שימוש פנטום אנזים יחיד דינמי רב-תא ללימודים של סוכני תהודה מגנטית Hyperpolarized

סיכום

פנטום דינמי רב-תאים משמש לדמות ביולוגיה מעניינת למחקרים מטבוליים באמצעות סוכני תהודה מגנטים היפר-פולריזציה.

תקציר

הדמיה של מצעים hyperpolarized ידי תהודה מגנטית נראה מבטיח קליני גדול להערכת תהליכים ביוכימיים קריטיים בזמן אמת. עקב אילוצי יסוד שקבעו מדינת hyperpolarized, טכניקות הדמיה ושחזור אקזוטיות נמצאות בשימוש נפוץ. מערכת מעשית לאפיון של שיטות הדמיה דינמית, רב-ספקטרלי נדרש אנושות. מערכת כזו חייבת reproducibly לשחזר את הדינמיקה הכימית הרלוונטית של רקמות נורמליות ופתולוגיים. מצע השימוש הנרחב ביותר עד כה הוא hyperpolarized [1- ¹³ C] -pyruvate להערכת מטבוליזם הסרטן. אנו מתארים מערכת פנטום אנזים מבוסס שמתווך ההמרה של פירובט כדי לקטט. התגובה היא יזמה על ידי הזרקה של סוכן hyperpolarized לתאים מרובים בתוך הרפאים, שכל אחד מהם מכיל ריכוזים שונים של חומרים כימיים כי לשלוט על קצב התגובה. תאים מרובים נחוצים על מנת להבטיח כי הר"ירצפים גינג בנאמנות ללכוד את ההטרוגניות המרחבית המטבולית של רקמת גוף. מערכת זו תסייע הפיתוח ותיקוף אסטרטגיות הדמיה מתקדמות על ידי מתן דינמיקה כימית שאינן זמינים מרווחות רפאים קונבנציונליים, כמו גם מלא שחזור זה לא אפשרי in vivo.

מבוא

ההשפעה הקלינית של תהודה מגנטית hyperpolarized (MRI) של ¹³ תרכובות C שכותרתו תלויה באופן מכריע ביכולתה למדוד את שיעורי המרה כימיים באמצעות הדמית ספקטרוסקופיות ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית בזמן אמת ^1-5. במהלך רצף פיתוח ואימות, המרה כימית דינמי מושגת באמצעות כלל in vivo או במודלים במבחנה ^6-9 המציעים מלא שחזור מוגבלים. לבדיקה חזקה והבטיח איכות, מערכת מבוקרת יותר השומרת על ההמרה הכימית אנדמית מדידה זו תהיה בחירה מועדפת. אנו להתוות שיטה להשיג המרה זו באופן לשחזור באמצעות רפאי אנזים יחידים דינמיים.

רוב המחקרים עם hyperpolarized ¹³ סוכני C להתמקד הדמית מצעי hyperpolarized בסביבה ביולוגית מתפקדת. זוהי הבחירה הברורה אם המטרה היא ללמוד ביולוגיאל מעבדת או לקבוע פוטנציאל להשפעה על טיפול קליני. עם זאת, אם אפיון של כמה אלגוריתם עיבוד מדידת מערכת או נתונים רצויים, מודלים ביולוגיים יש חסרונות רבים כגון השתנות במרחב ובזמן טמונה ^10. עם זאת, רוחות רפאים סטטי קונבנציונליות חסרות את המרה הכימית שמניעה את העניין הקליני הראשוני MRI של מצעי hyperpolarized, ולא ניתן להשתמש בם כדי לאפיין זיהוי של שיעורי המרה או פרמטרים דינמיים אחרים ^11. שימוש במערכת אנזים אחד אנו יכולים לספק המרה כימית לשליטה לשחזור, המאפשר בדיקה קפדנית של אסטרטגיות הדמיה דינמיות.

מערכת זו מופנית חוקרים מטעמו מפתחים אסטרטגיות הדמיה מצעים hyperpolarized ומאחלים לאפיין ביצועים להשוואה נגד גישות חלופיות. אם מדידות סטטי הן נקודת הסיום הרצויה ואז סטטי ¹³ המטבוליט-הנקרא C פנטומי wiיהיה להספיק ^11. בצד השני אם אפיון ביולוגי מורכב יותר הוא קריטי השיטה (משלוח, וצפיפות תאית, וכו ') ולאחר מכן מודלים ביולוגיים בפועל יהיו צורך ^12-14. מערכת זו היא אידיאלית עבור הערכה של אסטרטגיות הדמיה כי מטרתנו היא לספק מדד כמותי של שיעורי המרה כימית לכאורה.

