מאמר שיטה

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53655

⸱

3 במרץ 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה לטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים הבדילו כי מחויב כלפי האנדודרם הסופי לשיפור יישומים במורד בידול נוסף.

תקציר

יכולות ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים כגון תאי גזע עובריים (ESCs) לאפשר יישום טיפולי פוטנציאל טיפולי התחדשות תאים. סופני סוגי תאים מובחנים יכול לשמש לטיפול במחלות ניווניות שונות. חוץ גופית התמיינות של תאים אלה כלפי רקמות של ריאות, כבד ולבלב דורש כצעד ראשון הדור של תאים endodermal מוחלטות. שלב זה הוא הגבלת קצב לבידול נוסף לקראת סוגי תאים התבגר סופני כגון תאי ביתא מייצרי אינסולין, hepatocytes או סוגי תאים אחרים הנגזרות האנדודרם. תאים מחויבים כלפי השושלת endoderm מאוד להביע שפע של גורמי שעתוק כגון FOXA2, SOX17, HNF1B, בני משפחת גאטה, ואת לקולטן CXCR4. עם זאת, פרוטוקולי בידול הם לעתים רחוקות 100% יעילים. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור של אוכלוסיית תא CXCR4 + לאחר התמיינותאל DE באמצעות microbeads מגנטי. טיהור זה גם מסיר תאים של שושלות רצויות. שיטת הטיהור העדינה היא מהירה ואמינה ועשויה לשמש כדי לשפר יישומי differentiations במורד זרם.

מבוא

תאי גזע פלוריפוטנטיים כגון תאי גזע עובריים (ESCs) יש את היכולת להתמיין כמעט כל סוג תא בגוף האדם. לפיכך, פרוטוקולים בידול במבחנה יכול לשמש כדי ליצור סוגי תאים בוגרים רבים כגון cardiomyocytes 1, hepatocytes 2, תאי בטא 3, ריאות אפיתל 4 או 5 תאים עצביים. זה עושה ESCs כלי רב ערך לטיפול הפוטנציאל של מחלות ניווניות שונות 3.

בידול במבחנה של ESCs כלפי רקמות בוגרות של ריאות, כבד ולבלב דורש פסאודו gastrulation לתאים מזכיר את האנדודרם סופי (DE) 6. מאז בידול במורד כלפי סוגי תאים סומטיים הנ"ל הוא משמעותי פחות יעיל, בידול האנדודרם אופטימלי נחשב הגבלת קצב 7. תאים מחויבים כלפי שושלת endoderm לעבור צ'השינויי racteristic בפרופיל ביטוי הגנים שלהם. מאסטר pluripotency גנים הרגולטור למטה מוסדרים, ואילו הביטוי של גורמי שעתוק אחרים כגון FOXA2, SOX17, HNF1B, בני משפחת Gata ואת לקולטן CXCR4 הוא שהוגברו מאוד 6, 8, 9. CXCR4 ידוע להיות transactivated ידי SMAD2 / 3, במורד זרם של איתות קטרים ​​/ TGF-β ו SOX17 בשל אתרי קישור ספציפיים באזור האמרגן שלה 10. לכן הוא סמן מתאים מאוד בשימוש מספר הדיווחים 6, 8, 11-13. שינויי ביטוי אלה משקפים אירוע פסאודו gastrulation, שבו ESCs לרכוש הראשונה מאפיינים של אוכלוסיית תא פס דמוי פרימיטיבית ובהמשך להתחייב לתוך השכבה ניבטת endoderm 6.

עם זאת, פרוטוקולי בידול הם לעתים רחוקות 100% יעילים כמו כמה תאים עשויים להתנגד לתהליך הבידול או להבדיל כלפי שושלות מכוונות אחרות 14. תאים אלה עשויים לרעה influeבידול נוסף NCE. יתר על כן, תאים שלא עברו התמיינות שיורית נמל סיכונים גדולים לניסויי השתלה מאוחר יותר עשוי להצמיח teratomas 15-17.

