יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לביצוע הדמיית ספקטרומטריית מסה סביבתית (MSI) של רקמות וניתוח MS של תא יחיד (SCMS) באתרו באמצעות בדיקה יחידה, שהיא מכשיר רב תכליתי ממוזער לניתוח טרשת נפוצה.

תקציר

הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) וניתוח ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) בתנאי סביבה הם שני תחומים מתפתחים עם פוטנציאל גדול לניתוח ספקטרומטריית מסה מפורטת (MS) של ביומולקולות מדגימות ביולוגיות. הבדיקה היחידה, מכשיר ממוזער עם יכולות דגימה ויינון משולבות, מסוגל לבצע גם ניתוח MSI סביבתי וגם ניתוח SCMS באתר. עבור MSI סביבתי, הגשושית היחידה משתמשת במיקרו-מיצוי פני השטח כדי לבצע ניתוח MS באופן רציף של הדגימה, וטכניקה זו מאפשרת יצירת תמונות MS ברזולוציה מרחבית גבוהה (8.5 מיקרומטר) מדגימות ביולוגיות כגון קטעי מוח וכליות של עכבר. ל-Ambient MSI יש את היתרון בכך שיש צורך בהכנת דגימה מועטה או בכלל לפני הניתוח, מה שמפחית את כמות החפצים הפוטנציאליים הקיימים ברכישת נתונים ומאפשר לרכוש ניתוח מייצג יותר של המדגם. עבור SCMS באתר, ניתן להכניס את קצה הבדיקה היחידה ישירות לתאים אוקריוטיים חיים כגון תאי HeLa, בשל גודל קצה הדגימה הקטן (< 10 מיקרומטר), וטכניקה זו מסוגלת לזהות מגוון רחב של מטבוליטים בתוך תאים בודדים כמעט בזמן אמת. SCMS מאפשר לרכוש רגישות ודיוק גדולים יותר של מידע כימי ברמת התא הבודד, מה שיכול לשפר את ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים ברמה בסיסית יותר ממה שהיה אפשרי בעבר. ניתן לשלב את מכשיר הבדיקה היחידה עם מגוון ספקטרומטרים מסה עבור טווחים רחבים של מחקרי MSI ו-SCMS.

מבוא

הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) היא טכניקת הדמיה מולקולרית חדשה יחסית המספקת את ההתפלגות המרחבית של התרכובות המעניינות על משטחים. במהלך ניתוח MSI, מדידות ספקטרומטריית מסה (MS) נרשמות על פני השטח על בסיס פיקסל בודד כדי ליצור תמונה דו-ממדית של המין המעניין ¹. לטכניקות MSI יש את היכולת לספק התפלגות תכונות מרחבית עבור מגוון גדול של מטבוליטים, מה שמאפשר לקבל כמות גדולה בהרבה של מידע מדגימה מאשר משימוש בטכניקות הדמיה מולקולרית מסורתיות, ויש להן פוטנציאל לשפר מאוד את ניתוח הדגימות הביולוגיות למחקרים ביולוגיים ופרמקולוגיה ². ניתן להפריד את MSI באופן נרחב לגישות לא-סביבתיות וסביבתיות. טכניקות ניתוח MSI שאינן סביבתיות, כגון יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) MS ³ וזמן טיסה יון משני MS (ToF SIMS) ⁴, מסוגלות לרזולוציה מרחבית גבוהה (בסביבות 5 מיקרומטר ו-100 ננומטר, בהתאמה) ורגישות גבוהה. עם זאת, שיטות אלו דורשות הכנת דגימה נרחבת, כגון יישום מולקולות מטריצה על פני הדגימה, וסביבת דגימת ואקום, שיכולה להכניס חפצים לנתונים המתקבלים. טכניקות סביבה כגון יינון אלקטרו-ספריי ספיגה (DESI) MS ⁵, יינון אלקטרו-ספריי אבלציה בלייזר (LAESI) MS ⁶ וננו-DESI MS ⁷ מסוגלות ל-MSI של דגימות עם מעט או ללא הכנה מוקדמת בסביבה הסביבתית, המסוגלת לייצר תמונות MS שעלולות לשקף את הדגימה במצבה המקורי ביותר. עם זאת, רוב הטכניקות הללו בדרך כלל חסרות את הרזולוציה המרחבית הגבוהה ורגישות הזיהוי בהשוואה לטכניקות שאינן סביבתיות, כאשר ניסויים נערכים בדרך כלל בסביבות 150 מיקרומטר לפיקסל ⁸.

