הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של CD146

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53782

⸱

17 ביוני 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר טכניקת בידוד לקבלת תאי סטרומה mesenchymal תושב ריאה הראשית של חולדות, באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, דבקות פלסטיק CD146 + מבחר חרוז מגנטי.

תקציר

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. יתר על כן, יש להם סיכוי תפקיד בהתפתחות איבר רגיל, יוחסו תפקידי מחלה, במיוחד אלה עם אופי fibrotic. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה. טכניקת הבידוד המתוארת כאן חלה מאפיינים מרובים של MSCs תושב ריאות (L-MSCs). עם הקרב של החולדות, ריאות יוסרו ושטף מספר פעמים כדי להסיר דם. בעקבות ניתוק מכני על ידי אזמל, הריאות מתעכלים במשך 2-3 שעות תוך שימוש בתמהיל שאני סוג collagenase, פרוטאז נייטרלי ואני סוג DNase obtaineהשעית תא בודד ד נשטפה לאחר מכן ו שכבתית מעל בינוני שיפוע צפיפות (צפיפות 1.073 גרם / מיליליטר). לאחר צנטריפוגה, תאים מן שלבי נשטפים מצופים צלוחיות תרבות שטופלה. הם תאים בתרבית עבור 4-7 ימים פיזיולוגיים 5% O 2, 5% CO 2 תנאים. כדי לרוקן פיברובלסטים (CD146 -) ולהבטיח אוכלוסייה של L-MSCs בלבד (CD146 +), סלקציה חיובית עבור תאי CD146 + מתבצע באמצעות מבחר חרוז מגנטי. לסיכום, הליך זה באופן מהימן מייצרת אוכלוסייה-MSCs L העיקרי למחקר נוסף במבחנה ומניפולציה. בגלל האופי של הפרוטוקול, זה יכול להיות מתורגם בקלות במודלים של בעלי חיים ניסיוניים אחרים.

מבוא

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. במהלך הפיתוח, לרבות הריאות, mesenchyme מהווה מקור חשוב של רמזים התפתחותית, ו MSCs תושב מועמד סביר להיות במרכז זה. יתר על כן, ראיות המתעוררים MSCs התושב מוטרדים במחלות מבוגרות, כולל 1,2 הסרטן ו -3 סיסטיק. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה 4. תא גזע אנטיגן-1 (SCA-1) זוהה בעכברים כסמן עבור מגוון רחב של תאי גזע רקמות, והוא יכול לשמש עבור בידוד של L-MSCs 5, אבל יש לצערילא ידוע orthologs במינים אחרים 6. חוקר דיווחתי במגוון שיטות בידוד שונה עבור בידוד של L-MSCs משתי רקמת ריאה או נוזל. אלה משתנה מתא מופעל קרינת מיון (FACS) שיטות המבוסס בחירה עבור CD31 - / CD45 - / CD90 + תאי 7, CD31 - / CD45 - / מולקולת הידבקות תא אפיתל (EpCAM) - / SCA-1 + תאי 8, התנגדות multidrug טרנספורטר ATP מחייבת קלטת G (ABCG2) תאים חיוביים 9 או בזרימה לצבוע Hoechst 33342 10, כדי דבקות פלסטיק 11,12 והגירה מתוך רקמות טחונות 13.

היתרונות של שיטה המוצגת במסמך זה הוא פי כמה וכמה. באמצעות עיכול אנזימטי עדין שיפוע צפיפות 14, אחד מקבל את כל התאים של טווח צפיפות הכוללים MSCs אך אינם כוללים תאי אפיתל או האנדותל. הצעד הדבק הפלסטיק הבא מבטיח רק כי mesenchתאי ymal לדבוק ולהישאר בתרבות, ביטול לויקוציטים. והכי חשוב עם זאת, בשלב של בחירת CD146 + מאפשר החיסול פיברובלסטים, כמו תאים אלה אינם מבטאים CD146. ביטוי של מולקולת הידבקות תא CD146 מתואם חיובי עם multipotency, ולכן הוא סמן טוב על מנת לשרש פיברובלסטים מאוכלוסיית תא mesenchymal 15-19. זהו יתרון על פני שימוש CD90 כסמן בחירה, כפי שהוא לא מתבטא רק MSCs אלא גם lipofibroblasts 5,20. בפרוטוקול זה בחרנו במפורש מבחר חרוז מגנטי, כפי שהוא עדין על התאים, ואת ההליך כולו יכול להיעשות בתנאים סטריליים. יתרון חשוב נוסף של שיטת הבידוד הזה בניגוד לשיטת התולדה, הוא שזה מהיר יחסית, 6-10 ימיםלעומת חודש או יותר לשיטת התוצאה. שלושה עד חמישה ימים לאחר הבידוד הראשוני אוכלוסיית mesenchymal מוכנה CD146 + Sele גודל ction; לאחר שלושה עד חמישה ימים אחר התאים + CD146 מוכנים לשמש בניסויים או אפשר להקפיא לשימוש מאוחר יותר. שעת תרבות הירד משפרת את איכות התאים כמו MSCs transdifferentiate כלפי פיברובלסטים בתרבות לשעבר ממושך vivo 19. לבסוף, בשל אופיו של פרוטוקול, אפשר ליישם את השיטה כדי מינים אחרים על ידי בחירת נוגדנים מתאימים, או אפילו מערכות איברים אחרות על ידי התאמת הבחירה של אנזימים לעיכול זמן דגירה.

