הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

11.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24 בינואר 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.

תקציר

גורם השעתוק IRF3 הוא קריטי לקו ההגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות β אינטרפרון וביטוי גנים אנטי-ויראלי. ניתוח מפורט של הפעלת IRF3 חיוני כדי להבין כיצד פתוגנים גורמים או מתחמקים מהתגובה האנטי-ויראלית המולדת. ניתן להבחין בין צורות מופעלות מובחנות של IRF3 על סמך הזרחן ומצב המונומר לעומת הדימר שלהן. ניתן להשיג אפליה in vivo בין המינים המופעלים השונים של IRF3 באמצעות הפרדה של צורות זרחניות IRF3 על סמך שינויי הניידות שלהם ב-SDS-PAGE. בנוסף, ניתן לנטר את רמות המונומר והדימר IRF3 באמצעות אלקטרופורזה שאינה דנטוריזה. כאן, אנו מפרטים נוהל כדי להגיע לרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לקבל את מירב המידע לגבי מצב ההפעלה של IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-PAGE מקורי בשילוב עם אימונובלוט באמצעות מספר נוגדנים טוטאליים ופוספוספציפיים. אסטרטגיה ניסיונית זו מהווה גישה משתלמת ורגישה לרכישת כל המידע הדרוש לניתוח מלא של ההפעלה בתיווך זרחון של IRF3.

מבוא

גורם השעתוק הביע כל מקום בגוף וconstitutively אינטרפרון פקטור תקינה 3 (IFN) (IRF3) הוא קריטי עבור קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות הגיוס של IFNβ, אלא גם באמצעות הגיוס של chemokine (מוטיב CC) יגנד 5 (CCL5 ) וכמה חלבונים אנטי כוללים חלבון הנוצר על-IFN עם tetratricopeptide חוזר IFIT1 / 2/3 1-3. הפעלת IRF3 דווחה הזיהום הבא עם וירוסים רבים, או חשיפה לחומצת polyinosinic-polycytidylic (פולי אני: C) או lipopolysaccharide (LPS) 4. חשוב לציין, הווירוסים הנחקרים ביותר התפתחו מנגנונים להתחמק התגובה בתיווך IRF3, ובכך להימלט מארח ההגנה חיסונית מולדת 5. לפיכך, ניטור הפעלת IRF3 הוא בעל חשיבות רבה להבנת המנגנונים המולקולריים של ההגנה אנטי המארח המולדת, אלא גם לזהות את האסטרטגיה בשימוש על ידי וירוסים כדי לנטרל את התגובה הזאת.

אף אוזן גרון "> דיווחים שפורסמו רבים זאת לספק ניתוח מוגבל של הפעלת IRF3 מבוצעת על ידי הניטור של אינדוקציה גן IRF3-היעד (IFNB1 וIFIT1) ו / או assay גן הכתב בלוציפראז מצמידים ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן ברזולוציה נמוך (SDS- עמוד) ניתוח של IRF3. עם זאת, מחקרים ביוכימיים רבים, ניתוח של ההתנהגות של מוטציות IRF3 שונות והבהרה של מבנה הגבישי IRF3 6-11 תרמו להקמת IRF3 שהוא נתון למערכת מורכבת של שינויים לאחר translational רציפים על ידי זרחון ב אתרים מרובים. הקבוצה של זירחון המעורב בהפעלת IRF3 מופיע להיות תלוי בגירוי וסביר להניח בסוג התא. בתאים נגוע, IRF3 מתקיים כמינים לא-פוספורילציה וhypophosphorylated מכילים phosphoresidues, כולל Thr135 וSer173, ב1 אזור -198 aa N-מסוף 6,12-14. הצטברות של f hypophosphorylated זהORM של IRF3 מושרה על ידי מעוררי מתח, גורמי גדילה וסוכנים הפוגע ב- DNA 6. זירחון של שאריות Ser / Thr באזור C-terminal של IRF3 מכיל תחום transactivation מופעל לאחר הפעלה על ידי וירוסים, פולי אני: C או LPS בתא מסוג אופן תלוי 15-17. זירחון C-מסוף של IRF3 כרוך לא פחות מ -7 אתרי phosphoacceptor שונים מאורגנים בשני אשכולות עיקריים, Ser385 / Ser386 וSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, שכל אחד יתרום להפעלת IRF3 דרך dimerization, הצטברות גרעינית, בשיתוף עם CREB חלבון -binding (CBP) / coactivators P300, DNA מחייב IFN אלמנט תגובה רגיש (ISRE) רצפי קונסנסוס וtransactivation של גני המטרה 9,10,17-19. זירחון של Thr390 הוא חשב גם לתרום להפעלת IRF3 המושרית-וירוס 20. ספקטרומטר מסת מנתח של IRF3 הוכיח כי שאריות Ser386, Thr390, Ser396 וSer402 ישירות phosphorylatאד על ידי מעכבי קינאז של ε κB (IKKε) / קינאז מחייב טנקי 1 (TBK1) קינאז 9,10. זירחון בשאריות C-המסוף נדרש גם להפסקת הפעלת IRF3 דרך polyubiquitination והשפלה בתיווך פרוטאזום 10. תהליך זה תלוי גם בזירחון בSer339, אשר הכרחי לגיוס של isomerase propyl PIN1 10,11. מיני IRF3 מכילים לפחות phospho-Ser339 / 386/396 שאריות נחשבים צורות hyperphosphorylated. הרצף והתפקוד המדויק של כל אתר נשאר עניין של דיון 10,21. עכשיו זה ברור שIRF3 הופעל אינו מייצג מדינה הומוגנית, אבל שמינים שונים מופעלים מציגים מאפייני זרחון או dimerization שונים קיימים 10,22.

