מאמר שיטה

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

DOI:

10.3791/53840

⸱

22 במרץ 2016

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תערוכת Retroviruses העדפות אינטגרצית חתימה על המאזניים המקומיים ועולמיים כאחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט (1) דור של ספריות מגוונות של אתרי אינטגרציה retroviral באמצעות בתיווך קשירת PCR (LM-PCR) הגברת רצף של הדור הבא (NGS), (2) מיפוי המיקום הגנומי של כל virus- לארח צומת באמצעות BEDTools, ו (3) ניתוח הנתונים עבור הרלוונטיות סטטיסטיות. הדנ"א הגנומי מופק בתאים נגועים מפוצל על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה או על ידי sonication. לאחר תיקון סוף DNA המתאים, linkers פעמים התקועות הוא ligated על DNA מסתיים, חצי מקונני PCR מתבצעת באמצעות פריימרים משלימים הוא חוזר מסוף הארוך (LTR) בסופו של הנגיף לבין DNA מקשר ligated. פריימרים PCR לבצע רצפים הנדרשים אשכולות DNA במהלך NGS, השוללים את דרישת קשירת מתאם נפרדת. בקרת איכות (QC) נערכה על מנת להעריך התפלגות גודל שבר דנ"א ולהתאיםאה DNA התאגדות לפני NGS. קבצי פלט רצף מסוננים עבור LTR המכיל קורא, ואת הרצפים בהגדרת LTR והמקשר נחתכים משם. רצפים התא המארח גזוז ממופים הגנום התייחסות באמצעות בלאט ו מסוננים עבור זהות מינימלית 97% עד לנקודה ייחודית בגנום התייחסות. אתרי אינטגרציה ייחודיים בחן עבור נוקלאוטיד הסמוך (NT) ביחס רצף והפצה לתכונות גנומי שונות. שימוש בפרוטוקול זה, ספריות באתר אינטגרציה גבוהות של מורכבות ניתן לבנות הדנ"א הגנומי בשלושה ימים. הפרוטוקול כולו שמקיף זיהום ויראלי אקסוגני של תאים בתרבית רקמה ניתן לאנליזה האתר אינטגרציה ולכן יכול להתנהל כ שבוע עד שבועיים. היישומים אחרונים של טכנולוגיה זו נוגעים ניתוח אורך של אתרי אינטגרציה מחולים עם HIV.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שילוב של ה- DNA הנגיפי (vDNA) לתוך הגנום של התא הפונדקאי הוא צעד חיוני במחזור חי retroviral. אינטגרציה מושגת על ידי integrase אנזים ויראלי (IN), אשר מבצע שני תהליכים קטליטיים ברורים שיובילו להקמת provirus מוכנס ביציבות 1. לפי יחידות משנה להעסיק את הקצוות של vDNA ליניארי כי נוצר באמצעות שעתוק לאחור, להרכיב את intasome מהסדר הגבוה עם vDNA מסתיים מחוזקת ביחד בידי לפי multimer 2-4. לפי וחותך את 'הקצוות של vDNA במורד הזרם 5'-CA-3 משתנה' 3 רצפים תהליך המכונה 3'-עיבוד, בהותירה את הפסקה 3 'מסתיים עם קבוצות הידרוקסיל תגובתי בכל vDNA הסופית 5-8. Intasome מיובא לאחר מכן לתוך הגרעין במסגרת אסיפה גדולה של מארח חלבונים נגיפיים הידועים כמתחם preintegration (PIC) 9-11. לאחר המפגש עם המטרה תאית DNA (tDNA), לפי משתמשת vDNA 3'-הידרוקסיל Groעליות לדבוק העליון tDNA וקצובות תחתונות בצורה מדורגת ובמקביל מצטרף vDNA לקבוצות פוספט 'tDNA 5 בתהליך של גדיל העברה 12,13.

העדפות אינטגרציה באתר התערוכה Retroviruses על המאזניים המקומיים והעולמיים. מקומית, אתרי אינטגרצית קונסנסוס מורכבים רצפי tDNA palindromic נשמרים בחולשה כי ההיקף בערך מחמישה עשר נ"ב במורד זרם מאתרי כניסת vDNA 14,15. גלובלי, רטרווירוסים למקד הסברים ספציפיים הכרומטין 16. ישנם שבעה סוגים retroviral שונים - אלפא באמצעות אפסילון, lenti, ו spuma. Lentiviruses, הכולל HIV-1, לטובת השתלבות גופות הגנים לרנ"א 17, בעוד gammaretroviruses לשלב מועדף למתחמי תחילת תעתיק (TSSs) ואזורים משפרים פעילים 18-20. בניגוד חד, spumavirus מוטה חזק כלפי heterochromאזורי atic, כגון 21 תחומי גן-עני הקשורים-lamina. העדפות בסיס tDNA מקומיות הם חלק גדול מוכתב על ידי רשתות ספציפיות של אנשי קשר nucleoprotein שבין פנימי tDNA 13,22,23. עבור lentiviruses ו gammaretroviruses, ביחס אינטגרציה ל- ביאורים הגנומי הוא במידה רבה מוסדר על ידי אינטראקציות בין לפי וגורמים הסלולר מאותו מקור 24-27. שינוי הפרטים של רשת אינטראקציה IN-tDNA 13,22,23,28 ושיבוש או Re-engineering IN-מארח אינטראקציות גורם 25-27,29-32 מוכחות אסטרטגיות כדי להתמקד מחדש אינטגרציה במישור המקומי והעולמי, בהתאמה.

