Method Article

השלמת אנליזה פונקציונלית (FCA): תרגיל מעבדה ומומש כדי להשלים את הוראת הביוכימיים

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התיקוף של פעילות אנזימטית מעורבת הביוכימיים ניתן הובהר באמצעות ניתוח השלמה תפקודי (FCA). מתואר בכתב היד הזה הוא assay FCA הוכחת הפעילות האנזימטית של אנזימים מעורבים במטבוליזם של חומצות אמינו, תגובה מחמירה חיידקים וביוסינטזה פפטידוגליקן חיידקים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay השלמה הפונקציונלית (FCA) היא assay in vivo כי נעשה שימוש נרחב על מנת להבהיר את הפונקציה / התפקיד של גנים / אנזימים. טכניקה זו נפוצה מאוד ביוכימיה, גנטיקה ותחומים רבים אחרים. סקירה מקיפה של הטכניקה כדי להשלים את הוראת הביוכימיים הקשורים לחומצות אמינו, פפטידוגליקן והתגובה מחמירה החיידקים מדווחת כתב היד הזה. שני cDNAs מן thaliana ארבידופסיס האורגניזם צמח מודל מעורבים במטבוליזם של ליזין (L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) ו aminotransferase טירוזין (tyrB) המעורבים במטבוליזם של טירוזין ו פנילאלנין מודגשים. בנוסף, פפטידוגליקן חיידקי מסלול אנבוליים מודגש באמצעות הניתוח של גן UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- טווה אנזים -2,6-diaminopimelate (Mure) מן spinosum חיידק Verrucomicrobium מעורב הצלב-linking של פפטידוגליקן. התגובה מחמירה החיידקים מדווחת גם באמצעות הניתוח של RSH (omolog h הסיר s r ELA /) גן bifunctional אחראי פנוטיפ היפר-רירני ב sp Novosphingobium החיידק. ארבע דוגמאות של FCA מוצגות. הווידאו יתמקד בשלושה מהם, כלומר ליזין, פפטידוגליקן ואת התגובה המחמירה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלמה פונקציונלית בהקשר של הבהרת הפונקציה (ים) / תפקיד (ים) של גן מוגדרת כיכולת של הומולוגי בפרט או גן orthologous לשחזר מוטציה מסוימת עם פנוטיפ הנצפה למדינת wild-type כאשר ההומולוגי או גן orthologous הוא הציג ציס או טרנס לתוך רקע המוטציה. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לבודד ולזהות את הפונקציה (ים) / תפקיד (ים) של גנים רבים. דוגמה מסוימת אחת היא בידוד וזיהוי של decarboxylase orotidine-5-פוספט קנדידה אלביקנס באמצעות מוטציה URA3 של ס cerevisiae ואת מוטצית pyrF של E. coli. 1 המחברים השתמשו בטכניקה זו כדי להבהיר את הפונקציה של גנים מעורבים במטבוליזם של חומצ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: המחברים מוכנים לספק זני חיידקים ו פלסמידים רקומביננטי כדי להקל על השילוב של ניתוח השלמה פונקציונלי למטרות הוראה ליחידים מעוניינים. פלסמידים ששימשו כדי להקל ניסויים השלמה פונקציונלי מפורטים בטבלה 1.

1. בניית פלסמידים עבור השלמה פונקציונלית

  1. שיבוט של Diaminopimelate aminotransferase (dapL) עבור השלמה פונקציונלית.
    1. הגבר את מסגרת הקריאה הפתוחה dapL (ORF) מן V. sp....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זני החיידקים כי מועסקי הניתוחים השלמים הפונקציונליים השונים מפורטים בטבלה 2.

ניתוח השלמה פונקציונלית: L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL)

.ה מוטציה AOH1 כפול coli (Δ dapD :: Kan2, dapE6).......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רבים מן הקורסים הם חלק בלתי נפרדים ביוטכנולוגיה ו הלימודים ביוסיינס המולקולרית בבית המכון הטכנולוגי של רוצ'סטר יש מרכיב מעבדה בנוסף חלק ההרצאה של הקורס. תוכנית הלימודים של שנת הלימודים 2014-2015 מכיל בסך הכל 48 קורסים, 29 מהם מכילים מרכיב מעבדה המייצגים כ -60%. קורס אחד כזה הוא יסוד לביוכימיה הצמח ופתולוגיה (FPBP), הרצאה בקורס / מעבדה מעורבב Bioseparations: עקרונות ושיטות (BPP), קורס שמתרחש במעבדה.

מרכיב המעב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOH ו MAS מודה המכללה למדע ובית הספר Gosnell Thomas H. למדעי החיים במכון רוצ'סטר לטכנולוגיה לתמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי ארצות הברית הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס AOH MCB-1,120,541.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli מוטציותמעבדת הדסון/סבקה או CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
אלקטרופורטורBiorad-USA1652100
קוביות אלקטרופורציהBiorad-USA1652082
חממה מבוקרת טמפרטורהגנרית
מיקרו-צנטריפוגהגנרית
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
תפוח אדמה דקסטרוז בינוניFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
PhenlylalanineSigma-AldrichP2126
אספרטטסיגמא-אולדריץA9256
ואליןסיגמא-אולדריץ'V0500
לאוציןסיגמא-אולדריץL8000
איזולאוציןסיגמא-אולדריץ'I2752
אורסילסיגמא-אולדריץ'U0750
ג'ילסרולסיגמא-אולדריץ'G5516
ארבינוזסיגמא-אולדריץ'A3256
טטרציליןסיגמא-אולדריץ'87128
Taq DNA פולימראזThermofisher Scientific10342-020
פלטינה pfx DNA פולימראזThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisherScientific K100-01
pCR2.1 וקטורThermofisher ScientificK2030-01
' '

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

Related Articles