תאים לשבת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבה humidified לפחות 4 שעות, או עד שהתאיםלדבוק במשטח הצלחת.
  4. שחרר HPMC מהבקבוק התרבות משתמש באותן שיטות שתוארו בשלבי 2.1 ו -2.2. לדלל תאים בכמות המתאימה של תקשורת צמיחה מלאה לצלחת 10,000-20,000 HPMC לכל 50 μl על גבי NOF כבר מצופה קולגן אני ב96-גם צלחות. בואו התאים לשבת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבה humidified לפחות 18 שעות לפני תחילת ניסויים.
  5. חלבון תרבות ירוק ניאון (GFP) -expressing תאי סרטן השחלות HeyA8 בתקשורת צמיחה מלאה. תאי סרטן השחלות HeyA8 שכותרתו fluorescently ידי ביטוי של וקטור lentiviral להביע טרגליים cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). תאי סרטן השחלות HeyA8 צריכים להיות מחוברות 80-90% ביום שימוש (שלב צמיחת לוגריתמים). לשחרר תאים מצלחת התרבות ולספור באמצעות אותן השיטות שתוארו בצעדים 2.1-2.2 לתאים ראשוניים.
  6. לאפשר לתאי סרטן השחלות להתאושש בתקשורת צמיחה מלאה במשך 15-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי עם המכסה אטום באופן רופף.

3. הדבקה Assay 8

  1. לאחר התאוששות, גלולה תאי סרטן השחלות על ידי ספינינג במשך 3 דקות ברמה של 0.5 XG ולאחר מכן להסיר את supernatant ולדלל את התאים בנפח המתאים של סרום ללא מדיה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / μl 100.
  2. הפוך את 96-גם הצלחות עם תרבויות organotypic / NOF HPMC להסיר תקשורת בילתה, ולהוסיף את ההשעיה תא הסרטן 100 μl בסרום ללא מדיה לכל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבת humidified למשך 30 דקות עד 4 שעות.
  3. הפוך את צלחת 96-היטב כדי להסיר תקשורת ותאים שאינם חסיד. השתמש pipet רבי ערוצים בהספק נמוך לpipet בזהירות ובעדינות של PBS 100 μl לכל טוב, ולהפוך את צלחת שוב. חזור על PBS לשטוף פעם נוספת.
  4. הפוך להסרת PBS ולהוסיף paraformaldehyde 100 μl 4% לכל אחד. לאפשר את הצלחת לשבת במשך 20 מילn כדי לתקן את התאים. לאחר 20 דקות, להפוך את הצלחת ולהוסיף 100 μl PBS.
  5. שימו לב שהקרינה הכוללת של בארות ניתן לדווח או את מספר התאים ניתן לכמת. לכימות, צלחת ראשונה עקומה סטנדרטית בשני עותקים באמצעות תאי HeyA8 בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר.
    1. הפוך את העקומה סטנדרטית על ידי ספינינג למטה 1 מיליון תאים, הסרת תקשורת, ומאפשר להם לשבת בparaformaldehyde 1 מיליליטר 4% במשך 20 דקות.
    2. תאי ספין שוב ולהעלות ב 1 מ"ל PBS (תאי ספירה חוזרת כדי לאשר 1 מ'/ מיליליטר ריכוז). צלחת 50,000, 40,000, 30,000, 20,000, 10,000, 5000, 1000, ו -0 תאים לכל טוב בשני עותקים, ולהוסיף PBS להיקף כולל סופי של 50 μl בכל טוב.
  6. תחתון לקרוא את צלחת התרבות על קורא ניאון צלחת (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 528 ננומטר), דרוג בארות גבוהות (50,000 על עקומה סטנדרטית). השתמש בעקומה סטנדרטית לחישוב תאי סרטן השחלות כמה דבקו organotypתרבות IC בכל טוב (4A-C איור).