כדי להסיר תאים לא רצויים אלה מוקדם על CXCR4 סמן המשטח יכול לשמש עבור טיהור של תאים מחויבים כלפי DE 18. כאן אנו מתארים שיטת הסלקציה החיובית של CXCR4 + תאים מתרבויות בידול DE. לשם כך, CXCR4 סמן המשטח מחויב נוגדן אשר בתורם נקשר microbeads המגנטי. בניגוד לתנאים הקשים במהלך מיון FACS, תאי DE הדמויים המתויגים מגנטי אז יכולים להיות מטוהרים בקלות בפורמט המעבדתיים באמצעות שיטת טיהור עדינה. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה להסרת אוכלוסיות תאי המגן מפני תהליך התמיינות DE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בידול 1. של האדם ESC כלפי האנדודרם המכריע

  1. טפחו את תאי גזע עובריים אנושיים (ESCs) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. מעיל צלחת תרבות 6 היטב סלולרי חדש עם 1 מ"ל של מטריצה ​​קרום במרתף דגירה כלי התרבות למשך 30 דקות לפחות ב RT. לפרטים ספציפיים בבקשה לפנות להוראות היצרן בהתאמה.
  3. ודא ESCs האדם התרבותי יגיע ל -80% -90% confluency תחת מיקרוסקופ באמצעות בהגדלה נמוכה (למשל, 4X). לשאוב את המדיום מהנקבובי ידי מוצצת המדיום עם pipet פסטר זכוכית סטרילית. שוטפים את התאים פעם עם פתרון בופר פוספט (PBS). לשם כך, להוסיף 2 מ"ל PBS היטב כל ברכות לנער את צלחת ולמצוץ את הפתרון כדי להסיר תאים מתים ופסולת התא.
  4. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט פתרון passaging ללא אנזים דיסוציאציה עדין של צבירי תאים. דגירת התאים לעבר 37 ° Cד 5% CO 2 עד התאים להראות סימנים ברורים של הפרעה בצבירים קטנים.
    הערה: זמן הדגירה תלוי המגיב בשימוש. לקבלת פתרון passaging ללא אנזים שהוזכר בסעיף החומרים, זמן דגירה הוא בערך 7 דקות.
  5. הוסף 1 מ"ל DMEM / בינוני F-12 ולשבש המצרפים תא הנותרים לתוך תאים בודדים ידי pipetting מעלה ומטה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. השתמש באפשרות זו כדי לרוקן את התאים מפני השטח ולהעביר את תאי צינור צנטריפוגה. כדי לאחזר את כל התאים, לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של DMEM / בינוני F-12 ולהוסיף המדיום אל הצינור צנטריפוגה.
  6. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant ו resuspend התאים במדיום תרבית תאים 5 מ"ל ES המכיל מעכב 10 מיקרומטר Rho-קינאז (ROCK).
  7. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer וזרעי 150,000 - 400,000 תאים לכל 6 באר או אחר צלחת פריסה, בהתאם לקו בתאי הגזע העוברי בשימוש. מבוי סתום שימוש ture בינוני מעכב ROCK 10 מיקרומטר המכיל להימנע אפופטוזיס והתרבות התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  8. כ -24 שעות לאחר זריעה לשאוב את המדיום עם pipet פסטר זכוכית סטרילית להוסיף 2 מ"ל של מדיום אינדוקציה הראשונית.
    הערה: בינוני זה מכיל ריכוזים סופי של 1% גלוטמין, 0.2% FCS, 5 מיקרומטר CHIR-99,021 ו 50 ng / A Activin מ"ל מתקדם RPMI-1640 בינוני. בדרך כלל, להשתמש 2 מ"ל של מדיום לגידול 6 צלחות היטב.
  9. 48 שעות לאחר הזריעה, להחליף את המדיום כדי endoderm בינוני אינדוקציה. טפחו את התאים במדיום הזה במשך 48 אחר שעה עם שינוי בינוני יומי.
    הערה: בינוני זה מכיל 1% גלוטמין, 0.2% FCS ו -50 ng / ml Activin א 'מתקדם RPMI-1640 בינוני. תאים מחויבים כלפי האנדודרם הסופי להביע את סמן המשטח CXCR4. המכתים של CXCR4 יכול לשמש כדי לכמת את מספר התאים המחויבים DE.