פרוטוקול מפורט של שיטת הבידוד הזה הוא כדלקמן, וכן סקירה סכמטית של הבידוד והבחירה הבאה של תת-האוכלוסייה + CD146 מסופקת באיור 1A ו -1 B בהתאמה. בנוסף, פרטים כלולים עבור passaging, הקפאה להפשרה תאים אלה.

המודעה / 53,782 / 53782fig1.jpg "/>
באיור 1. סקירה סכמטי של בידוד של תאים mesenchymal ריאתי (א) ו CD146 עוקבות + בחירת תא (B) מינ '= דקות.; EDTA = חומצה Ethylenediaminetetraacetic; 2 nd Ab = נוגדנים משני; אלפא-CD146 Ab = העיקרי נוגדן אנטי CD146; תאי -ve = CD146 תאים שליליים; + יש תאים = תאים חיוביים CD146. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אוטווה (פרוטוקול אתיקה חיה Ohri-1696). טיפול בחיות בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות.

1. בידוד של תאים סטרומה mesenchymal ריאות

  1. מכינים את תערובת האנזים בתוך שפופרת 50 מ"ל: לשקול 30 פרוטאז U Neutral, 2,500 U Collagenase ואני 500 U DNAse I. סכומים אלו להספיק הריאות של עכבר בוגר או גור חולדה. כן ביום של בידוד ולאחסן ב 4 ° C עד שימוש.
  2. גורי חולדה הקורבן ביום 13 על ידי הזרקה תוך הצפק של נתרן pentobarbital (0.2 מ"ל, 65 מ"ג / מ"ל). השתמש רפלקס קמצוץ הבוהן להקים הכרה. מוות של חיה מובטח על ידי פתיחת חזה, כמפורט להלן.
  3. לטהר את העור על ידי ריסוס החיה עם 70% אתנול ו בזהירות לפתוח את בית החזה באמצעות מספריים כירורגיות, החל מהשעה הסרעפת חיתוך כלפי הצד מקורי, נזהר מאוד לאלפגוע ריאות. מורחים את בית החזה פתוח באמצעות מלחציים עוצר דמום, או לחילופין לחתוך את בית החזה כדי לספק גישה החזה.
  4. ולגרום לדימום מחודש את החיה על ידי הסרת הלב. כדי להסיר את הלב, לתפוס את התימוס והלב עם מלקחיים קטנים וחותכים ממנו אלה עם מספריים כירורגיות. מייד לאחר מכן, לספוג את הדם עם תחבושת עד אין יותר דם יוצא של האאורטה הכרותה ואת עורק הריאה.
  5. הסר את הריאות מן החזה כדלקמן: להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים קטנים, ואז לנתק את קנה הנשימה עם מספרי כירורגיות בצד המקורי. תוך משיכת החבילה ריאות בעדינות מתוך בית החזה, לחתוך את כל רקמת החיבור בצד הגבי לאורך בית החזה כדי לשחרר את הריאות.
  6. לנתק את הריאות מן האאורטה והוושט ידי חיתוך לאורך הסרעפת עם מספריים כירורגיות. עכשיו כי ריאות חופשיות לחלוטין מן החזה להסיר כל דם שנותר בעדינות עם גזה.
  7. הסר את קנה הנשימה הסמפונות עם surgical מספריים ובזהירות להעביר האונות ריאות לצינור 50 מ"ל המכיל קר 35 מ"ל 30% ציטראט-פוספט דקסטרוז אדנין (CPDA-1) נוגד קרישה (מימית ציטראט Trisodium 26.30 גרם, 3.27 גרם מונוהידראט חומצה אסקורבית, 2.22 גרם פוספט dihydrogen גלוטמט, 31.80 גרם D- גלוקוז, 0.275 גרם אדנין ב 1 L מטוהרים H 2 O; סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש) ב בופר פוספט (PBS) כדי להסיר דם ופסולת.
  8. לאחר השטיפה 5 דקות ב -30% CPDA-1 / PBS, להעביר את הריאה לצינור חדש 50 מ"ל המכיל 35 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS) (RT), להפוך בעדינות כדי להסיר ציטראט. העברה אל צינור המכיל 35 מ"ל + PBS של Dulbecco נתרן-פירובט + גלוקוז (DPBS ++) (RT). כל שלב שטיפה אמור לקחת בערך 5 דקות.