כדי לספק הבנה של הפעלת IRF3 שלמה בתגובה לפתוגנים ספציפיים, זה כך צורך CHaracterize שמהמינים מופעלים מושרים. אינדוקציה של גני מטרת IRF3, IFNB1 וIFIT1, הוכיחה לספק קריאה מתוך אמינה להפעלת IRF3. עם זאת, ניטור ביטוי של גנים אלה אינם מבחינים בין מדינות הפעלה השונות של IRF3. ניתוח מקיף של מדינות הפעלת IRF3 בהגדרה מסוימת מסתמך על האפיון מפורט של זירחון וdimerization מעמדו 10. Unphosphorylated (אני צורה), hypophosphorylated (טופס השני) וhyperphosphorylated (צורות III ו- IV) צורות IRF3 6,18,23 ניתן לפתור בהצלחה על ידי ניידות מופחתת בניתוח SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה. מיני IRF3 monomeric וdimeric ניתן לזהות ביעילות על ידי ניתוח ילידים-עמוד. גישות אלה השתפרו מאוד כאשר משתמשים בשילוב עם נוגדני phosphospecific המכוונים נגד אתרי phosphoacceptor IRF3 מובחנים.

פרוטוקולים סטנדרטיים מאפשרים רזולוציה נמוכה שלחלבונים שאינו מאפשרים הפרדה יעילה של צורות phosphorylated IRF3 המובחנת. כאן, אנו מתארים בפירוט הליך כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לפקח על הגיוס של מיני IRF3 שונים המופעל באמצעות וירוס SDS-PAGE מצמידים את ילידים-עמוד בשילוב עם immunoblot באמצעות נוגדנים כולל וphosphospecific. אפליה בvivo בין שונה מופעל צורות של IRF3 מתבצעת על בסיס משמרות הניידות שלהם נצפו על SDS-PAGE. בנוסף, מונומר IRF3 ודימר ניתן להבחין על ידי אלקטרופורזה denaturing שאינו. השילוב של שתי טכניקות משלימות אלה עם immunoblot מוכיח להיות גישה סביר ורגישה לרכוש את כל המידע הדרוש לניתוח של הפעלה בתיווך זירחון של IRF3 מלא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול מתואר כאן שימוש בתאי A549 נגוע בוירוס סנדאי (שב). עם זאת, הפרוטוקול לSDS-PAGE ועמוד ילידים גם עובד עם כל סוגי בני האדם ועכבריים התא נבדקו עד כה, במיוחד תאי מיאלואידית מגורה עם 9,15,19,24,25 גירויי הפעלה-IRF3 שונים.