class = "jove_title"> 2. צביעת תאי CXCR4 + Definitive endoderm עבור ניתוח cytometry הזרימה

  1. במשך 24 שעות הסופיות אבל לפחות 1 שעה לפני קצירת התאים להוסיף 10 מיקרומטר ROCK מעכבים עד בינוני התרבות.
  2. מעיל התא-ware תרבות ישמש מחדש זריעה עם מטריצה ​​קרום במרתף, כלומר, 12-גם צלחות לניתוח qPCR או קאמרית שקופיות עבור מכתים immunofluorescence. דגירת הצלחות או שקופיות למשך 30 דקות לפחות ב RT.
  3. לשאוב את המדיום עם pipet פסטר זכוכית סטרילית מן הבארות של התאים הממוינים המשמשים מכתים ו / או מיון.
  4. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט פתרון passaging האנזים ללא עבור דיסוציאציה עדין של צבירי תאים. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד להראות את תאי סימנים ברורים של הפרעה בצבירים קטנים.
    הערה: זמן הדגירה תלוי המגיב בשימוש. לקבלת הפתרון passaging האנזים ללא המוזכרים materiסעיף als, זמן הדגירה הוא בערך 7 דקות.
  5. הוסף 1 מיליליטר DMEM / F-12 בינוניים ולשבש הנותרים אגרגטים תא לתוך תאים בודדים ידי pipetting מעלה ומטה בעזרת טיפ 1 מיליליטר. השתמש באפשרות זו כדי לרוקן את התאים מפני השטח ולהעביר את תאי צינור צנטריפוגה. כדי לאחזר את כל התאים, לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של DMEM / F-12 בינוני w / o FCS ולהוסיף המדיום אל הצינור צנטריפוגה.
  6. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. תאים משלוש בארות של צלחת 6-גם אמורים לגרום 10-15 x 10 6 תאים לאחר שלושה ימים של בידול. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
    הערה: המספר המדויק של התאים המתקבלים יהיה תלוי שורת תאים פלוריפוטנטיים המשמש את הבידול.
  7. לשאוב supernatant ו resuspend התאים חיץ PEB המכילים מעכבי ROCK 10 מיקרומטר. השתמש 100 μl של חיץ זה לתקופה של עד 10 7 תאים. מוסיפים את מעכבי ROCK 10 מיקרומטר ביום staining. השתמש חיץ זה עבור כל היישומים במורד הזרם (המכונה חיץ PEB + RI).
    הערה: חיץ PEB מכיל 0.5% BSA ו -2 מ"מ EDTA ב PBS. אם יותר תאים להיות מוכתמים, להתאים את עוצמת קול החיץ בהתאם.
  8. הוסף 10 μl של נוגדן CXCR4-APC לכל 10 7 תאים 100 μl, זה בערך מייצג דילול של 1:10.
    הערה: השימוש של נוגדן APC צמוד אינו חובה. במקום זה ניתן להחליף בהתאם microbeads בשימוש. אם יותר תאים הם להיצבע לכוונן את עוצמת קול הנוגדן בהתאם.
  9. מערבבים על ידי היפוך הצינור בעדינות עם האצבעות דגירה על 4 מעלות צלזיוס במקרר במשך 15 דקות. Resuspend התאים עם חיץ PEB מ"ל 1-2. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
  10. לשאוב supernatant עם pipet פסטר זכוכית סטרילית resuspend התא גלולה ב PEB 80 μl לכל 10 7 תאים ולהוסיף 20 microbeads μl אנטי APC.
    הערה: אם יותר התאים להיות מוכתם, להתאים את עוצמת הקול מיקרו-חרוז בהתאם.
  11. מערבבים על ידי היפוך הצינור בעדינות עם האצבעות דגירה על 4 מעלות צלזיוס במקרר במשך 15 דקות. Resuspend התאים עם חיץ PEB מ"ל 1-2 + RI. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם. לשאוב את המאגר. Resuspend במאגר 500 μl PEB + RI.