    הערה: DPBS ++ ניתן להזמין מסחרית או מורכב כדלקמן 21: סידן כלוריד dihydrate 132.4 מ"ג, hexahydrate מגנזיום כלוריד 100 מ"ג, אשלגן כלורי (נטול מים) 200 מ 'g, monobasic פוספט אשלגן (נטול מים) 200 מ"ג, נתרן כלורי (נטול מים) 8,000 מ"ג, dibasic פוספט נתרן (נטול מים) 1,144.5 מ"ג, מ"ג D- גלוקוז 1000, פירובט נתרן 36 מ"ג L 1 7.3 מטוהרים H 2 O, pH. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  9. ממיסים את תמהיל האנזים על ידי הוספת 10 מ"ל DPBS ++ (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ואת היפוך בעדינות עד שהיא נמסה.
  10. מעבירים את הריאות לצינור 50 מ"ל חדש וקוצצים את הריאות על הקיר של הצינור באמצעות אזמל עד טחון דק. מוסיפים את תערובת אנזים לרקמה (10 מ"ל תערובת אנזים / לכל עכבר מבוגר / הגור עכברוש ריאות), לסגור את הצינור בחוזקה לדגור על 38 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה (או במיקסר תרמית, באמבט מים רועד, או מים אמבטיה עם תסיסה ידנית קבוע). המשך תלוי בסוג של רקמות: דקות 60 רקמות עוברות, הדקה לנוער / מבוגרי רקמות 90-120, רקמה הבוגרת fibrotic 120-150 דקות.
  11. עצור את מערכת העיכול על ידי chelating קטיונים דו ערכי wה- i 200 μl ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA, 0.15 M, pH 7.4. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש).
  12. הוסף 20 מ"ל 5% בסרום שור עוברית (FBS) / PBS ולהעביר את ההשעיה כולו דרך מסננת 100 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ"ל. יש לשטוף את מסננת צינור ותא עם 10 מ"ל 5% FBS / PBS, מביא את הנפח הכולל עד 40 מ"ל.
  13. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 XG, RT.
  14. הסר את supernatant (גלולה צריך להיות ברור לעין), resuspend ב 40 מ"ל 5% FBS / PBS וחזור על שלב צנטריפוגה 1.13.
  15. Resuspend ב FBS 4 מ"ל 5% / PBS (RT) ואת שכבת בזהירות מעל 3 מדיה שיפוע צפיפות מ"ל (1.073 g / ס"מ 3) בצינור 15 מ"ל 14. לקבלת שלבים טובים, חשוב כי השכבות של השעית התא הבודדה מתרחשות בזווית> 45 ° במהירות מאוד נמוכה.
  16. צנטריפוגה 20 דקות ב 900 XG, בינוני (5/10) תאוצה, לא האטה, 19 ° C.
  17. אוספים את התאים המצויים בterphase resuspend אותם 10 מ"ל סטרילי PBS.
  18. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 XG, 21 ° C.
  19. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל בינוני תרבות מחומם מראש הושלמה L-MSC (Eagle התקשורת חיוני מינימום, שינוי אלפא (αMEM), בתוספת 2 מילימול L-גלוטמין לכל 500 מ"ל αMEM, 20% בנפח / FBS כרך ו -1% כרך / כרך פניצילין / סטרפטומיצין / Amphotericin ב
  20. 1.18 צעד צנטריפוגה חוזר. בהמשך לכך, הסר supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל מחומם מראש בינוני תרבות טריים.
  21. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי צלחת בצפיפות גבוהה, שכן רוב התאים בשלב זה הם לא חסיד פלסטיק. צפיפות הציפוי מדויקת תלוי מזני חי הגיל, למשל, תאים של ריאות עכבר בוגרות הם זורעים ב 10 5 תאים / 2 סנטימטר, ואילו תאים מפני ריאת גור עכברוש הם צפופים מספיק בצפיפות זריעה של 1-2 x 10 4 תאים / 2 ס"מ . השתמש 0.2 מ"ל בינוני תרבות L-MSC / 2 ס"מ.
  22. L-MSCs תרבות באווירה 5% O 2, 5% CO 2 humidified על 37 מעלות צלזיוס.
  23. שנה בינונית 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית, ולאחר מכן כל 3 ימים אחרי שטיפת פעם עם PBS. תאים צריכים להיות מתורבת עד 80-90% המפגש, אשר לוקח 3-5 ימים בממוצע תלוי החיה המוצא. מפגש גבוה יקדם בידול לתוך פיברובלסטים.