כוחה של נהלי רצפי DNA היה מקטלגי אתרי אינטגרצית retroviral בכדור הארץ גבר מאוד בעשורים האחרונים. אתרי אינטגרציה שנמצאו בעבודתו החלוצית באמצעות טיהור מייגעת וטכניקות שיבוט ידניות להניב רק קומץ של אתרים ייחודיים לכל 33,34 מחקר.השילוב של הגברת LM-PCR של צמתי DNA LTR-מארח עם היכולת למפות אתרי אינטגרצית פרט הגנום אנושי ועכבר טיוטה הפך את השדה, עם מספר האתרים התאוששו מזיהומי תרבית תאי אקסוגניים רקמות הגדיל לכמה מאה לאלפי 17 , 18. השילוב עדכנית יותר של LM-PCR עם מתודולוגיה NGS שלח נסיקת עומק הספרייה. באופן ספציפי, pyrosequencing הניב בסדר גודל של עשרות אלפי אתרים שילוב ייחודי 30,35-38, בעוד ספריות רצף באמצעות אשכולות DNA יכול להניב מיליוני רצפים ייחודיים 19-21,39. כאן אנו מתארים פרוטוקול LM-PCR אופטימיזציה עבור הגברה וסדר אתרי אינטגרציה retroviral באמצעות NGS אשכולות DNA. השיטה משלבת נדרשת רצפי מתאם לתוך פריימרים PCR ומכאן ישירות לתוך מולקולות דנ"א המוגברות, ובכך מניעת דרישת צעד קשירת מתאם נוסף לפני sequencing 40. צינור ניתוח bioinformatic, מן הניתוח של נתוני רצף גלם צומת DNA LTR-לארח את המיפוי של אתרי אינטגרציה ייחודיים רלוונטי תכונות גנומית, גם מתואר בדרך כלל. בהתאם עדיפות הוקמה מתוך פרוטוקולים מתודולוגיים לפני בתחום זה 36,38,41-43, סקריפטים מותאמים אישית ניתן לפתח על מנת לסייע בהשלמת צעדים ספציפיים בצנרת ביואינפורמטיקה. השירות והרגיש של הפרוטוקול מודגם עם נתונים נציג ידי הגברה, רצף, ומיפוי אתרי אינטגרציה HIV-1 מתאי בתרבית רקמה הנגוע על הריבוי המשוער של זיהום (משרד פנים) של 1.0, כמו גם סדרת טיטרציה של DNA זה מדולל באמצעות הדנ"א תאי נגוע ב 5-לקפל צעדים לדילול מקסימלית של 1: 15,625 להניב משרד הפנים המקבילים המשוער של 6.4 x 10 -5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צור מניות וירוס

הערה: תרשים זרימה של היבט הספסל הרטוב של פרוטוקול זה מתואר באיור 1 הפרטים של ייצור מניית ויראלי והזיהום הבא של תאים בתרבית הרקמה יחולו בדרך כלל סוגים שונים של רטרווירוסים.. בניסויים מסוימים, תא המטרה לא יכול לבטא את קולטן ויראלי אנדוגני (ים), ובמקרים כאלה בניית חלקיקים retroviral Pseudotyped מחסה גליקופרוטאין מעטפת נגיפיים Heterologous, למשל גליקופרוטאין G מנגיף stomatitis שלפוחי (VSV-G), יהיה נדרש עבור זיהום 44,45.

הערה: זהירות יש לנקוט בעת עבודה עם HIV-1. למרות הנחיות ספציפיות תשתנינה ממוסד למוסד, כל העבודה מבוססת הווירוס צריך להתנהל בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוגבל ייעודי, מפעיל (בדרך כלל המכונה במנדף בתרבית רקמה). ציוד מגן אישי נכוןהכולל הגנת פן, כיסויי נעליים, שכבת כפפה כפולה, וחליפת סרבל גוף מלא צריכה להיות משוחקת בכל העת. כל פסולת הנוזל המתקבלת מניסויים הקשורות וירוס צריכה להיות מובטלת עם אקונומיקה (10% ריכוז סופי), וכל הפסולת כולל מוצקים צריכה להיות autoclaved לפני הסילוק.

  1. יום אחד לפני transfection, צלחת 3.3 x 10 6 תאים HEK293T ב 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml המלאי) בכל אחת מחמש 100 מנות מ"מ.
    הערה: השלימו-DMEM המכונה DMEM-FPS מנקודה זו ואילך.
  2. ביום שלאחר מכן, transfect את התאים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד שנשא שיבוטים מולקולריים retroviral באורך מלא או 9 מיקרוגרם של וקטורים יחידים מסביב נמחק מעטפה עם 1 מיקרוגרם של מבנה ביטוי VSV-G באמצעות ריאגנטים transfection או סידן פוספט זמינים מסחרי.
    1. דגירת גאמות על 37 מעלות צלזיוס חממה תרבית תאים humidified עם 5% CO 2 (להלן מצב זה המכונה "החממה בתרבית רקמה"). לאחר כ 48 שעות, קציר התקשורת התא המכיל וירוס בעזרת פיפטה נפח ולהעביר אותו דרך פילטר 0.45 מיקרומטר ידי זרימת כוח הכבידה.
    2. לרכז את הנגיף על ידי ultracentrifugation ב 200,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C.. Resuspend גלולה הנגיף 500 μl DMEM-FPS המכיל 20 U DNase, דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב DNase עוזר להפחית את ההתאוששות של רצפי פלסמיד לא רצויים על ידי ביטול בניטל של DNA פלסמיד כי נמשך מהליך transfection.
  3. קביעת ריכוז p24 46 באמצעות ערכת ללכוד אנטיגן p24 HIV-1 לפי הוראות היצרן.
    הערה: ריכוז וירוס יכול להיקבע גם על ידי assay פעילות transcriptase הפוכה 47,48. יכולה לחלופין, רמת נגיף פונקציונלילהיקבע על ידי מדידת משרד הפנים. הדבר נעשה ביותר בקלות באמצעות תא מופעל קרינת מיון עם וירוסי המבטאים גני כתב ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר. קביעת משרד הפנים עשויה להיות שימושית במיוחד כאשר עובדים עם תאים ראשוניים שאינו תומכים באותה הרמה של זיהום כמו שורות תאים מותאמות.