3. הפרדה מגנטית של CXCR4 + תאים

  1. מניח טור מגנטי בגודל בינוני בתוך שדה מגנטי לפי הוראות ייצור. טרום לשטוף את העמודה עם 500 μl PEB חיץ + RI. החל את השעית התא כולו לעמודה. אסוף את הזרימה דרך תאים לא הכל כפי יהיה לאגד את העמודה. ודא שלא להפריע את העמודות לשליפה אופטימלית של תאי CXCR4 +.
  2. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם חיץ 500 μl PEB + RI. אסוף את הזרם הראשון דרך ולשלב אותו עם תאים שנאספו שלב 3.1. הסר את העמודה המגנטית מהשדה המגנטי ומניח אותו בתוךצינור איסוף מתאים. הוסף 1 מ"ל PEB חיץ + RI על הטור. כדי elute התאים היטב ומהדקים את הבוכנה לתוך הטור.
  3. אופציונלי: לאסוף את כל הזרימה דרך דגימות בנפרד ולהשתמש 20 μl כל לנתח את מספר CXCR4 + תאים באמצעות cytometry הזרימה. מספרם צריך לרדת עם כל צעד כביסה.
    הערה: לפחות 2 x 10 4 קיימא, תאים מגודרים צריכים לספור עבור תוצאות אמינות.
  4. חזור על שלבים 3.1-3.3 עם הזרם-שנאסף באמצעות מדגם משלב 3.1 ואת הזרם הראשון באמצעות מדגם משלב 3.2 באמצעות טור חדש. אל תשתמש שוב בטור הקודם. באמצעות אוויר הבוכנה נלחץ לתוך הטור, אשר חוסם אותו.
  5. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. בהתאם היעיל של עד הבידול עד 6 x 10 6 תאים ניתן למיין בתחילה ועוד 1 x 10 6 תאים באמצעות עמודה שנייה בעת שימוש 10 7 תאים עבור ההליך.
  6. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב את supernatant עם pipet פסטר זכוכית סטרילית resuspend התאים במדיום אינדוקציה האנדודרם 1 מ"ל משלב 1.9 עם מעכב ROCK 10 מיקרומטר נוסף.
  7. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. זרעי התאים בצפיפות מתאימה, כלומר, ~ 4 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 12-היטב (אפליקציה. 3.6 סנטימטר 2 משטח) או ~ 1.5 x 10 5 תאים לכל טוב של 8-היטב קאמרי שקופיות.