בחירת 2. של CD146 + mesenchymal ריאות סטרומה תאים

  1. ציפוי של חרוזים מגנטיים עם נוגדנים משני
    1. מעיל חרוזים מגנטיים עם נוגדנים משני biotinylated, ביחס של 10 מיקרוגרם חרוזים משני נוגדן / 100 μl מגנטי בתוך תחתית עגולה 2 סטרילי מ"ל cryovial בתנאים סטריליים. השתמש 10 μl נוגדנים משני לכל צפוי 0.5 x 10 6 תאים, ולהשתמש מינימום של 100 μl חרוזים מגנטיים 10 נוגדן מיקרוגרם.
      הערה: היחס שלtibodies בשימוש לכל נפח של חרוזים עשויים להיות שונים בין יצרנים, יש לבדוק את הוראות היצרן עבור החרוזים של בחירה. עבור פרוטוקול זה, עיין בטבלה 1 עבור חרוזים ונוגדנים ששימשו אופטימיזציה של פרוטוקול זה.
    2. דגירה במיקסר מדגם סיבוב במשך 30 דקות ב 30 סיבובים / min (סל"ד), ב RT.
    3. Resuspend את החרוזים 1.5 מ"ל אלבומין 0.1% סטרילי בסרום שור (BSA) / PBS ולהעביר צינור עגול 3 מ"ל התחתונה (cytometry זרימה בצינור). שוטפים את cryovial עם 0.1% BSA / PBS 1.5 מ"ל נוספים ולהעביר אל הצינור 3 מ"ל.
    4. מניחים את הצינור על מגנט המתאים ולהמתין 2 דקות עד שכל חרוזים מחוברים אל הקיר האחורי של הצינור והפתרון שרידים ברורים. הסר לשטוף נגר וחזור עם 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS פעמיים.
    5. Resuspend את החרוזים 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור. יש להשתמש תוך 5 ימים.
  2. תוויות CD146 + L-MSCs
    1. קציר תאי mesenchymal לאחר השטיפה עם PBS באמצעות פתרון שאינו טריפסין עדין.
      הערה: כרכים תלוי בגודל של בקבוק תרבות (0.2 מ"ל / ס"מ 2 בינוני או PBS).
      1. הסר בינוני תרבות לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS סטרילית.
      2. להוסיף נפח מתאים של פתרון שאינו טריפסין עדין (ראו טבלה 1). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה עד התאים יש המנותקים, כ 10 דקות בעת שימוש הפתרון בטבלה 1.
      3. להשבית את האנזים על ידי הוספת בינוני תרבות L-MSC, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 500 x.
    2. הסר supernatant, תאי resuspend ב 0.1% BSA / PBS ולספור את התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
      הערה: נפח של 0.1% BSA / PBS תלוי בגודל של בקבוק תרבות: לשאוף 5 או 10 מ"ל 0.1% BSA / PBS.
    3. חזור על שלב 2.2.2 ו resuspend הסכום הייעודי של התאים 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS (בלוקים unאתרי קישור ספציפיים שומר על התאים בחיים). שמור את התאים על הקרח.
    4. כן 3 מיליליטר עגול צינור תחתון עם הנוגדן אנטי CD146 העיקרי, ולשמור על קרח.
      הערה: ריכוז הנוגדן ראשוני זה יתווסף הסכום הייעודי של תאים תלויים הנוגדן המשמש. עבור נוגדן CD146 אנטי עכברוש הציע ר 'טבלה 1.
    5. מוסיף את הנפח הכולל של תאים משלבים 2.2.3 אל צינור עם הנוגדן הראשוני. סוגרים היטב דגירה 30 דקות על מיקסר מדגם מסתובב ב 15 סל"ד, 4 ° C.
    6. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 500 XG, 4 ° C, להסיר תא גלולה supernatant ו resuspend ב 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS. צעד צנטריפוגה חוזר.
    7. Resuspend התאים הפתרון 3 מ"ל המכילה חרוזים משני מצופה נוגדן שהוכן על פי ההוראות בסעיף 2.1 ו דגירה 30 דקות על מיקסר מדגם מסתובב ב 15 סל"ד, 4 ° C.
  3. בחירת CD146 + L-MSCs
    1. מניחים את הצינור המכיל את שכותרתו CD146 + L-MSCs על המגנט. התאים החיוביים יצוירו לחלק אחורי של צינור. מבלי להזיז את הצינור או נגיעה החרוזה, לקצור את supernatant עם התאים שהליליים לאט עם פיפטה פסטר סטרילית (אלה יכולים להיות שנאספו או מושלכים מבוססים על עיצוב ניסיוני).
    2. הסר את הצינור מתוך המגנט resuspend התאים BSA 3 מ"ל 10% / PBS. חזור על הליך הבחירה מתואר בשלב 2.3.1. ארבע פעמים יותר (צעדי בחירת Σ 5).
    3. Resuspend את CD146 + L-MSCs במדיום תרבות מחומם מראש L-MSC ולחזור המגנט.
    4. הסר supernatant, resuspend במדיום תרבות L-MSC צלחת בתוך בקבוק תרבות בגודל מתאים (0.2 מ"ל / 2 ס"מ). ככלל אצבע, תאי צלחת בבקבוק אותה תרבות הגודל שממנו התאים הוסרו לפני בחירת חרוז. מספר CD146 + L-MSCs, ולכן צפיפות ציפוי, יהיהתלוי בגיל, מין ומתח של החיה מקור. תמיד לשאוף צפיפות ציפוי של ~ 5,000 תאים / 2 ס"מ.
      הערה: החרוזים לא יפריע גדילת התא ייעלמו בהדרגה כמו התאים להתרבות.