2. תאים להדביק עם וירוס

  1. פלייט 3.0 x 10 5 תאים HEK293T לכל היטב צלחת 6-היטב 2.5 מ"ל DMEM-FPS דגירה לילה חממה בתרבית רקמה.
    הערה: מספר אתרי שילוב הייחודיים התאוששו עם פרוטוקול זה עומד ביחס ישר למספר התאים וכמות וירוס פעילים המשמשים בתעשיית הזיהום.
  2. להדביק תאים עם ריכוז p24 ויראלי סופי של 500 ng / ml בנפח סופי של 500 μl טרי DMEM-FPS עבור שעה 2 באינקובטור בתרבית רקמה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל DMEM-FPS מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס לכל היטב להמשיך דגירה.
  3. בְּ48 שעות לאחר הפגיעה, הסר את התקשורת לשטוף את התאים עם מ"ל 2 פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הוסף 0.5 מיליליטר טריפסין-EDTA מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, ולאחר כמה שניות בדוקות חזותי את הבארות עבור שליפת תא.
  4. הוסף 2 מ"ל מחומם מראש DMEM-FPS ו resuspend את התאים על ידי עדינה למעלה / למטה pipetting עם טפטפת נפח ~ 10 פעמים. מעבירים את הפתרון בקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמה המכילה 18 מ"ל מראש חימם DMEM-FPS, דגירה התאים בתרבית רקמה חממה.
  5. לאחר מינימלית חמישה ימים מתחילת הזיהום, לאסוף את התאים על ידי הסרת התקשורת, לשטוף עם 5 מ"ל PBS, להוסיף 2 מ"ל מראש חימם טריפסין-EDTA, ו resuspend עם 5 מ"ל מראש חימם DMEM-FPS ידי pipetting. צנטריפוגה הפתרון עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ב 2500 XG, וזורקים supernatant.
    הערה: למרות אינטגרציה תחת מישורי התנאים הללו בסביבות 48 שעות לאחר הדבקה 49,50, בימים 3 הנוספים של התרבות נדרשות sufficiently לדלל את הריכוז של מולקולות DNA משולבות שנובעות רקומבינציה DNA מבוסס תאים או autointegration ויראלי בתיווך.
  6. חלץ הדנ"א הגנומי מן התא גלול באמצעות ערכה זמינה מסחרי (למשל, לראות 51). Elute את ה- DNA מהעמודה חילוף יונים מסופק עם 200 μl של 10 mM Tris-HCl, pH 8.5.
    הערה: Aliquot של תאים להתחלק ב 48 שעות לאחר ההדבקה (שלב 2.3) עבור assay infectivity כדי להבטיח זיהום ראוי וירוס לפני NGS.

3. הדנ"א הגנומי שבר ידי Sonication או על ידי הגבלת אנזים Digest

הערה: שברי Sonication הדנ"א הגנומי באופן רצף עצמאי כמעט, ועל כן במצב העדיף פיצול כאשר רצף דגימות עם קצב החלמה צפוי נמוך (למשל, תאי חולה נגועים או זיהומים יזמו בבית יחסית נמוך משרד פנים). יתר על כן, sonication מאפשרת לאדם להבחין כפילויות PCR של Partiרצף אינטגרציה באתר cular מ ואינטגרציות ייחודיות באותו האתר, שהוא קריטי להבחין הרחבת המשובטים של תאים המכיל provirus בחולים נגועים (ראה שלב 11 להלן) 39,52-54.
הערה: ה- DNA צריך להיות בקע מייד במורד זרם מן הזרם LTR לצמצם הגברה של רצפי ויראלי פנימיים במהלך LM-PCR. אנזים הגבלה BglII שנמצאת 43 נ"ב במורד הזרם מן הרצף U5 במעלה או שאינה עולה בקנה אחד עבור קשירת לאחר מכן עם MseI שנוצר DNA מסתיים עובד היטב עם זנים רבים HIV-1 (איור 1 ב). בעת הכנת ה- DNA על ידי sonication, אנזים ההגבלה הפנימי-הביקוע צריך להיות מיושם לאחר קשירת מקשר (ראה תרשים 1C - E ו- שלב 4.3 להלן).

  1. עבור sonication, לערבב 10 מיקרוגרם של ה- DNA הגנומי במים nuclease ללא לנפח סופי של 120 μl. Sonicate באמצעות פרמטרים של גודל הפסקה ממוצע של 500 נ"ב (שני סבבים של הסעיף הבאמטר: מחזור עבודה: 5%; עוצם: 3; מחזורי פרץ: 200; זמן: 80 שניות).
  2. לטהר DNA sonicated באמצעות ערכת טיהור PCR. תיקון ה- DNA מסתיים באמצעות ערכת קצה תיקון DNA ולטהר את ה- DNA באמצעות ערכת טיהור PCR. A-זנב את ה- DNA באמצעות exo Klenow - אנזים ולטהר את ה- DNA A-זנב באמצעות ערכת טיהור PCR. עיין 51,52 לפרטים נוספים שימוש בערכה.
  3. לעיכול endonuclease הגבלה, לקצץ 10 מיקרוגרם של ה- DNA הגנומי לילה בשעה 37 ° C בהיקף של 100 μl עם חיץ שסיפק יצרן וקוקטייל של אנזימים (100 U אחד) שיוצרים המסוכך 5'-ת"א, וכן אנזים בקנה כגון BglII המסלקת במורד זרם מן LTR ויראלי נגד הזרם. לטהר את הדנ"א למחרת באמצעות ערכת טיהור PCR.
    הערה: אף אחד אנזימי הגבלה צריך לחתוך בתוך הטרמינל ~ 30 נ"ב של סוף DNA הנגיפי המועצמת על ידי פרוטוקול LM-PCR. פרוטוקול זה במיוחד מגביר את U5סוף DNA HIV-1.