1. זיהום של תאי A549

  1. שמור על תאי A549 בתרבות בצלחת 15 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס / 5 CO 2% ב 20 מיליליטר F12K / בינוני חם המכיל 10% בסרום חום מומת שור עוברי (HI-FBS) ו -1% L- גלוטמין (F12K מלא / מדיום חם).
    הערה: כל הפתרונות המשמשים לתרבות תא וטיפולים חייבים להיות סטרילי.
  2. בגיל 24 שעות לפני הזיהום, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט שנאגרו מזוקק (D-PBS) ב RT.
  3. הוסף 1 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA לכל צלחת כדי לכסות את התאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  4. לעצור את הדגירה בהקדם התאי דואר להתחיל להתנתק מהצלחת על ידי הקשה על ברכות הצלחת ביד אחת. להשבית טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של F12K בינוני / חם מלא מחומם מראש לכל צלחת ולהעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר.
  5. צנטריפוגה ב 350 XG במשך 3 דקות ב RT. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 8 מיליליטר של F12K בינוני / חם מלא לקבל השעיה תא בודדת הומוגנית.
  6. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. זרעי התאים בצפיפות של 1 x 10 6 תאים לכל צלחת 60 מ"מ ב 4 מיליליטר של F12K בינוני / חם-מחומם מראש מלאה. דגירה של 20-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. לאחר 20-24 שעות, התאים בצורת monolayer ומחוברות 90% (זה מתאים 1.5 x 10 6 תאים).
  7. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של F12K הסרום ללא / בינוני חם (SFM). הוסף 2 מיליליטר של SFM הטרי לצלחת 60 מ"מ.
  8. להפשיר aliquot של נגיף סנדאי (שב) (מאוחסן aliquoted ב -80 ° C) על קרח ובקצרה מערבולת.
  9. לדלל הוירוס דואר בSFM המחומם מראש כדי להשיג 60 HAU / 100 μl. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בשקט ולהוסיף של וירוס מדולל לצלחת 100 μl לבצע את הזיהום ב -40 HAU / 10 6 תאים. אל תוסיף וירוס בצלחת השליטה שאינה נגועה.
  10. דגירה התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. להתסיס את הצלחות ביד 3 או 4 פעמים, או באמצעות ייקר מסלולית או נדנדה אוטומטית ממוקם ישירות בחממה, בשעה הראשונה של זיהום.
  11. בזיהום שלאחר 2 שעות, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום F12K / חם המכיל 20% HI-FBS להשיג ריכוז סופי של 10% HI-FBS.
  12. דגירה התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 לשעת 1, 4 ו -7 נוספת להגיע כוללת פעמים זיהום של 3, 6, ו -9 שעות, בהתאמה. בכל אחד מנקודות הזמן אלה, המשיכו לשלב 2.1.

2. הכנת תמציות תא שלמות (WCE)

  1. הסר את מדיום הזיהום. קציר התאים על ידי גירוד ב 1 מיליליטרשל קר כקרח D-PBS ולהעביר את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות מראש צונן 1.5 מיליליטר.
  2. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ולמזוג בזהירות את כל העקבות של D-PBS.
    הערה: בשלב זה, התא גלולה יכול להיות נתונה ישירות למיצוי חלבון או פלאש-קפוא בחנקן נוזלי או קרח / אמבטיה אתנול יבשה ומאוחסן ב -80 ° C עד תמוגה.
  3. הכן את חיץ תמוגה המכיל 50 מ"מ HEPES pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, גליצרול 10% ו -1% Nonidet P-40 במים ללא יונים (DDH 2 O). Extemporarily להוסיף פרוטאז (1 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin ו -2 מיקרוגרם מיליליטר aprotinin /) מעכבים וphosphatase (פלואוריד נתרן 5 מ"מ, 1 מ"מ מופעל orthovanadate נתרן, פוספט p-nitrophenyl 2 מ"מ ו -10 מ"מ pH β-glycerophosphate 7.5).
    הערה: מאגר תמוגה ללא מעכבים יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. פרוטוקול ספציפי להפעלה של orthovanadate נתרן מתואר בטבלה של חומרים כימיים / Equipme ספציפיNT.
  4. Resuspend התא גלולה ב -70 μl של מאגר תמוגה. בדרך כלל ריכוז lysate יהיה סביב 2 מיקרוגרם / μl.
  5. דגירה על קרח למשך 20 דקות. פלאש-להקפיא את lysate ידי דגירה באמבט חנקן נוזלי במשך 15 שניות. להפשיר lysate ב RT עד שהוא נמס לגמרי ומערבולת למשך 10 שניות. חזור על ההקפאה / הפשרה / מחזור המערבולת 3 פעמים.
    1. לחלופין, לבצע את צעד ההקפאה באתנול / אמבט קרח יבש 1 דקות.
  6. צנטריפוגה ב 16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מעבירים את supernatant (המקביל לWCE) לצינור מראש צונן חדש 1.5 מיליליטר צנטריפוגות. שמור WCE על קרח בכל העת.
  7. לכמת חלבונים באמצעות כל הליך כימות חלבון תואם את מאגר תמוגה כגון מבוסס רדפורד assay חלבון 26.