3. תאים מקפיאים

  1. השתמש בתקשורת ההקפאה הבאה: 60% פתרון pentastarch (pentastarch 10% ב 0.9% NaCl), 20 FBS%, 12.5% ​​CPDA-1, 2.5% NaCl (0.9%), sulfoxide דימתיל 5% (DMSO) 22.
    הערה: אם לא כל החומרים זמינים, בתמיסה המכילה DMSO 5%, 30% FBS ו 65% αMEM היא אלטרנטיבה טובה.
  2. תאים Resuspend ב 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל, aliquot ב cryovials של 1 מ"ל כל ולהקפיא O / N ב -80 ° C באמצעות מיכל הקפאה.
  3. מעבירים מיכל אחסון חנקן נוזלי למחרת.

4. תאי פשרה

  1. להפשיר בקבוקון של תאים בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. תאים Resuspend ב 10 מ"לבינוני ו צנטריפוגות התרבות מחומם מראש במשך 5 דקות ב 500 XG, 21 ° C.
  3. הסר supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום תרבות 10 מ"ל. תאי זרע בתוך תרבית תאים כובע פרקו מטופלים צלוחיות ב 5000 תאים / 2 ס"מ במדיה 0.2 מ"ל / cm2 (למשל, 15 מ"ל עבור בקבוק 75 ס"מ 2).
  4. התרבות תאים ב 5% O 2, 5% CO 2 עד ומחוברות 80-90% לקציר ו / או שימוש ניסיוני. יתר confluency יהיה להשרות התמיינות. כאשר זריעה ב 5000 תאים / 2 ס"מ, L-MSCs יגיעו 80-90% confluency בתוך 3-4 ימים של תרבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שניים מן המאפיינים הפיזיים הכי אמין של MSCs, צפיפות ודבקות פלסטיק, משמשים בחלק הראשון של פרוטוקול זה כדי לקבל את החלק היחסי תא mesenchymal של הריאה המכיל L-MSCs. למרות שלבי שיפוע הצפיפות יכללו מונוציטים ומקרופגים בנוסף לתאי mesenchymal ריאות, דבקות הפלסטיק ואחריו 3-5 ימים של תרבות מבטיחה רק כי תאי mesenchymal הריאות להישאר. ואכן אוכלוסיית תאים זה מבטא את שטח MSC הקלסי הסמנים CD73, CD90 ו CD146 והוא שלילי על הסמנים CD34, CD45, הסוג מורכב histocompat...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבידוד והתרבות של L-MSCs העיקרי מהווה הזדמנות כדי להבין טוב יותר את תפקידם ואת האינטראקציה שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרים ברמה התאית, ותפקידם בהתפתחות הריאות, בבריאות ובחולי. זה חשוב במיוחד כאשר חוסר סמן ספציפי אחד של תאים אלה עושה את זה כמעט בלתי אפשרי ריבויים באתרו. כמו בכל אוכלוסיות תאים ראשוניים, יש לזכור כי תאים אלה נוטים יותר לשנות את האופי שלהם ככל שהם נשמרים תרבות 19 (הנסקרת ב 24). כדי לשמור L-MSCs במצב כי הוא קרוב ככל האפשר למצב הטבעי שלהם, זה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