4. לחשל לינקר Oligonucleotides ולקשור ל- DNA הגנומי קטועה

הערה: כן מקשר סימטרי המכיל סככה התואמת את שברי DNA לעיל (ראה טבלת מס '1 עבור הרצפים של oligonucleotides מנוצלים בפרוטוקול זה). והמקשר לשמש עם DNA sonicated חייב לכלול סככה תואמת T-3 ", בעוד המקשר עבור MseI מתעכל DNA חייב לכלול סככת 5'-ת"א תואמת (איור 1). גדיל המקשר הקצר בנוסף חייב לכלול שינוי כימי בלתי להארכה, כגון 3'-אמין, כדי להגביל את תגובות ההגברה הבאות כלפי DNA של עניין.
הערה: בעת הכנת ספריות באתר אינטגרציה שונות מרובות במקביל ו / או כאשר דגימות ייחודיות ריבוב באותו בטווח הרצף, מומלץ להשתמש linkers ייחודי עבור כל דגימה כדי להגביל את פוטנציאל מדגם צולבות contamination במהלך PCR. זה גם מרמז על השימוש פריימרים מקשר ייחודי עבור כל דגימה במהלך חצי מקוננים PCR (כמתואר להלן). גדילי מקשר ייחודיים פריימרים מקשר יכולים להיות מעוצבים על ידי ערבול רצפי oligonucleotide מקשר המפורטות בטבלת 1, תוך שמירה על תוכן GC הכולל% דומה ועמדות סככה ישימות.

  1. לחשל גדילי מקשר קצר וארוך 35 μl של 10 mM Tris-HCl, pH 8.0-0.1 EDTA מ"מ (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר של כל oligonucleotide) על ידי חימום עד 90 מעלות צלזיוס, קירור לאט לטמפרטורת החדר בצעדים של 1 ° C לדקה.
  2. הכן לפחות ארבע תגובות קשירת במקביל לכל דגימת DNA גנומי, אשר מכילים מקשר 1.5 מיקרומטר ligated, 1 מיקרוגרם DNA מקוטעת, ו -800 האנזים U T4 DNA ב 50 μl. ולקשור לילה בשעה 12 ° C. לטהר למחרת עם ערכת טיהור PCR.
  3. לקבלת דוגמיות שהכין sonication, לעכל את התגובה קשירת מטוהרים עם 100 U של restricאנזים tion המסלקת במורד זרם מן הזרם LTR (למשל, BglII ל- HIV-1) תחת היצרן מומלץ תנאי לילה. לטהר את הדנ"א בעזרת ערכת טיהור PCR.

5. להגביר ויראלי LTR-Host הדנ"א הגנומי צומת ידי PCR חצי מקוננות

הערה: כדי להבטיח לגיוון ספרייה אופטימלי, לפחות 4-8 PCRs במקביל, תלוי בריכוז ה- DNA של תגובת הקשירה התאוששה, צריכה להיות מוכנה עבור כל דגימה עבור שני סיבובי PCR. ריכוז תבנית ה- DNA יש לכמת ידי לספקטרופוטומטריה. בפרוטוקול זה הסבב הראשון והשני של ה- PCR להעסיק פריימרים LTR ספציפי מקוננות, אבל באותו פריימר ספציפי מקשר משמש הן סיבובים (טבלה 1). פריימר סיבוב השני LTR הספציפי רצפי המתאם לקודד פריימר ספציפי המקשר עבור אשכולות DNA, כמו גם אתרים מחייב פריימר רצף. פריימר LTR הספציפי המקונן גם מקודד רצף מדד 6 NT, WHich יכול להיות מגוון בקרב פריימרים שונים עבור ספריות ריבוב בתוך אותה בטווח הרצף.

  1. כן PCRs בסיבוב הראשון המכיל את המרכיבים לכל צינור כמפורט בטבלה 2.
    הערה: פריימר מקשר ספציפי מטפח 22 NT ההשלמה כדי והמקשר, טמפרטורת ההתכה של 53 מעלות צלזיוס, תוכן GC של 45%, ועל 3 "סוף ממוקם 15-16 נ"ב במעלה הזרם מן 3" טרמיני של הסיבים הארוכים המקשר השונה (טבלה 1). פריימר בסיבוב הראשון 27 NT LTR יש טמפרטורת התכה של 59 מעלות צלזיוס, תוכן GC של 48%, ו -3 שלה "הסוף ממוקם 34 נ"ב זרם ממסוף U5 HIV-1. האזור של פריימר סיבוב שני 26 NT LTR כי הוא משלים LTR HIV-1 יש טמפרטורת ההתכה של 60 מעלות צלזיוס, תוכן GC של 50%, ו -3 שלה "סוף ממוקם 18 נ"ב במעלה הזרם מן U5 ויראלי מָסוּף. מומלץ טמפרטורת ההתכה oligonucleotide ו-תוכן GC צריך לחקות פרמטרים אלה אם משתמשיםפריימרים PCR עיצוב עם רצפי שינו (כולל לשימוש עם רטרווירוסים אחרים) 21.
  2. לרוץ בכל PCR הראשון תחת פרמטרי thermocycler הבאים: מחזור א ': 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 30 מחזורים: 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות, 68 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; אחד מחזור: 68 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  3. פינת תגובות ולטהר באמצעות ערכת טיהור PCR. הכן PCRs סיבוב שני המכיל את המרכיבים לכל צינור לפי טבלה 3. הפעל את הסיבוב השני של ה- PCR באמצעות הפרמטרים thermocycler המתואר בשלב 5.2. פינת התגובות ולטהר את ה- DNA באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: מגוון רצפי מדד מומלץ תואמים NGS אשכולות DNA זמין 71.