4. הפצת נשק Assay 10

  1. לאחר שתאי סרטן השחלות להתאושש (ראה שלבים 2.5 ו -2.6 לעיל), גלולה התאים על ידי ספינינג במשך 3 דקות ברמה של 0.5 XG ואז לדלל את התאים בנפח המתאים של 1% FBS תקשורת (DMEM עם FBS 1%, ממ 1% ויטמינים [93 מ"ג / ליטר], חומצות 1% ממ שאינם חיוניות אמינו [81.4 מ"ג / L], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]) כדי להשיג ריכוז של 4,000 תאים / 150 μl.
  2. הפוך את הצלחת 96-היטב עם / תרבויות organotypic NOF HPMC להסיר תקשורת בילתה, ולהוסיף 150 μl של ההשעיה תא הסרטן ב 1% FBS תקשורת היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבת humidified במשך 72 שעות.
  3. תחתון לקרוא את צלחת התרבות על קורא ניאון צלחת פעם אחת ביום (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 528 ננומטר) כדי להעריך את ההתפשטות היחסיתשל תאים. המשך assay עבור 96 שעות, לשנות את התקשורת בשעה 48 (איור 5 א-ג). היזהר שלא להפריע לתרבות כאשר תקשורת משתנות (היפוך לצלחת עדיפה).

5. פלישת Assay 8

  1. לפני ציפוי תרבות 3D, להוסיף קולגן עכברוש זנב 7.5 מיקרוגרם אני ב200 μl PBS להוספת 24 גם צלחת התרבות (גודל נקבובית 8 מיקרומטר). בואו O דגירה צלחת / N, ולאחר מכן להסיר בזהירות את PBS עם pipet מייד לפני ציפוי תרבות organotypic HPMC / נוף על מוסיף מצופה קולגן (שלב 2, לעיל).
  2. הכן את תאי סרטן השחלות כמו בשלב 3.1. לצלחת תאי סרטן השחלות על תרבויות organotypic במוסיף, להשתמש בזהירות pipet כדי להסיר תקשורת עודפת מהחלק העליון של מוסיף. להוסיף את ההשעיה תא סרטן השחלות 100 μl בסרום ללא מדיה לכל אחד.
  3. להוסיף 750 μl של תקשורת צמיחה מלאה להרבה מתחת להוספה לגרום לתאי סרטן בvasion לתרבויות organotypic. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבת humidified למשך 24 שעות.
    הערה: תאי סרטן השחלות שלפלוש תרבות organotypic תחצה את הכנס ותישאר בצד התחתון של הכנס.
  4. לאחר 24 שעות, לתפוס את התוסף עם קרציות ובקצרה לשטוף אותו בכוס של PBS, ולאחר מכן להעביר את הכנס ולריק. לשפשף את החלק העליון של כל הכנס עם שני הצדדים של מקלון צמר גפן בסך של 1 דקות. במהירות להכניס את התוסף לצלחת המכילה 750 paraformaldehyde μl 4% בכל טוב. לאפשר לכל הוספה לשבת בparaformaldehyde למשך 10 דקות לפני העברה מוסיף לתוך בארות מלאות 750 μl PBS.
  5. צפה תאים פלשו (דבקה וקבוע לתחתית מוסיף) עם מיקרוסקופ בהגדלה 2.5x. כאשר כל גם הוא בתוך שדה הראייה, להתאים את ההגדלה ל10x ולקחת 5 תמונות, אחד בסמוך למרכז ו1 בכל רבע של הבאר, הימנעותלוקח תמונות כי הם קרובים מדי לשוליים. בצע את אותו דפוס לכל אחד.
  6. השתמש בתכנית של היצרן כדי לספור את מספר התאים בכל תמונה כדי לקבל מספר ממוצע של תאים פלשו לשדה בכל טוב (6 א-ג איור) על פי הפרוטוקול שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרבות organotypic הורכבה על ידי הערבוב הראשון fibroblasts האנושי ראשוני עם אני סוג קולגן ולאחר מכן כיסה את התרבות הזאת עם 5 פעמים את מספר תאי mesothelial. התרבות הייתה טופחה במשך לפחות 18 שעות לפני תאי סרטן השחלות נוספו ללמוד הידבקות, פלישה או הפצה. כל assay חזר על עצמו עם מספר (n = 3-5) תרבויות 3D המתקבלות ממטופלים שונים ובארות רבות נבדקו בכל תנאים להידבקות (n = 5), ריבוי מבחני (n = 5) ופלישה (n = 3) . תאי סרטן השחלות דבקו בתרבות organotypic 3D לאחר 4 שעות (איור