JJPC נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). MAM מקבלת מלגת הצטיינות מהקרן האקדמית הלאומית הגרמנית - Studienstiftung des Deutschen Volkes ונתמכת על ידי מענק מ-EFCNI (הקרן האירופית לטיפול בתינוק שזה עתה נולד). BT נתמכת על ידי CIHR, איגוד הריאות הקנדי, רשת תאי הגזע ובית החולים לילדים של מכון המחקר של מזרח אונטריו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פרוטאז ניטרליWorthington Biochemical CorporationLS02104התכוננו ביום הבידוד ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד השימוש
בקולגנאז IWorthington Biochemical CorporationLS004196התכוננו ביום הבידוד ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד לשימוש
ב-DNAse ISigma-AldrichD5025התכוננו ביום הבידוד ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד השימוש
בנתרן פנטוברביטל (Euthanyl)Bimeda-MTC Animal Health Inc, דבלין, אירלנד-יש להשתמש ב-0.2 מ"ל לגורי חולדות במשקל שבין 20-30 גרם; בעלי חיים גדולים יותר עשויים להזדקק ליותר.
דולבקו s PBS + נתרן-פירובט + גלוקוזטכנולוגיות חיים14287-072חיוני מאוד להשתמש בסוג זה של D-PBS, שכן הסידן והמגנזיום הנמצאים ב-D-PBS זה מקלים על העיכול האנזימטי
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 גרם/ס"מ3)GEHealthcare17-5446-52מדיית שיפוע צפיפות. כדי להשיג אינטרפאזה טובה, חיוני שהשכבות של תרחיף התא הבודד יתרחשו ב->45 מעלות; במהירות נמוכה מאוד, וכי הצנטריפוגה שלאחר מכן נעשית ב-19 מעלות צלזיוס.
ואלפא; MEMSigma-AldrichM8042חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
200 מ"מ L-GlutamineLife Technologies25030-164
100x Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062פניצילין/סטרפטומיצין/Fungizone
M-280 DynabeadsLife Technologies11205Dחרוזים מגנטיים
ארנב-אנטי-עכבר פוליקלונלי ביוטיניל IgGDako, Agilent TechnologiesE0464נוגדן משני ביוטיניל התואם לנוגדנים CD146 נגד חולדות המתואר להלן
DynaMag5-magnetLife Technologies12303DMagnet המומלץ לשימוש עם Dynabeads. הערה: יש לבחור מגנט על סמך היצרן s הוראות של חרוזי המגנט לבחירה.
TrypLE אקספרס Life Technologies12605-028חלופה עדינה שאינה טריפסין, השתמש ב-1 מ"ל של שטח פנים TrypLE express/25 ס"מ2. לאחר הניתוק, 10 מ"ל מדיום תרבית L-MSC מספיק כדי לנטרל 3 מ"ל
נוגדן CD146 נגד חולדותTrypLE Lifespan Biosciences Inc.C3584112.5 μ l לכל 0.5 x 106 תאים
פנטספן (תמיסת פנטעמילן)בריסטול-מאיירס סקוויבקנדה-ניתןלהשיג באמצעות שירותי תרומת דם מקומיים או מחלקות המטולוגיות. לחלופין, אפשר להשתמש בתמיסת PSI 20% Pentastarch (Conservation Solutions, PST001) מדוללת 1:1 עם 0.9% NaCl.
מיכל הקפאה של מר פרוסטיThermoFisher Scientific5100-0001משפר את הכדאיות בעת הקפאת L-MSCs למשך הלילה ב-80 מעלות; ג

מקורות

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498(2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD146MSC
בידוד של CD146
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.