6. בצעו QC ו NGS (הושלם בדרך כלל על ידי מתקן רצף)

  1. (קוו assay # 1) אישור שלב 5.3 ריכוז ה- DNA הספרייה באמצעות fluoroמטר 55. בקיצור, להכין תקני דגימות ניסוי בנפח סופי של 200 מים nuclease ללא μl. צינורות וורטקס למשך 2-3 שניות, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ולאחר מכן לקרוא את דגימות fluorometer.
    הערה: דוגמאות צריכות מכילות ריכוז מינימאלי של ה- DNA ספריית 2 ננומטר בהיקף מינימאלי של 15 μl.
  2. (# Assay QC 2) אשר התפלגות גודל DNA שבר באמצעות assay סרט המבוסס על 56.
    הערה: התפלגות אידאלית היא שיא DNA רחב יחסית שבמרכזו 500 נ"ב באורך. אם כמות החומר משמעותית היא גדולה מ 1 kb, אז מומלץ לשלב הליך בגודל מבחר לחסל מיני DNA יותר, אשר יעכבו הגברת גשר במהלך אשכולות. לעומת זאת, אם לשיא משמעותי ניכר סביב 100 עד 200 נ"ב, דימר פריימר נוצר במהלך PCR. במקרה זה ההליך צריך להיות מותאם על מנת למזער את ההיווצרות של הדימרים פריימר.
  3. (קוו assay # 3) Confirm התאגדות תקינה של מתאמים לתוך ספריית DNA על ידי PCR כמוני 57.
  4. בצע NGS בעקבות ספרות היישום של היצרן. לנצל א-ב ספייק של 10% (w / w) ΦX174 DNA, אשר יהיה לייעל את מדדי איכות בזמן אמת על ידי מתן רכב בסיס מאוזן בטווח הרצף.
    הערה: ניסויים רצף באתר אינטגרציה חשופים בדרך כלל נ"ב 150 בסוף יחיד (SE150) או-סוף לזווג 150 נ"ב רצף (PE150). PE150 שימושי במיוחד כדי ללכוד את נקודת החיבור מקשר בכל מולקולת הדנ"א (למשל, כאשר בוחנים אתרי אינטגרציה עבור ראיות של שיבוטי התא המארח).

7. השתמש סקריפט פייתון מותאם או PERL כדי לנתח נתונים רצף עבור רצפי LTR המכיל, יבול משם LTR ו לינקר רצפים, ומפת פניית הגנום עם בלאט

  1. קבצי FASTA סרוקים LTR המכיל רצף קורא, LTR יבול רצפים מקשרים הרחק רצף DNA מארח גנומית, ולייצא רצפים אלה לקובץ FASTA חדש. מפת קצוץ קורא לשני גנום הפניה (למשל hg19 גרסאות הגנום האנושי או GRCh38) ואת הגנום הנגיפי באמצעות בלאט 58, עם אתר אינטגרציה פלט קואורדינטות לייצא לקובץ .txt נפרד, באמצעות ההגדרות הבאות:
    stepSize = 6, minIdentity = 97, ו maxIntron = 0
  2. לנתח את הפלט בלאט .txt קובץ, להסיר autointegrations (עדות כלומר שסוף LTR שלב לתוך באיזור פנימי של הגנום DNA הנגיפי) ומיפוי רצפים אחרים כדי הגנום HIV-1, וליצור פלט נפרד .txt קובץ שבו כל אתרי האינטגרציה הכפולים כבר מרוכזים אחד, להיטים לתאם ייחודיים.

8. יצירת קבצי .bed המכילים מרווח 15-NT סביב ואינטגרציות, להמיר אותם קבצי FASTA, ולבנות רצף לוגו להצגת העדפות מאגר סביב אתרי אינטגרציה

  1. יצירת קבצי .bed שמפרטים בהפרש של בסיסיםכל אתר אינטגרציה. לפחות 15 בסיסים (5 במעלה או במורד זרם 10) מוצעים עבור דור לוגו רצף. צור קובץ FASTA מקבצי .bed אלה באמצעות פונקצית fastaFromBed מ BEDTools 59 ו בפקודה זו:
    -fi / ספרייה fastaFromBed / אל / הפניות / הגנום / -name -s -bed 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    הערה: dinucleotide 5'-CA-3 ה"וירלית משתנה מצטרף לארח DNA במהלך אינטגרציה, ואימות לצומת של התחנה סופית LTR ל- DNA של תאים הוא מסנן ראשוני חשוב לזהות אתרי אינטגרציה בתום לב. אנחנו גם לקמפל לוגו רצף מן האוכלוסייה רצף DNA מארח זה כדי לאמת את תוצאות הניסוי. כמו רטרווירוסים להציג העדפות בסיס חתימה סביב האתרים ושילובם 14,15, הלוגוס רצף לשמש כדי לאמת כי באתרי גנומי הממופים התעוררו תוך השתלבות בתיווך לעומת מנגנוני רקומבינציה אחרים כגון DNA שאינו הומולוגיסוף להצטרף 60,61.
  2. השתמש WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) כדי ליצור לוגו רצף מקובצי FASTA. לחץ על 'בחר קובץ' כדי להעלות קובץ FASTA, ולהשתמש את ההגדרות הבאות: פורמט פלט, PDF (וקטור); גודל לוגו, גדול; מספר המיקום הראשון, -5; מגוון לוגו, -5 עד 5; ציר Y מידה, 0.1, ציר Y המרווח טיק, 0.5, ערכת צבע קלאסי (NA).

