כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
גורם השעתוק IRF3 הוא קריטי לקו ההגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות β אינטרפרון וביטוי גנים אנטי-ויראלי. ניתוח מפורט של הפעלת IRF3 חיוני כדי להבין כיצד פתוגנים גורמים או מתחמקים מהתגובה האנטי-ויראלית המולדת. ניתן להבחין בין צורות מופעלות מובחנות של IRF3 על סמך הזרחן ומצב המונומר לעומת הדימר שלהן. ניתן להשיג אפליה in vivo בין המינים המופעלים השונים של IRF3 באמצעות הפרדה של צורות זרחניות IRF3 על סמך שינויי הניידות שלהם ב-SDS-PAGE. בנוסף, ניתן לנטר את רמות המונומר והדימר IRF3 באמצעות אלקטרופורזה שאינה דנטוריזה. כאן, אנו מפרטים נוהל כדי להגיע לרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לקבל את מירב המידע לגבי מצב ההפעלה של IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-PAGE מקורי בשילוב עם אימונובלוט באמצעות מספר נוגדנים טוטאליים ופוספוספציפיים. אסטרטגיה ניסיונית זו מהווה גישה משתלמת ורגישה לרכישת כל המידע הדרוש לניתוח מלא של ההפעלה בתיווך זרחון של IRF3.
מבוא
גורם השעתוק הביע כל מקום בגוף וconstitutively אינטרפרון פקטור תקינה 3 (IFN) (IRF3) הוא קריטי עבור קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות הגיוס של IFNβ, אלא גם באמצעות הגיוס של chemokine (מוטיב CC) יגנד 5 (CCL5 ) וכמה חלבונים אנטי כוללים חלבון הנוצר על-IFN עם tetratricopeptide חוזר IFIT1 / 2/3 1-3. הפעלת IRF3 דווחה הזיהום הבא עם וירוסים רבים, או חשיפה לחומצת polyinosinic-polycytidylic (פולי אני: C) או lipopolysaccharide (LPS) 4. חשוב לציין, הווירוסים הנחקרים ביותר התפתחו מנגנונים להתחמק התגובה בתיווך IRF3, ובכך להימלט מארח ההגנה חיסונית מולדת 5. לפיכך, ניטור הפעלת IRF3 הוא בעל חשיבות רבה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול מתואר כאן שימוש בתאי A549 נגוע בוירוס סנדאי (שב). עם זאת, הפרוטוקול לSDS-PAGE ועמוד ילידים גם עובד עם כל סוגי בני האדם ועכבריים התא נבדקו עד כה, במיוחד תאי מיאלואידית מגורה עם 9,15,19,24,25 גירויי הפעלה-IRF3 שונים.
1. זיהום של תאי A549
- שמור על תאי A549 בתרבות בצלחת 15 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס / 5 CO 2% ב 20 מיליליטר F12K / בינוני חם המכיל 10% בסרום חום מומת שור עוברי (HI-FBS) ו -1% L- גלוטמין (F12K מלא / מדיום חם).
הערה: כל ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מציג תמונת immunoblot טיפוסית של IRF3 המזוהה עם נוגדני IRF3 כולל ונוגדני IRF3-phosphospecific נגד Ser396 וSer398 לאחר ההחלטה של WCE ידי רזולוציה גבוהה SDS-PAGE. בתאי A549 unstimulated, IRF3 מזוהה כשתי להקות בגיל 50 ו -53 kDa על SDS-PAGE המתאים (אני טופס)-phosphorylated אינו וhypophosphorylated (הטופס השני) מינים של IRF3. חשיפה של תאי A549 לsev ל3-9 שעות בתוצאות שינוי תלוי זמן להעברה לאט צורות hyperphosphorylated III ו- IV, ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול אנו מתארים כאן מורכב משילוב של רזולוציה גבוהה SDS-PAGE וילידים-עמוד מצמידים את השימוש של כמה נוגדני phosphospecific להבחין I-IV monomeric / dimeric וphosphoforms של IRF3. גילוי נאות של מיני IRF3 אלה הוא חיוני לאפיון הפעלת IRF3 באופן מלא בהגדרה ספציפית. לדוגמא, גירוי LPS של מקרופאגים מופעלים מוביל להיווצרות של IRF3 phosphorylated dimeric, Ser396 / 398 המציגה hypophosphorylated (טופס השני), אבל לא hyperphosphorylated (טופס III ו- IV), דפוס בSDS-PAGE 15. באמצעות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים מודים לחברי המעבדה בעבר ובהווה על פיתוח הפרוטוקולים. העבודה נתמכה על ידי מימון מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) [מענק # MOP-130527] וממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה [NSERC-355306-2012]. NG זכתה בקתדרת מחקר Tier II Canada. AR מחזיקה במלגת לימודים מתוכנית ההכשרה של רשת המחקר לבריאות הנשימה מ-Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | חם ב-37 מעלות; C אמבטיה לפני השימוש. |