פרוטוקול

הערה: (עיצוב פנטום) שני 3 מיליליטר תאי היו במכונה מתוך Ultem מצויד צינורות צצים (OD 1.5875 מ"מ 0.762 מ"מ ID) להזרקה ופליטה. לשכות הונחו צינור צנטריפוגות 50 מ"ל מלא מים (איור 1). כדי למנוע חללי אות נוצרו על ידי בועות, לתאים והתורים היו מראש מלאים מים ללא יונים (DH ₂ O).

1. פתרון כנה

1. הכן 1 פתרון חיץ L (81.3 מ"מ טריס pH 7.6, 203.3 מ"מ NaCl). תשקלי 11.38 גבישים מוגדרים מראש גרם Trizma pH 7.6 ו 11.88 גרם NaCl ו להתמוסס 1 ליטר של DH ₂ O.
2. כן 50 פתרון המ"מ NADH. תשקול 17.8 מ"ג של dinucleotide אדנין β-nicotinamide (NADH), מופחת מלח dipotassium ו להתמוסס 280 μl של פתרון החיץ שהוכן בצעד אחד.
3. כן 250 U / ml אנזימי פתרון. תשקלו 78.75 יחידות פעילות של לקטט דהידרוגנאז (LDH) ו להתמוסס 315 חיץ μl מסעיףTEP אחד.
4. הכינו תערובת פירובט. תשקלי 21.4 מ"ג Ox063 trityl הרדיקלי מתמוססים 1.26 גרם (~ 1 מ"ל) [1 ¹³ C] פירובט.
5. הכן התקשורת פירוק (40 מ"מ טריס pH 7.6, 40 mM NaOH, 0.27 mM EDTA ו -50 מ"מ NaCl). תשקלי 5.96 גרם של pH גבישים מוגדרים מראש Trizma 7.6, 1.6 גרם של NaOH, 0.1 גרם מייבשים מלח disodium ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו -2.9 גרם NaCl ו להתמוסס 1 L DH ₂ O.
6. הכן 01:10 פתרון gadoteridol (50 מ"מ). מערבבים 1 μl של gadoteridol ב 9 μl של DH ₂ O. הכנת 8 M ^[13 C] אוריאה. תשקול 1.465 5 ^[13 C] אוריאה מתמוססת 3 מיליליטר DH ₂ O.

2. הכנת Hyperpolarized פירובט

1. בתוך כוס מדגם עבור קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מערכת, פיפטה 0.3 μl של פתרון gadoteridol ו -13 מ"ג (~ 10 μl) של הפתרון פירובט.
2. בקצרה מערבבים את התערובת בתוך הכוס המדגם עם קצה פיפטה.
3. הכנס לדוגמא למערכת DNP.
   1. ודא את הדלת למערכת DNP סגורה. תוכלו להתחיל את תהליך הכניסה המדגם על ידי לחיצה על כפתור מדגם להוסיף על קונסולת מערכת DNP. על אשף המדגם לבחור מדגם ולחץ נורמלים הבאה.
   2. שמירה על כוס המדגם אנכית בעדינות למקם את מוט הכניסה מעל החלק העליון של הכוס המדגמת. כשיתבקש, לפתוח את מערכת DNP והכנס את הכוס לתוך כנס הטמפרטורה משתנה (VTI) באמצעות מוט הכניסה.
   3. משוך על הבוכנה בסוף מוט הכניסה המדגמת לשחרר המדגם במדד הטמפרטורה משתנה. הסר את מוט הכניסה מדגם מהמערכת ולחץ על הכפתור הבא על מסוף מערכת DNP.
4. ליזום את הקיטוב.
   1. לחץ על כפתור ה הקיטוב התחלה על קונסולת מערכת DNP. בשנות ה .HYPERSENSENMR סוג התוכנה RINMR להשיק הקיטוב תוכנת ניטור. הגדר להצטבר התצורה 1 ולחצו אנטר. לאחר מכן לחץ מוצק לבנות up.
   2. הגדר את המיקום והשם של הקובץ ולשמור. בחר את הפרופיל ל -13-C הנפתחת לשוני מסוף מערכת DNP ולחץ הבא. סמן את התיבה כדי לדגום בזמן המירוץ, זמן מדגם מוגדר 300 שניות ולחץ על סיום.
5. מדוד את 3.85 גרם (~ 4 מ"ל) של התקשורת פירוק או לפי נפח עם מזרק 5 מ"ל או לפי משקל באמצעות סולם.