3. החלטה של ​​WCE ידי הרזולוציה גבוהה SDS-PAGE

  1. הכן שלושה ג'לי אלקטרופורזה denaturing.
    1. לצורך זיהוי של, צורות IRF3 לשפוך שני ג'לים של מינימום של אורך סנטימטר 16 עם ג'ל הפרדה המורכב של 7.5% acrylamide / bis-acrylamide (37.5: 1), 375 טריס-HCl pH 8.8 מ"מ (RT), 0.1% סולפט dodecyl נתרן (SDS ), 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O וג'ל לערום מורכב מacrylamide 4%, 62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT), 0.05% SDS, 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O.
      זְהִירוּת! Acrylamide, TEMED וSDS הם רעילים ו / או גירוי. ללבוש כפפות מגן ולטפל מתחת למכסת מנוע קטר.
    2. , לגילוי של חלבוני sev לשפוך ג'ל אחד מינימום של אורך סנטימטר 8.5 עם מאפיינים דומים לג'ל מתואר ב3.1.1, פרט לכך שג'ל ההפרדה מכיל acrylamide 12%.
  2. לפגל WCE שהושג בשלב 2.6 על ידי הוספת 1: 4 (V / V) מאגר טעינת 5x (125 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ (RT), 10% SDS, 20% (p / גליצרול) נ ', bromophenol 0.0005% כחולים ו 25% β-mercaptoethanol ב DDH 2 O) ואחרי חימום ב 100 מעלותצלזיוס למשך 10 דקות. ספין מהיר הצינורות להפיל את העיבוי שיוצר בכובע.
    זְהִירוּת! β-mercaptoethanol הוא רעיל על ידי שאיפה. ללבוש כפפות מגן ולטפל מתחת למכסת מנוע קטר.
  3. הר ג'לי במנגנון ההגירה. מלא את התאים העליונים ותחתונים עם הפעלת מאגר המכיל 25 מ"מ טריס-בסיס, SDS 0.1% וגליצין 192 מ"מ במים מזוקקים (DH O 2).
  4. עומס 14 μl לסטנדרטים של משקל מולקולרי ובאחד מכל ג'ל 16 סנטימטר ו -7 μl לסטנדרטים של משקל מולקולרי ובאחד של ג'ל 8.5 סנטימטר. עומס 30 מיקרוגרם של WCE מפוגל (שהוכן כמתואר בשלב 3.2) בכל טוב של שני ג'לי מוכן בשלב 3.1.1 לגילוי צורות IRF3. עומס 8 - 10 מיקרוגרם של WCE מפוגל (שהוכן כמתואר בשלב 3.2) לכל היטב על הג'ל מוכן בשלב 3.1.2 לניתוח sev.
  5. הפעל את ג'לי ליום 30 בזרם קבוע mA עד לפני ההגירה מגיע לתחתית של ג'ל.
    הערה: הגירה בדרך כלל נמשכת approximately 3 שעות לג'ל 16 סנטימטר ו- 45 דקות לג'ל 8.5 סנטימטר.
  6. המשך להעברה על גבי קרומי nitrocellulose (שלב 5).

4. ניתוח של IRF3 dimerization ידי ילידים-עמוד

הערה: שיטה זו תוארה לראשונה על ידי הקבוצה של ד"ר ט Fujita 27.