9. צור מרכזי מאגר זוג .bed קבצים, בדקו בין זיהום לדוגמא, ולמפות את התפלגות אתרי שילוב הייחודי יחסית תכונות הגנום הרלוונטי

  1. מאז אינטגרצית retroviral מתרחשת בצורה מדורגת על פני גדילי tDNA, להתאים את הקואורדינטות המדויקות של אתרי אינטגרציה על מנת לשקף את נ"ב המרכזי של שכפול אתר היעד למיפוי נכון של יחסי הפצה גנומי לתכונות הגנומי.
    1. לכן, עבור 5 נ"ב שכפול וירוסים כמו HIV-1, ליצור קובץ .bed עם נ"ב המרכזי לקזז מן integration האתר על ידי שני בסיסים במורד הזרם למיפוי ואינטגרציות לגדיל פלוס, ושני בסיסים upstream למיפוי ואינטגרציות לגדיל מינוס.
  2. כדי לבדוק אם קיים בין זיהום מדגם, לחשב את מספר אתרי אינטגרציה משותפים בין הספריות השונות על ידי שימוש BEDTools מצטלב פונקציה מצטלב נ"ב מרכזי .bed קבצים עבור שני מדגמים שונים ועל ידי ביצוע פקודה זו:
    bedtools מצטלבים -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s> overlap1v2.txt
  3. לספור את מספר השורות בתוך קובץ הפלט overlap1v2.txt על מנת לכמת את המספר המדויק של אתרים נפוצים בקרב שתי הספריות באמצעות הפקודה הבאה:
    WC -l overlap1v2.txt
  4. הורד את הקובץ RefSeq ביאור .bed עבור גירסת הגנום התייחסות ששימש למיפוי האתר אינטגרציה ממסד הנתונים ביאור הגנום UCSC (למשל http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database) 62.
    1. לחשב את מספר אתרי אינטגרציה נופלים בתוך גני RefSeq באמצעות BEDTools מצטלב פונקציה כדי לחתוך את קובץ .bed זוג בסיס המרכזי כי נוצר למדגם עם RefSeq .bed קובץ הבא בפקודה זו:
      bedtools מצטלבים -a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
  5. לספור את מספר השורות בתוך קובץ הפלט RefSeq_sample1.bed על מנת לכמת את המספר המדויק של אתרים נופלים בגני RefSeq באמצעות הפקודה הבאה:
    WC -l RefSeq_sample1.bed
  6. חזור על שלבים 9.3 ו -9.4 עבור אתרי אינטגרציה מיפוי לכל ביאור אחרים בעלי עניין עבורו מרווח .bed הקובץ זמין. הורד את הקובץ .bed ביאור האי CPG העדכני ביותר עבור הגנום התייחסות עניין ממסד הנתונים ביאור הגנום UCSC כמצוין שלב 9.4.
    1. לחשב את מספר אתרי אינטגרציה נופל בתוך di מסויםעמדה (מאויר בדוגמא זו היא חלון 5 kb) איים CPG באמצעות פונקצית חלון BEDTools ובעקבות בפקודה זו:
      bedtools חלון -w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
  7. לספור את מספר השורות בתוך קובץ הפלט CpG_sample1.bed על מנת לכמת את המספר המדויק של אתרים נופלים בתוך 2.5 kb במעלה או במורד הזרם של איי CPG באמצעות הפקודה הבאה:
    WC -l CpG_sample1.bed
  8. חזור על שלבי 9.6 ו -9.7 עבור אתרי אינטגרצית מיפוי סמוך TSSs. צור גרסה חלופית של קובץ RefSeq.bed, שבו גנומי קואורדינטות מיפוי ליותר גן אחד הותאם לשקף מתנת גן יחידה רק במיקום זה. הדבר מונע הערכת יתר של צפיפות גן שמסביב אתרי אינטגרציה. חשב את צפיפות הגן באזור 1 Mb סביב כל אתר אינטגרציה באמצעות הפונקציה חלון BEDTools ובעקבות בפקודה זו:
    Bedtools חלון -w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed -u> GeneDensity_sample1.bed
  9. חשב את צפיפות הגן הממוצע עבור כל ואינטגרציות של בסיס הנתונים על ידי ביצוע הפקודה:
    awk '(sum + = 7 $) END (הדפסה "= ממוצע", ​​סכום / NR)' GeneDensity_sample1.bed

10. סטטיסטית השוואת התפלגויות אינטגרצית אתר בין דגימות באמצעות שני זנב המבחן המדויק של פישר זנב השני ווילקוקסון דרגת סכום בדיקת R

הערה: הבדיקה המדויקת של שימוש פישר להשוואת שיעור אתרי אינטגרציה בתוך גני RefSeq או בתוך חלון של איי CPG או TSSs, אבל להשתמש במבחן סכום דרגה ווילקוקסון עבור השוואת התפלגות צפיפות גן שמסביב באתרי האינטגרציה. תכנית R זמינה בכתובת http://www.r-project.org/.
שני זנב מבחן מדויק של פישר:

  1. באמצעות המספרים מחושבים בהתאם להוראות צעדים 9.4 ו -9.7, CReate מטריצות עבור כל השוואה במו מופעים ציינו (אינטגרציות בתוך ביאור או בתוך חלון הסובב ביאור) לעומת נותרי אתרים על ידי הפקודה הזאת:
    (Annotation_of_interest <- מטריקס (ג (SampleA # ב, SampleA נותרו #, SampleB # ב # SampleB הנותרים), nrow = 2, dimnames = הרשימה (ג ( 'מרכז', 'השאריות'), ג ( 'SampleA', 'SampleB'))))
  2. חשב את ערך P להשוואה ידי בדיקה מדוקדקת של שני זנב פישר עם הפקודה הבאה:
    fisher.test (annotation_of_interest, = החלופית" two.sided ') p.value $
    שני זנב דרגה ווילקוקסון סכום בדיקה:
  3. יצירת קובץ .txt טאבים שבו כל עמודה מכילה את שם המדגם בתא העליון, ואחריו מתחת מערכיה צפיפות הגן עבור כל אתרי האינטגרציה בספרייה כי (מתוך קובץ .bed שנוצר בשלב 9.9). מופרד באמצעות טאבים זה לייבא קובץ .txt לתוך R באמצעות הפקודה הבאה ו נהvigating אל ספריית הקבצים הנכונה:
  4. חשב את ערך P להשוואה ידי מבחן סכום בדרגת שני זנב ווילקוקסון עם הפקודה הבאה:
    wilcox.test ($ filename SampleA, FILENAME $ SampleB, 'two.sided' = אלטרנטיבית, לזווג = F, מדויק = T) p.value $
    הערה: ערכי P ניתן לחשב רק עד גבול מסוים (נמוך מאוד) ב R, שלאחריו אפס יוחזר על ידי התכנית. עבור מדגמים שונים מסיבי שמניבים P = 0 ב R, לאמוד את שווי P כמו <2.2 x 10 -308.

11. בודקים את נתוני רצף גלם עדות השיבוטים של תאים המכילים DNA ויראלי שולב

הערה: פוטנציאל קטן קיים למעלה אינטגרציה אחד בבית NT בדיוק בגנום ההתייחסות. לחלופין, סינגלהאירוע tegration עלול להפוך הנוכחי מיותר בנתונים רצף עקב השימוש של PCR במהלך הכנת הספרייה ו / או על ידי שכפול התא לפני הכנת ה- DNA. ניתוחים אחרונים של הדנ"א הגנומי של נשאי HIV יש להבחין האפשרויות הללו על ידי זיהוי נקודות מצורף מקשר נקודות / גזירה sonication ייחודי (אשר יכול רק להתעורר לפני PCR) בתוך רצפי DNA המכיל 52-54 אתרים אינטגרציה זהה. אין כרגע ויכוח באשר לשאלה האם proviruses טפח בתוך תאים מורחבים clonally לתרום מאגר ויראלי הסמוי, ועל כן הוא בעלת עניין מיוחד לאפיין רמת הרחבתן כאשר לומדים אתרי אינטגרציה בחולים אנושיים.