3. הכנה של פנטום האנזים

1. מלאו צינור microcentrifuge עם ~ 3 מ"ל ^[13 C] פתרון אוריאה ולמקם אותו בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל. מלאו את צינור צנטריפוגות 50 מ"ל עם DH ₂ O.
2. טרום למלא את שני תאי אנזים ואת הקווים עם DH ₂ O על ידי הזרקה ~ 3 מיליליטר DH ₂ O לתוך קווי ההזרקה של הפנטום, מקפידה לשטוף כל בועות נוצרות.
3. מניח את הרפאים במרכז המגנט עם גישה קלה לקווי ההזרקה. ודא שיש כמה מיכל לתפוס את הנוזל כי יפרוק אל t הוא קו הפליטה.
4. הכן תערובת האנזים פעילות גבוהה (17.14 מ"מ NADH, 44.57 LDH U / ml). מערבבים יחד 240 פתרון NADH μl, 125 μl פתרון LDH ו -335 חיץ μl ולשמור על מזרק 3 מ"ל שניתן המצורפת בקו ההזרקה.
   הערה: לאחר בשילוב עם 500 μl של 40 פירובט מ"מ ממערכת DNP, היקף פאנטום הסופי יהיה 1.2 מ"ל עם ריכוזים של 16.7 מ"מ פירובט, 10 מ"מ NADH, ו -26 U / L LDH בתמיסה שנאגרו טריס עם pH ~ 7.5.
5. הכן תערובת האנזים פעילות נמוכה (17.14 מ"מ NADH 26.79 U / ml LDH) מערבבים יחד 240 פתרון NADH μl, 75 μl פתרון LDH ו 385 חיץ μl ולשמור בתוך מזרק מ"ל 3 נפרדת היכולה להיות מחוברים בקו ההזרקה.
   הערה: לאחר בשילוב עם 500 μl של 40 פירובט מ"מ ממערכת DNP נפח פאנטום הסופי יהיה 1.2 מ"ל עם ריכוזים של 16.7 מ"מ פירובט, 10 מ"מ NADH, ו 15,625 U / L LDH בתמיסה שנאגרו טריס עם pH ~ 7.5 .

jove_title "> 4. להפעיל את כל אבטחת איכות (QA) וסריקות מיצוב

1. מיצוב ראשוני.
   1. טען סריקת מיצוב FLASH חדשה במצב מבצע ^[1 ח] במצב נפח TX / RX. שינוי להגדיר ממדים 2: כלי בקרה ספקטרומטר -> GS ערוך -> מידות התקנה -> 2. לחצו GSP על הפיקוח ספקטרומטר ולעבור רפאים עד שמרכזה המגנט. לחץ STOP ואז הרפובליקנים לחץ על Control ספקטרומטר.
2. סריקת פיילוט.
   1. טען סריקת מיצוב TriPiolt חדשה במצב מבצע ^[1 ח] במצב נפח TX / RX. התפקיד Slice: בקרת סריקה -> Slice בארון כלים> להעביר פרוסות (להחזיק M לחץ על מקש וגרור; פרוסה בחר להעביר את מחוון החבילה הפרוסה).
   2. לנענע ¹ H קויל: כלי בקרה ספקטרומטר -> ACQ -> לנענע. Tune ומתאימים ¹ H סליל מאחורי STOP מגנט ולחץ. תוך כדי לחיצה על כל מקש SHIFT הרמזור על חלון בקרת הסריקה.

class = "jove_title"> 5. הגדרת רדיאלי הד מישורי Spectral Imaging סריקה

1. טען הדמיה ספקטרוסקופיות מישוריים הד חדש רדיאלי (radEPSI) סריקה במצב פעולה ^[13 C] במצב נפח TX / RX. התפקיד Slice: כלי Slice בשלט הסריקה ופרוס לזוז (להחזיק M לחץ על מקש וגרור; פרוסה בחר להעביר את מחוון החבילה הפרוסה).
2. לנענע ¹³ C סליל ידי לחיצת כלי בקרת ספקטרומטר -> ACQ -> לנענע. קבע את הרווח מהמקלט 1,000-2,000 על ספקטרומטר.
3. בצע את בדיקת המערכת הסופית. בהתאם רצף, להתבונן אות פחמן 13 מהאולם אוראה פרוטוקול הסקאוט.
   הערה: פעולה זו מבטיחה כי המערכת מוגדרת כראוי לפני תחילת תהליך פירוק בלתי הפיך.