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל organotypic של מייקרו-סביבת הצפק הוקם על מנת להעריך את התפקוד האישי וקולקטיבי (ים) של שני המרכיבים התאיים ומולדים של מייקרו-הסביבה בהפצת סרטן השחלות. הפרוטוקולים הספציפיים עבור ציפוי והתאמה אישי של תרבות organotypic 3D לחקור הידבקות תא סרטני, ופלישת השחלות מסופקים. תאים ראשוניים אדם omental mesothelial ופיברובלסטים בודדו מחולים ומשמשים במעבר מוקדם כדי לשמור על מורפולוגיה נורמלית ווריאצית מטופל. במודל זה, fibroblasts omental הנורמלי וECM (אני סוג קולגן בדרך כלל) היו שכבות עם m...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לכל המתמחים והרופאים המטפלים, במיוחד לד"ר א.פ. הייני (אוניברסיטת שיקגו, המחלקה למיילדות וגינקולוגיה) על איסוף ביופסיות אומנטליות. כמו כן, אנו מודים לסטייסי טובין וגייל איזנברג על העריכה הקפדנית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי Bears Care, מוטב הצדקה של מועדון הכדורגל שיקגו ברס, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) R21 NS075702, והמכון הלאומי לסרטן מענק R01 CA111882 ל-E.L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1. בידוד ותרבית של תאים ראשוניים
PBSFisher ScientificSH3001304
סכיני גילוח חד פיפיות פישרסיינטיפיק12-640
15 ס"מ צלחות תרביתBD Biosciences353025
בקבוק זכוכית??
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM עם קורנינג L-גלוטמין10-013-CV
MEM ויטמיניםקורנינג25-020-Cl
MEM חומצות אמינו לא חיוניותקורנינג25-025-CI
פניצילין-סטרפטומיציןקורנינג30-002-CI
שייקר Thermo-FisherMaxQ 4450
צנטריפוגהEppendorf5702
אינקובטורThermo-FisherForma Series II חממת CO2 עם מעטפת מים דגם 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences
353136 T-175 צלוחיותBD Biosciences353112
טיפים לפיפטRaininP2, P10, P20, P200 ו-P1000
טיפיםלפיפטמסוננים P2, P10, P20, P200 ו-P1000
שם המגיב / ציוד<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגיComments/Description
2. ציפוי תרבית תלת מימד
מונה תאיםInvitrogenרוזנת
רוזנת תא ספירת תאים שקופיותInvitrogenC10313
כתם כחול טריפן (0.4%)Gibco15250-061
קולגן סוג I (זנב עכברוש)BD Biosciences354236
צלחת 96 בארות, תחתית שקופה, BD שחור Biosciences353219
שם המגיב / ציוד< / חזק><חזק >חברה < חזק ><חזק >מספר קטלוגי < חזק ><חזק >הערות / תיאור< חזק
><חזק >3. בדיקת הדבקה
רב ערוצי פיפטEppendorfXplorer 300
תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
קורא צלחותמכשירים מולקולרייםMinimax
שם המגיב / ציוד< / חזק><חזק>חברה< / חזק>מספר קטלוגיהערות/תיאור
5. מבחן פלישה
מוסיף תרבית תאים (8um, 24-well)BD Biosciences353097
צמר גפןQ-tipsצמר גפן
מיקרוסקופZeissAxiovert 200m
Cell Profilerנחלת הכלל
24 באר צלחתBD Biosciences353047
<חזק>שם המגיב / ציוד< / חזק ><חזק >חברה < חזק ><חזק >מספר קטלוגי < חזק ><חזק >הערות / תיאור< חזק >
<חזק >6. נוגדנים
אנטי-אינטגרין ואלפא; V&BETA; 3 נוגדנים, שיבוט LM609EMD MilliporeMAB1976
בטא 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
טיפים

מקורות

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל של חלל הפריטונאוםתאי מזותליים ראשוניים של בן אדםפיברובלאסטים של אומנטום נורמליהיצמדות תאי סרטןפלישת תאי סרטןשגשוג תאי סרטןעיכוב באמצעות פפטיד RGDנוגדנים חוסמי אינטגרין
דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.