  1. הכן את עליון - (+) מאגרי התא אלקטרופורזה ותחתונים (). חיץ החדר העליון מורכב של 25 מ"מ טריס-HCl pH 8.4 (RT), deoxycholate נתרן 192 מ"מ וגליצין 1% (DOC) בDDH 2 O. חיץ התא התחתון מכיל 25 טריס-HCl pH 8.4 מ"מ (RT) ומ"מ 192 גליצין בDDH 2 O.
    הערה: ניתן לאחסן מאגרי אלקטרופורזה תא העליונים ותחתונים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עם זאת, לוודא שהם מראש לחמם RT לפני ביצוע אלקטרופורזה.
  2. יוצקים ג'ל שאינו denaturing פתרון של מינימום של אורך 8.5 סנטימטר המכיל 7.5% acrylamide / bis-acrylamide (37.5: 1), 375 טריס-HCl pH 8.8 מ"מ (RT), תחמושת 1%persulfate nium ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O.
  3. טרום להפעיל את הג'ל על 40 זרם קבוע mA למשך 30 דקות על קרח. לחץ על מנגנון הריצה לתוך הקרח כ לרמה של חיץ אלקטרופורזה תא התחתון. חשוב שג'ל הוא לא בקרח.
  4. במהלך קדם-טווח, לערבב WCE שמר על קרח עם חיץ טעינת יליד-עמוד 2x 1: (V / V) O. המכיל 125 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT), גליצרול 30% ושל 0.1% bromophenol כחול DDH 2 1
  5. עומס 8 - 10 WCE מיקרוגרם (שהוכן כמתואר בשלב 4.4) מייד בתום הקדם-הטווח.
  6. הפעל את הג'ל על 25 זרם קבוע mA על קרח, כפי שתואר לעיל לטרום הריצה, עד לפני ההגירה מגיע לתחתית של ג'ל (כ -40 דקות).