  1. בדומה ההליך שתואר בשלב 8.1, ליצור קבצי .bed רישום בהפרש של בסיסי הארכה, במקרה זה, 25 NT במורד זרם מכל אתר שילוב ייחודי (בסיסי upstream מיותרים כאן). צור קובץ FASTA מקבצי .bed אלה (בהתאם להוראותשלב 8.1) באמצעות הפונקציה fastaFromBed מ BEDTools ובעקבות בפקודה זו:
    -fi / ספרייה fastaFromBed / אל / הפניות / הגנום / -name -s -bed 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    הערה: כדי לשפר את הספציפיות של כל חיפוש מומלץ לחלץ לפחות 25 NT במורד הזרם מכל אתר אינטגרציה עבור שיבוטי מנתח.
  2. רצוי בעזרת סקריפט מותאם אישית, לחפש בקובץ הנתונים הגולמיים רצף FASTA לכל מחרוזות המכילות התאמה מדויקת אל 25 NT במורד הזרם מכל אתר שילוב ייחודי, וכן להפקיד רצפים אלה לתוך קובץ חדש. חתוך LTR רצפים מקשר בין המיתרים גלם. מיזוג רצף PE קורא ידי המרת מקריא המשלים הפוכה, זמירה רצפי LTR ו מקשר, ולאחר מכן הקצאת מחרוזות read2 לזוג read1 שלהם אם מחרוזות לשתף לפחות 20 חופפים NT.
  3. סרוק את הנקודות מצורפות מקשר של כל בלוק באתר אינטגרציה. לסווג כל אינטגרציה כמו "מורחבת clonally &# 34; אם נקודות מצורפות מקשר הן ≥3 BP בנפרד.
    הערה: פרוטוקול לניתוח שיבוטים ללא מיזוג רצף קורא תואר 52.
    הערה: פיצול של הגנום במיקום הזהה על ידי sonication מוביל הערכה נמוכה מדי של היקף ההרחבה משובטת, ושיטות לתיקון הטיה הניסיונית המתקבלת תואר 63,64.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשימות לוח 4 תוצאות ניסוי נציג כדי להמחיש את הרגישות של NGS לשחזור אתרי אינטגרציה מתרבה של תאים נגועים. DNA התאי הנגוע נוצל כדי לדלל הדנ"א הגנומי סדר מזיהום שבו כל תא בממוצע הכיל שילוב אחד 40. דילולים נערכו שלבים של חמש עד דילול מקסימאלי של 1: 15,625. הדנ"א הגנומי בסדרה טיטרציה אז מקוטעת על ידי sonication או על ידי עיכול עם הגבלה endonucleases MseI ו BglII, ואחריו LM-PCR. המספרים של אתרי שילוב ייחודיים, כמו גם את מספר הפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול לניתוח אתרי אינטגרציה retroviral, משלב הזיהום בנגיף הראשוני ועד מיפוי של דפוסי תפוצה גנומית, מתואר. פרוטוקול זה חל על כל רטרו-וירוס וכל סוג תא infectable. יתר על כן, צינור assay רגישה למדי, עם פוטנציאל להתאושש מספר משביע רצון של אתרי שילוב ייחודי בין דילולים סדרתי של שווה ערך הדנ"א הגנומי לזה של זיהום יזם עם משרד הפנים של 6.4 x 10 -5. רגישות זו הופכת את הפרוטוקול שימושי במיוחד כאשר מוחלים על דגימות מחולים נגועים שעשויים להכיל עומס נגיפי נמוך, שבו רק חלק קט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים עמיתינו סטיבן יוז והנרי לוין לייעוץ היה קריטי להקים פרוטוקול NGS עבור סידור האתר אינטגרציה retroviral במעבדה אנגלמן. עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI039394 ו AI052014 (כדי Ane) ו AI060354 (מרכז אוניברסיטת הרווארד לחקר האיידס).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMGibco11965-084מדיום תרבית תאים סטנדרטי, תואם לתאי HEK293T
סרום בקר עובריThermo ScientificSH 30088.03ייתכן שיהיה צורך לסנן מראש כמויות שונות של סרום לייצור ויראלי אופטימלי
פניצילין/סטרפטומיציןקורנינג30-002-Clאנטיביוטיקה שיש להוסיף ל-DMEM
פוספט-חוצץמלח Mediatech21-040-CVמשמש לשטיפת תאים
טריפסין EDTACorning25-053-CIמשמש לניתוק תאים דבקים מלוחות תרבית רקמות
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688מגיב טרנספקציה DNA
0.45 ומיקרו; m מסנניםThermo Scientific09-740-35Bמשמש לסינון מדיית תרבית תאים המכילה חלקיקי וירוס
Turbo DNaseAmbionAM2239משמש לפירוק DNA פלסמיד נשיאה ממלאי וירוסים
HIV-1 p24 בדיקת לכידת אנטיגןABL Inc.5447משמש לכימות תפוקת ייצור הנגיפים
DNeasy Blood & ערכת רקמותQiagen69506משמשת לטיהור DNA גנומי מתאים
SonicatorCovarisS2עם דגם זה של סוניקטור בצע שני סבבים של מחזור עבודה, 5%; עוצמה, 3; מחזורים לכל פרץ, 200; זמן, 80 שניות
מים ללא נוקלאזGeneMateG-3250-125מומלץ להשתמש במים זמינים מסחרית כדי להפחית את האפשרות של זיהום צולב של דגימה
טיהור QIAQuick PCR ערכהQiagen28106משמשת לטיהור DNA במהלך בניית הספרייה
ערכת תיקון קצה DNAEpicentreER81050משמשת לתיקון קצוות DNA של דגימות DNA סוניקטיביות
שבר קלנוב (3'-5' exo–)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד (NEB)M0212Sבשימוש עם dATP לשברי DNA מתוקנים של זנב
A dATPThermo ScientificR0141דאוקסיאדנוזין טריפוספט
MseINEBR0525Lאנדונוקלאז הגבלה למחשוף DNA גנומי
BglIINEBR0144Lאנדונוקלאז הגבלה לדיכוי הגברה של רצף HIV-1 U5 במעלה הזרם
T4 DNA LigaseNEBM0202L/6218אנזים לחיבור קוולנטי של קצוות DNA תואמים
אוליגונוקלאוטידיםטכנולוגיות DNA משולבותמותאמות אישיתבקש מהחברה לטהר את האוליגוס. טיהור HPLC מספיק עבור DNA < 30 נוקלאוטידים; PAGE מטהר DNA ארוך יותר 
Advantage 2 Polymerase MixClontech639202תערובת מסחרית המכילה DNA פולימראז עבור PCR
dNTPs (תמיסות של 100 מ"מ)Thermo ScientificR0181לדלל את ארבעת הכימיקלים על הקרח במים סטריליים כדי להגיע לריכוזי ביניים מדאיגים של 2.5 מ"מ כל אחד dNTP
NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000ספקטרופוטומטר לקביעת ריכוז
ה-DNAQubit FluorimeterLife TechnologiesQubit®פלואורומטר 3.0 המשמש לאישור ריכוז DNA של ספריית אתר אינטגרציה
2200 TapeStation SystemAgilentG2964AAבדיקה מבוססת קלטת לאישור התפלגות גודל DNA של ספריית אתר אינטגרציה
MiSeqIlluminaSY-410-1003משמש ל-NGS
DNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
  4. Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3'-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
  5. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
  6. Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
  7. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
  8. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
  9. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
  10. Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
  11. Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
  12. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  13. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
  14. Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
  15. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
  16. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
  17. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  18. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  19. LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
  20. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
  22. Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
  23. Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
  24. Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
  25. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
  26. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
  27. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
  28. Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
  29. Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522(2009).
  30. Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
  31. Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
  32. Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
  33. Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
  34. Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
  35. Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
  36. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49(2008).
  37. Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
  38. Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
  39. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
  40. Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90(2014).
  41. Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
  42. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72(2011).
  43. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
  44. Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
  45. Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
  46. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  47. Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
  48. Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
  49. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  50. Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
  51. Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39(2015).
  52. Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
  53. Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
  54. Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
  55. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9(2015).
  56. Padmanaban, A., Walker, D. M. Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. , Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA. (2013).
  57. Kapa library quantification technical guide version v1.14. , KapaBiosystems. Boston, MA. (2014).
  58. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
  59. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  60. Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
  61. Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
  62. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
  63. Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
  64. Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46(2014).
  65. Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234(2004).
  66. Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
  67. Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. , (2010).
  68. LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
  69. Hocum, J. D., et al. VISA - Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212(2015).
  70. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
  71. TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. , Source: https://support.illumina.com/downloads/truseq-library-prep-pooling-guide-15042173.html (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ligation mediated PCRRestriction Enzyme DigestionSonication FragmentationDNA End RepairSemi nested PCRBLAT Genome MappingBEDTools Analysis

מאמרים קשורים