6. פירוק הפעלה

1. כאשר פירובט השיג> 90% קיטוב (~ 1 שעה), פתרונות הפנטום מוכנים והסריקה מוגדרת ללחוץ על כפתור הפירוק לרוץ על סאי DNPגזע המסוף.
2. כאשר יתבקש להעביר את מקל הפירוק למצב ההפעלה שלה ולהזריק תקשורת פירוק. סגור את מערכת DNP ולחץ על הכפתור סיים על קונסולת מערכת DNP. זז מקל פירוק חזרה נחתי עמדה כשתתבקש מכן לחץ על סיום.
3. כשהמערכת DNP מספק את פירובט hyperpolarized (~ 2 דקות לאחר תחילת חימום) לסגת 500 μl של פתרון פירובט לתוך כל המזרקים פתרון ריכוז האנזים גבוה ונמוך. לאט (~ 10 שניות) להזריק מזרק אחד לתוך בקו ההזרקה.
   הערה: סריקה, הייתה יכולה להתרחש לפני ההזרקה או בכל עת עד 3 דקות לאחר ההזרקה בהתאם לפרוטוקול סריקה בשימוש.

עיבוד תמונה 7.

הערה: זה פנטום מתוכנן לשימוש עם אסטרטגיות הדמיה רבות. ראה 2 איור, כדוגמה את אופן הצגת תמונות rad-EPSI עובדו באמצעות Matlab.

1. טען נתונים גולמיים מקובץ fid. Reshape הנתונים כדי להתאים את מספר התחזיות, קריא נקודות, הדים וחשבון עבור נתונים המאוחסנים כזוגות אמיתיים ומדומים. הפרד את נקודות הד זוגיים ואי-זוגיים.
2. התמרת גם ההדים אפילו או מוזר לאורך ממדים הד. ראייה לזהות את התדרים עבור פירובט ומיניקות. לשם פשטות הערך המוחלט של הספקטרום היה בשימוש.
3. הפרד בין הלהקה המטבוליט ו התמרת לאורך כיוון לקודד בתדירות להניב sinograms מבודד לכל המטבוליט. ראדון הופכים להפוך את sinograms הנפרד לייצר תמונה או של לקטט או פירובט.

תוצאות

תמונות 2D Slice-סלקטיבית נרכשו באמצעות רצף תמונת מצב radEPSI. תמונות המטבוליט שוחזרו באמצעות הקרנה הסתננה. התמונות המטבוליט היו מיושרים היטב עם תמונות פרוטון, כפי שניתן לראות באיור 2. בשנת hyperpolarized מערכת זו אות לקטט יכול להיווצר רק מהמרת האנזימטית של פירובט hyperpolarized. באיור 4, לתא התחתון, עם ריכוז LDH גבוה, יש לקטט חזק אות פירובט חלשה לעומת לתא העליון. באמצעות אותות המטבוליט יחסית כמו הערכה של ריכוז האנז...

דיון

הדמיה בזמן אמת של מטבוליטים hyperpolarized יש אתגרים ייחודיים רבים עבור עיצוב רצף, אימות, ובקרת איכות. היכולת לפתור ההטרוגניות spatiotemporal רפאים מציעה פוטנציאל קליני משמעותי, אבל מונע שיטות QA ואימות הקשורים MRI קונבנציונלי. רצפי הדמיה מורכבים או אלגוריתמי שיקום יכולים להיות תלות עדינה אשר הופכת אותם קשה לאפיין או לאמת מחוץ ניסוי ההדמיה. ההטרוגניות ביולוגית חששות מעשיים אחרים להגביל את השימוש in vivo ו במודלים חוץ גופית לאפיין או לאמת רצפים, חומרה או ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 טסלה סורק MRI פרה-קליני
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer לסוכני MRI
1-13C-חומצה פירווית	סיגמא אולדריץ'	677175	פחמן 13 חומצה פירובית מסודרת
טריטיל רדיקל	GE Healthcare	OX063	רדיקלים חופשיים המשמשים בקיטוב גרעיני דינמי
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase משריר הארנב
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד, מלח דיפוטסיום מופחת
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma גבישים מוגדרים מראש
NaCl	Sigma Aldrich	S7653