5. ניתוח immunoblot מינים IRF3

  1. הכן את חיץ ההעברה המכיל 25 מ"מ טריס-בסיס וגליצין 192 מ"מ בDDH 2 O. מכניס למקרר למאגר ההעברה על 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. שלוש חתיכות רטובות של קרום nitrocellulose לחתוך לגודל מעט גדול יותר מג'לים בקופסא פלסטיק / זכוכית המכילה מאגר ההעברה. ציין את הכיוון של הקרום על ידי חיתוך פינה אחת. חיץ ההעברה ניתן לעשות שימוש חוזר 3 פעמים. אחסן את החיץ על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים.
  3. ג'לי (SDS-PAGE וילידים-עמוד) Uncast ולחתוך פינה אחת של כל ג'ל לכיוון נכון.
    1. לילידים-עמוד, דגירה ג'ל ב RT עם תסיסה עדינה במשך לפחות 30 דקות במאגר ריצת SDS-PAGE כדי להסיר את DOC לפני העברתה למאגר שההעברה.
  4. דגירה ג'לי (SDS-PAGE וילידים-עמוד) במאגר ההעברה ל5 - 10 דקות.
  5. הר כריך העברה לג'ל בקלטת העברה עם הקרום כלפי האלקטרודה החיובית (נייר כרית / מסנן קצף / קרום / ג'ל / נייר סינון / משטח קצף). להיות זהיר כדי להסיר את כל הבועות בין השכבות של הכריך.
  6. לבצע את ההעברה כב מומלץy היצרן למנגנון ההעברה משמש.
    הערה: בצע את כל incubations ושוטף בשלבים הבאים על פלטפורמה רועדת נדנדה או מסלולית.
  7. בסופו של זמן ההעברה, דגירה הקרומים במשך 15 דקות בתמיסה המכילות קיבעון 7% חומצה אצטית, 40% אתנול וגליצרול 3% בDDH 2 O. שטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10.2 מ"מ Na 2 HPO 4 ו -1.8 מ"מ KH 2 PO 4 ב DH O 2).
    זְהִירוּת! חומצה אצטית היא רעיל, גירוי ודליק. ללבוש כפפות מגן ולטפל מתחת למכסת מנוע קטר.
    הערה: פתרון הקיבעון ניתן לעשות שימוש חוזר מספר רב של פעמים.
  8. לילידי הקרום-עמוד להמשיך ישירות לשלב 5.11.
  9. יש לשטוף שלושה קרומי SDS-PAGE במהירות בDH 2 O לפני דוגרים אותם דקות 1 בפתרון Ponceau אדום המכיל 6.57 מ"מ Ponceau האדום ו -1% חומצה אצטית בDDH 2 O.
    הערה: פתרון Ponceau האדום יכול להיות r eused מספר פעמים.
  10. יש לשטוף את הקרומים בDH 2 O עד שהרקע הוא לבן מספיק כדי לראות את להקות החלבון מוכתמות באדום. שים לב לסמנים בעיפרון ולחתוך את הקרום העודף סביב החלבונים. Destain הקרומים ידי דגירה במשך 5 דקות בPBS תחת תסיסה.
  11. דגירה ממברנות עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C. בפתרון החסימה (PBS המכיל 0.05% Tween 20 וחלב יבש 5% דלי שומן (PBS-T-חלב). לשטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS-T.
    הערה: לשטוף PBS-T הוא אופציונאלי ורק הנדרש במדוקדק בעת החלת נוגדנים מדולל PBS-T המכיל 5% אלבומין בסרום שור (PBS-T-BSA) (איור 1 וטבלה 1) בשלב הבא.
  12. דגירה ארבעה קרומים (מSDS-PAGE וילידים-עמוד) עם הנוגדנים העיקריים לפי הסדר רציף המפורט באיור 1 וטבלה 1. בצע 5x 5 שטיפות דקות ב PBS-T.
"> figure-protocol-1
רצף איור 1. ניתוח immunoblot. סכמטי מתאר את ג'לי SDS-PAGE וילידים-עמוד האישי הנדרש כדי לזהות צורות פוספורילציה וmonomeric / dimeric IRF3 השונות. סדר המסוים של נוגדנים להחיל את הקרום כתוצאה מכל ג'ל בהליך immunoblot מתואר. שים לב שהנוגדנים נגד אקטין משמשים ראשון כדי להבטיח טעינה שווה של הדגימות לפני החלת נוגדנים ספציפיים אחרים. הרצף החלופי, עם נוגדנים נגד אקטין מיושם לאחר הנוגדנים נגד phospho-IRF3, גם עובד. הפשטה משמשת בין אנטי-אקטין ואנטי-sev נוגדנים, או בין אנטי-phospho-IRF3 ונוגדנים נגד IRF3 בגלל חפיפת גודל של האותות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נגד ארנב
נוגדנים ראשוניים מְהִילָה חיץ דילול דְגִירָה נוגדנים משני תגובות
אנטי-אקטין 1 / 10,000 PBS-T-BSA 15 דקות ב RT אנטי עכבר השתמש לאחר SDS-PAGE
ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול antibodyies כמה פעמים אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד.
אנטי-IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N ב 4 ° C נגד ארנב השתמש לאחר ילידים-עמוד.
לא מומלץ לשימוש חוזר נוגדן המדולל
אנטי-IRF3-P-Ser396 1 / 10,000 PBS-T-BSA O / N ב 4 ° C השתמש לאחר SDS-PAGE.
לא מומלץ לשימוש חוזר אנטי-IRF3-P-396 נוגדן המדולל זמינים גם איתות תא. דילול אופטימלי הוגדר כ1 / 1000 לנוגדן זה, אבל עשוי להשתנות בין המון.
אנטי-IRF3-P-Ser398 1 / 10,000 PBS-T-BSA O / N ב 4 ° C נגד ארנב השתמש לאחר SDS-PAGE. לא מומלץ לשימוש חוזר נוגדן המדולל
באורך מלא אנטי-IRF3 1/7500 PBS-T-חלב 3 שעות ב RT נגד ארנב השתמש לאחר SDS-PAGE. נוגדן באורך מלא אנטי-IRF3 ניתן להשתמש לאחר ילידים-עמוד, אבל זה פחות רגיש כדי לזהות מונומר. ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול נוגדנים כמה פעמים אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד.
אנטי-IRF3-NES 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS-T-חלב 3 שעות ב RT נגד ארנב השתמש לאחר ילידים-עמוד. ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול antibodyies כמה פעמים אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד.
אנטי-sev 1 / 14,000 PBS-T-BSA 3 שעות ב RT נגד ארנב השתמש לאחר SDS-PAGE. ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול antibodyies כמה פעמים אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד.
הערה: דילול וחיץ המשמש לנוגדנים משני מצמידים HRP צריכים להיות מותאם כפי שמשתנה מחברה אחת לשנייה.
.within עמודים = "1">

1. מפרט השולחן של נוגדנים המשמש בהליך immunoblotting.