4. אופציונאלי: ניתוח אוכלוסין endoderm Definitive מטוהרים

  1. עבור מכתים immunofluorescence לתקן את התאים מטוהרים משלב 3.7 בערך 24 שעות לאחר זריעה עם 4% paraformaldehyde ו כתם במשך האנדודרם סופי (DE) ו / או חלבונים סמן pluripotency.
    הערה: בשימוש נפוץ סמנים DE כוללים FOXA2 ו SOX17, סמנים pluripotency נפוצים כוללים OCT3 / 4, NANOG ו Sox2 6, 8.
  2. For ניתוח RT-qPCR, לקצור את התאים מטוהרים ישירות או 24 שעות לאחר זריעה, לחלץ סך-RNA הפוכה לתמלל cDNA מן מכלל הדגימות-RNA חילוץ. השתמש 10 cDNA ng כתבנית לכל תגובה RT-qPCR (triplicates) לנתח את הביטוי של DE וגנים סמן pluripotency 6, 8.
    הערה: גני סמן מקובלים הם שהוזכרו בשלב 4.1. תנאי מחזור 5 דקות ב 95 ° C ו 40 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס ו 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, ואחריו נמס ניתוח עקום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עם בידול ESCs לעבור שינויים דרסטיים גנים ביטוי חלבון. איור 1 מתאר גנים סמן טיפוסי שניתן להשתמש בהם כדי לאמת בידול האנדודרם מוצלח. מטרות הממשלה עבור ניתוח ביטוי גנים הם GSC, FOXA2, ו SOX17. בניתוח ביטוי גנים ביחס במיוחד FOXA2 ו SOX17 הם עלו ב> 2,000 לקפל בהשוואה ESCs מובחן. GSC כבר מתבטא מאוד מוקדם בתוך 24 שעות במהלך היווצרות פס פרימיטיבי אבל זה בכל זאת מושר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נכון לעכשיו פרוטוקולי בידול לעתים נדירות לגרום תאים מובחנים 100%. מסיבות שעדיין יש לטפל תאים מסוימים להתנגד לתהליך הבידול. בהתאם את היעילות של פרוטוקול בידול המשמשים ואת הנטייה של ESC קו מספר מסוים של תאים פלוריפוטנטיים שיורית הם נצפו גם בכינויו לאחר בידול לתוך האנדודרם סופי. תאים שיורית אלו עלולים לפגוע differentiations במורד הזרם או ניתוח נוסף כגון transcriptomics, פרוטאומיקה, וניתוח ביטוי מירנה. תאים פלוריפוטנטיים שיורים או שושלות רצויות אחרות עשויים גם להפגין תופעות paracrine ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

הסיוע הטכני המיומן של יסמין Kresse היא הודתה בהכרת תודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Hues8 קו תאי גזע עובריים אנושייםהמחלקה לתאי גזע וביולוגיה רגנרטיבית של הרווארדקו תאים מתאים לדור אנדודרם
S1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC,אנושי Miltenyi Biotec130-098-357
אנטי-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
מפריד OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109שדה מגנטי
Y-27632Selleck ChemicalsS1049מעכב ROCK
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
מגיב דיסוציאציה עדיןשל תאים טכנולוגיות תאי גזע7174ללא אנזימים פתרון מעבר, אלטרנטיבה: טריפסין/EDTA
Matrigel*קורנינג354277מטריצת ממברנת הבסיס
* לפתור ולאחסן במכסות ב-80 מעלות; C כמפורט במדריך הספקים. לאחר השימוש, יש להפשיר על קרח, לדלל ב-25 מ"ל נוקאאוט קר כקרח DMEM/F-12.
להוסיף 1 מ"ל לכל באר של צלחת של 6 בארות ולדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
יש להסיר את המטריגל ולהשתמש מיד.
MS ColumnsMiltenyi Biotec30-042-201
מפריד MACSMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaaagtggaggtctctggtt		Life טכנולוגיות
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan assayApplied BiosystemsHs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggttgtag		Life Technologies
אדם POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggggagg		טכנולוגיות חיים אנושי
POU5F1 REV
ctgcagtgtgtgtgtttcgggca		טכנולוגיות חיים
נונג אנושי FW
ccgagggcacatcatcc		טכנולוגיות
נונג אנושי REV
ccatccactgccacatcttct		טכנולוגיות
אנושי TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tggt cag tcc agt		g Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg ga g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
CGA TGC TGC GGT TCC AGC CTA T 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& D מערכותAF1924
קו תאי גזע עובריים אנושיים Hes3 ES Cell International קו תאים מתאים וחזק לדור האנדודרם mTeSR1 Stemcell Technologies 5850 מדיום תרבית ESC FCS Biowest חייםחיים

מקורות

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
  3. Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
  4. Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
  5. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286(2009).
  6. Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
  7. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  8. Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
  9. Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
  10. Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
  11. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  12. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  13. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  14. Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
  15. Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
  16. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  17. Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
  18. Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CXCR4ROCK

מאמרים קשורים