| סרום בקר עוברי | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-גלוטמין | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | לתרבית תאים. |
| טריפסין/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| וירוס סנדאי זן קנטל | מעבדות צ'ארלס ריבר | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| גליצרול | ביושופ | GLY001.1 | חותכים את קצה הקצה והפיפט לאט מכיוון שהוא עבה מאוד. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | סימן מסחרי רשום המתאים לחומר ניקוי אוקטילפנוקסי פולי (אתילנאוקסי) אתנול (Nonidet P-40) |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| נתרן פלואוריד | סיגמא-אולדריץ' | 201154 | |
| נתרן אורתוואנדאט | MP ביומדיקל | 159664 | הפעלת נתרן אורתוואנדאט 0.2 מ': 1) הזן את ה-pH ל-10.0 באמצעות 1 N NaOH או 1 N HCl. ה-pH ההתחלתי של תמיסת הנתרן אורתוטוונדאט עשוי להשתנות עם הרבה כימיקלים. 2) התמיסה צהובה ב-pH 10.0. 3) מרתיחים עד חסר צבע. 4) מצננים ל-RT. 5) מכווצים מחדש את ה-pH ל-10.0 וחוזרים על שלבים 3-4 עד שהתמיסה נשארת חסרת צבע ומתייצבת על 10.0. אחסן את הנתרן אורתובנאדט המופעל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. |
| p-ניטרופניל פוספט, דיסודיום מלח הקסהידרט | סיגמא-אולדריץ' | P1585 | |
| בטא-גליצרופוספט | סיגמא-אולדריץ' | G6376 | |
| מגיב לבדיקת חלבון Bio-Rad | ביו-רד | 500-0006 | ציטוטוקסי |
| אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | ציטוטוקסי |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| חומצה הידרוכלורית (HCl) | LabChem | LC15320-4 | עבוד מתחת למכסה המנוע. רעיל ומגרה. |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | ביושופ | SDS001.1 | מרגיז. |
| אמוניום פרסולפט | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | רעיל ומגרה. |
| ברומופנול כחול | פישר סיינטיפיק | B392-5 | |
| בטא-מרקפטואתנול | סיגמא-אולדריץ' | M6250 | עבוד מתחת למכסה המנוע. רעיל למערכת העצבים, ריריות. עלול להיות רעיל לדרכי הנשימה העליונות, לעיניים ולמערכת העצבים המרכזית. |
| גליצין | ביושופ | GLN001.5 | |
| נתרן דאוקסיכולט | סיגמא-אולדריץ | ' D6750 | |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | ביושופ | SHY700 | מרגיז. |
| קרום ניטרוצלולוזה (0.45 מ"מ) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| חומצה אצטית קרחונית | Bioshop | ACE222.4 | עבודה מתחת למכסה המנוע. רעיל, מגרה ודליק. |
| פונסו אדום | סיגמא-אולדריץ' | P3504 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | סיגמא-אולדריץ' | P3911 | להרכב PBS עבור אימונובלוט. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | להרכב PBS עבור אימונובלוט. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | להרכב PBS עבור אימונובלוט. |
| אלבומין סרום בקר | Sigma-Aldrich | A7906 | להרכב PBS-T-BSA לאימונובלוט. |
| חלב יבש ללא שומן | ציפורן | ||
| פולי סורבט 20 (טווין) | MP ביומדיקל | 103168 | חותכים את קצה הקצה והפיפט לאט מכיוון שהוא סמיך מאוד. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | חנות מצוטטת ב -20 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | תוצרת בית19 | Store מצוטט ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | טכנולוגיית איתות תאים | 4947s | חנות ב-20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | תוצרת בית15 | Store נקוב ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה. | |
| אנטי-IRF-3 | מוטיב אקטיף | באורך מלא 39033 | חנות מצוטטת ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה. |
| חנות Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | מצוטטת ב-20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| מכשיר מצלמת CCD LAS4000mini תקני | של GE healthcare | ||
| SDS-PAGE, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store מצוטט ב -20 oC. |
מקורות
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