  1. דגירה הקרומים עם peroxidase החזרת (HRP) -conjugated נוגדנים משני כמפורט באיור 1 וטבלה 1. שטוף את הקרומים 5x 5 דקות ב PBS-T, ואחרי 5 דקות ב2x PBS להסיר באופן מלא עקבות של Tween.
  2. דגירה ממברנות דקות 1 בנפח של מגיב chemiluminescence המשופר מספיק כדי לכסות באופן מלא את הקרומים. ייבש את הקרומים באמצעות נייר סינון.
  3. מניחים את הקרומים במנתח תמונה זורח לדמיין להקות immunoreactive.
    1. לחלופין, לבצע זיהוי של להקות immunoreactive באמצעות צילומי רנטגן רגישים.
  4. שטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS.
    הערה: בשלב זה יכול להיות כל הזמן יבש הקרומים. עם זאת, אם נדרשת הפשטה נוספת, עדיף לבצע את ההפשטה לפני ייבוש הקרום. קרומים גם יכולים להיות מאוחסנים במשך קצר-טווח ב- PBS.
  5. לקרומים שאינם דורשים הפשטה בין הדגירה עם נוגדנים (ראה איור 1) להמשיך ישירות לשלב5.20.
  6. כאשר הפשטה נדרשת בין נוגדנים (ראה איור 1), דגירה ממברנות בטרום חימם תמיסה המכילה 2% SDS, 62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT) ושל 0.7% β-mercaptoethanol DDH 2 O הפשטה על 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות תחת תסיסה רגילה. שטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS.
    הערה: התסיסה במהלך הליך הפשטה היא מפתח. הפשטה יכולה להתבצע בתנור הכלאה. לחלופין, הפשטה יכול להתבצע באמצעות ממברנות אטומות בשקיות פלסטיק ושקועות באמבט מים. במקרה זה, חשוב כדי להתסיס את הקרומים 4 - 5 פעמים במהלך הדגירה.
  7. דגירה ממברנות עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C ב PBS-T-חלב.
  8. חזור על שלבים 5.12-5.16 פי איור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2 מציג תמונת immunoblot טיפוסית של IRF3 המזוהה עם נוגדני IRF3 כולל ונוגדני IRF3-phosphospecific נגד Ser396 וSer398 לאחר ההחלטה של WCE ידי רזולוציה גבוהה SDS-PAGE. בתאי A549 unstimulated, IRF3 מזוהה כשתי להקות בגיל 50 ו -53 kDa על SDS-PAGE המתאים (אני טופס)-phosphorylated אינו וhypophosphorylated (הטופס השני) מינים של IRF3. חשיפה של תאי A549 לsev ל3-9 שעות בתוצאות שינוי תלוי זמן להעברה לאט צורות hyperphosphorylated III ו- IV, ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול אנו מתארים כאן מורכב משילוב של רזולוציה גבוהה SDS-PAGE וילידים-עמוד מצמידים את השימוש של כמה נוגדני phosphospecific להבחין I-IV monomeric / dimeric וphosphoforms של IRF3. גילוי נאות של מיני IRF3 אלה הוא חיוני לאפיון הפעלת IRF3 באופן מלא בהגדרה ספציפית. לדוגמא, גירוי LPS של מקרופאגים מופעלים מוביל להיווצרות של IRF3 phosphorylated dimeric, Ser396 / 398 המציגה hypophosphorylated (טופס השני), אבל לא hyperphosphorylated (טופס III ו- IV), דפוס בSDS-PAGE 15. באמצעות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לחברי המעבדה בעבר ובהווה על פיתוח הפרוטוקולים. העבודה נתמכה על ידי מימון מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) [מענק # MOP-130527] וממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה [NSERC-355306-2012]. NG זכתה בקתדרת מחקר Tier II Canada. AR מחזיקה במלגת לימודים מתוכנית ההכשרה של רשת המחקר לבריאות הנשימה מ-Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
F12/HamLife Technologies11765-054חם ב-37 מעלות; C אמבטיה לפני השימוש.
סרום בקר עובריLife Technologies12483-020
L-גלוטמיןLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144לתרבית תאים.
