Method Article

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

DOI:

10.3791/53655

⸱

March 3rd, 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה לטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים הבדילו כי מחויב כלפי האנדודרם הסופי לשיפור יישומים במורד בידול נוסף.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכולות ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים כגון תאי גזע עובריים (ESCs) לאפשר יישום טיפולי פוטנציאל טיפולי התחדשות תאים. סופני סוגי תאים מובחנים יכול לשמש לטיפול במחלות ניווניות שונות. חוץ גופית התמיינות של תאים אלה כלפי רקמות של ריאות, כבד ולבלב דורש כצעד ראשון הדור של תאים endodermal מוחלטות. שלב זה הוא הגבלת קצב לבידול נוסף לקראת סוגי תאים התבגר סופני כגון תאי ביתא מייצרי אינסולין, hepatocytes או סוגי תאים אחרים הנגזרות האנדודרם. תאים מחויבים כלפי השושלת endoderm מאוד להביע שפע של גורמי שעתוק כגון FOXA2, SOX17, HNF1B, בני משפחת גאטה, ואת לקולטן CXCR4. עם זאת, פרוטוקולי בידול הם לעתים רחוקות 100% יעילים. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור של אוכלוסיית תא CXCR4 + לאחר התמיינותאל DE באמצעות microbeads מגנטי. טיהור זה גם מסיר תאים של שושלות רצויות. שיטת הטיהור העדינה היא מהירה ואמינה ועשויה לשמש כדי לשפר יישומי differentiations במורד זרם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים כגון תאי גזע עובריים (ESCs) יש את היכולת להתמיין כמעט כל סוג תא בגוף האדם. לפיכך, פרוטוקולים בידול במבחנה יכול לשמש כדי ליצור סוגי תאים בוגרים רבים כגון cardiomyocytes 1, hepatocytes 2, תאי בטא 3, ריאות אפיתל 4 או 5 תאים עצביים. זה עושה ESCs כלי רב ערך לטיפול הפוטנציאל של מחלות ניווניות שונות 3.

בידול במבחנה של ESCs כלפי רקמות בוגרות של ריאות, כבד ולבלב דורש פסאודו gastrulation לתאים מזכיר את האנדודרם סופי (DE) 6. מאז בידול במורד כלפי סוגי תאים ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידול 1. של האדם ESC כלפי האנדודרם המכריע

  1. טפחו את תאי גזע עובריים אנושיים (ESCs) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. מעיל צלחת תרבות 6 היטב סלולרי חדש עם 1 מ"ל של מטריצה ​​קרום במרתף דגירה כלי התרבות למשך 30 דקות לפחות ב RT. לפרטים ספציפיים בבקשה לפנות להוראות היצרן בהתאמה.
  3. ודא ESCs האדם התרבותי יגיע ל -80% -90% confluency תחת מיקרוסקופ באמצעות בהגדלה נמוכה (למשל, 4X). לשאוב את המדיום מהנקבובי ידי מוצצת המדיום עם pipe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם בידול ESCs לעבור שינויים דרסטיים גנים ביטוי חלבון. איור 1 מתאר גנים סמן טיפוסי שניתן להשתמש בהם כדי לאמת בידול האנדודרם מוצלח. מטרות הממשלה עבור ניתוח ביטוי גנים הם GSC, FOXA2, ו SOX17. בניתוח ביטוי גנים ביחס במיוחד FOXA2 ו SOX17 הם עלו ב> 2,000 לקפל בהשוואה ESCs מובחן. GSC כבר מתבטא מאוד מוקדם בתוך 24 שעות במהלך היווצרות פס פרימיטיבי אבל זה בכל זאת מושר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון לעכשיו פרוטוקולי בידול לעתים נדירות לגרום תאים מובחנים 100%. מסיבות שעדיין יש לטפל תאים מסוימים להתנגד לתהליך הבידול. בהתאם את היעילות של פרוטוקול בידול המשמשים ואת הנטייה של ESC קו מספר מסוים של תאים פלוריפוטנטיים שיורית הם נצפו גם בכינויו לאחר בידול לתוך האנדודרם סופי. תאים שיורית אלו עלולים לפגוע differentiations במורד הזרם או ניתוח נוסף כגון transcriptomics, פרוטאומיקה, וניתוח ביטוי מירנה. תאים פלוריפוטנטיים שיורים או שושלות רצויות אחרות עשויים גם להפגין תופעות paracrine .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסיוע הטכני המיומן של יסמין Kresse היא הודתה בהכרת תודה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hues8 קו תאי גזע עובריים אנושייםהמחלקה לתאי גזע וביולוגיה רגנרטיבית של הרווארדקו תאים מתאים לדור אנדודרם
S1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC,אנושי Miltenyi Biotec130-098-357
אנטי-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
מפריד OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109שדה מגנטי
Y-27632Selleck ChemicalsS1049מעכב ROCK
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
מגיב דיסוציאציה עדיןשל תאים טכנולוגיות תאי גזע7174ללא אנזימים פתרון מעבר, אלטרנטיבה: טריפסין/EDTA
Matrigel*קורנינג354277מטריצת ממברנת הבסיס
* לפתור ולאחסן במכסות ב-80 מעלות; C כמפורט במדריך הספקים. לאחר השימוש, יש להפשיר על קרח, לדלל ב-25 מ"ל נוקאאוט קר כקרח DMEM/F-12.
להוסיף 1 מ"ל לכל באר של צלחת של 6 בארות ולדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
יש להסיר את המטריגל ולהשתמש מיד.
MS ColumnsMiltenyi Biotec30-042-201
מפריד MACSMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaaagtggaggtctctggtt		Life טכנולוגיות
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan assayApplied BiosystemsHs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggttgtag		Life Technologies
אדם POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggggagg		טכנולוגיות חיים אנושי
POU5F1 REV
ctgcagtgtgtgtgtttcgggca		טכנולוגיות חיים
נונג אנושי FW
ccgagggcacatcatcc		טכנולוגיות
נונג אנושי REV
ccatccactgccacatcttct		טכנולוגיות
אנושי TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tggt cag tcc agt		g Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg ga g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
CGA TGC TGC GGT TCC AGC CTA T 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& D מערכותAF1924
קו תאי גזע עובריים אנושיים Hes3 ES Cell International קו תאים מתאים וחזק לדור האנדודרם mTeSR1 Stemcell Technologies 5850 מדיום תרבית ESC FCS Biowest חייםחיים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endoderm Cell PurificationHuman Embryonic Stem CellsCXCR4 Positive CellsMagnetic Bead SeparationDefinitive Endoderm DifferentiationFlow Cytometry AnalysisBasement Membrane CoatingROCK Inhibitor SupplementationCell Surface MarkerEndoderm Induction Medium

Related Articles