טריפסין/EDTA 0.25%Life Technologies25200-072
וירוס סנדאי זן קנטלמעבדות צ'ארלס ריבר600503
HepesBioshopHEP001
נתרן כלורי (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
גליצרולביושופGLY001.1חותכים את קצה הקצה והפיפט לאט מכיוון שהוא עבה מאוד.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771סימן מסחרי רשום המתאים לחומר ניקוי אוקטילפנוקסי פולי (אתילנאוקסי) אתנול (Nonidet P-40)
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 
נתרן פלואורידסיגמא-אולדריץ'201154
נתרן אורתוואנדאטMP ביומדיקל159664הפעלת נתרן אורתוואנדאט 0.2 מ': 1) הזן את ה-pH ל-10.0 באמצעות 1 N NaOH או 1 N HCl. ה-pH ההתחלתי של תמיסת הנתרן אורתוטוונדאט עשוי להשתנות עם הרבה כימיקלים. 2) התמיסה צהובה ב-pH 10.0. 3) מרתיחים עד חסר צבע. 4) מצננים ל-RT. 5) מכווצים מחדש את ה-pH ל-10.0 וחוזרים על שלבים 3-4 עד שהתמיסה נשארת חסרת צבע ומתייצבת על 10.0. אחסן את הנתרן אורתובנאדט המופעל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
p-ניטרופניל פוספט, דיסודיום מלח הקסהידרטסיגמא-אולדריץ'P1585
בטא-גליצרופוספטסיגמא-אולדריץ'G6376 
מגיב לבדיקת חלבון Bio-Rad ביו-רד500-0006 ציטוטוקסי
אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (37.5 : 1) 40%BioshopACR005 ציטוטוקסי
Tris-BaseBioshopDEO701
חומצה הידרוכלורית (HCl)LabChemLC15320-4 עבוד מתחת למכסה המנוע. רעיל ומגרה.
נתרן דודציל סולפט (SDS)ביושופSDS001.1 מרגיז.
אמוניום פרסולפטSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010רעיל ומגרה.
ברומופנול כחולפישר סיינטיפיקB392-5
בטא-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M6250עבוד מתחת למכסה המנוע. רעיל למערכת העצבים, ריריות. עלול להיות רעיל לדרכי הנשימה העליונות, לעיניים ולמערכת העצבים המרכזית.
גליציןביושופGLN001.5
נתרן דאוקסיכולטסיגמא-אולדריץ' D6750
נתרן הידרוקסיד (NaOH)ביושופSHY700 מרגיז.
קרום ניטרוצלולוזה (0.45 מ"מ)Bio-Rad162-0115
חומצה אצטית קרחוניתBioshopACE222.4עבודה מתחת למכסה המנוע. רעיל, מגרה ודליק.
פונסו אדוםסיגמא-אולדריץ'P3504   
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ'P3911 להרכב PBS עבור אימונובלוט.
Na2HPO4BioshopSPD307.5להרכב PBS עבור אימונובלוט.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 להרכב PBS עבור אימונובלוט.
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA7906להרכב PBS-T-BSA לאימונובלוט.
חלב יבש ללא שומןציפורן
פולי סורבט 20 (טווין)MP ביומדיקל103168חותכים את קצה הקצה והפיפט לאט מכיוון שהוא סמיך מאוד.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783חנות מצוטטת ב -20 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.
Anti-IRF-3-P-Ser396תוצרת בית19Store מצוטט ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)טכנולוגיית איתות תאים4947sחנות ב-20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398תוצרת בית15Store נקוב ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.
אנטי-IRF-3מוטיב אקטיףבאורך מלא 39033חנות מצוטטת ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.
חנות Anti-IRF3-NESIBL-America18781מצוטטת ב-20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
מכשיר מצלמת CCD LAS4000mini תקנישל GE healthcare
SDS-PAGE, Broad RangeBio-Rad161-0317Store מצוטט ב -20 oC.
, , , משקל מולקולרי

מקורות

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IRF3SDS PAGENative PAGE
רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.