ניתוח תאים בודדים (SCA) הוא תחום צומח שיש לו את היכולת לאפיין את ההרכב הכימי של דגימות ביולוגיות ברמה התאית. SCA מאפשר ניתוח של מערכות ביולוגיות ברמה בסיסית יותר מטכניקות ניתוח תאים מסורתיות, המייצרות תוצאה ממוצעת של אוכלוסיית תאים, מה שעשוי לספק תובנות שבעבר היו בלתי פתירות ⁹. טכניקות MS יושמו לאחרונה על SCA (המכונה ספקטרומטריית מסה של תא בודד או SCMS) באמצעות טכניקות לא סביבתיות כגון MALDI MS ¹⁰ ו-ToF SIMS ¹¹ שבהן תאים מטופלים מראש לפני הניתוח, ועם טכניקות סביבה כגון LAESI MS ¹² ושיטות מיצוי ישירות, כגון וידאו חי של תא יחיד-MS ^{13, 14}לנתח מגוון רחב של סוגי תאים כגון ביצים, צמחים וסרטן., לטכניקות הסביבה יש יתרון בכך שהן מיושמות על תאים חיים, מה ששוב ממזער את החפצים, מה שמוביל לייצוג טוב יותר של המטבוליטים בתאים החיים. עם זאת, השיטות המבוססות על מיצוי ישיר שתוארו לעיל מבצעות את תהליך מיצוי וניתוח הדגימה בשני שלבים שונים, מה שמביא לפער זמן במהלך הניתוח שעלול לשנות את המטבוליטים הקיימים בתוך הדגימה.

הגשושית היחידה, מכשיר רב תכליתי ממוזער המסוגל להוביל MSI סביבתי ברזולוציה מרחבית גבוהה על מקטעי רקמה ביולוגית ¹⁵ וכמעט בזמן אמת SCMS באתרם על תאים בודדים חיים ¹⁶. לבדיקה היחידה יש מבנה משולב המורכב מנימי קוורץ כפול קדח משוך יחד עם כניסת ממס המספקת ופולט ננו-ESI העשוי מנימי סיליקה התמזגו, המאפשר לבצע אספקת ממס ומיצוי אנליטים ממכשיר יחיד. במצב MSI הסביבתי, הגשושית היחידה ממוקמת על רקמת הדגימה ומתרחשת מיקרו-מיצוי פני השטח, מה שמאפשר ליצור תמונת MS עם רסטר ברזולוציה מרחבית גבוהה. במיוחד, הקצה המחודד של הגשושית הבודדת קטן מספיק כדי להיות מוחדר לתאים אוקריוטיים חיים לניתוח SCMS באתר, כאשר זיהוי המטבוליטים לוקח פחות משתי שניות בין החדרת הגשושית לזיהוי טרשת נפוצה, מה שמאפשר לקחת מידע כימי כמעט בזמן אמת. להלן הפרוטוקולים לייצור התקן הבדיקה היחידה ולביצוע מצבי MSI ו-SCMS הסביבתיים באמצעות טכניקות MS של בדיקה יחידה.

פרוטוקול

שימוש ורווחת בעלי חיים צריכים לדבוק מדריך NIH לטיפול ושימוש בחי המעבדה הבא פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC). דגימות רקמה עכבר נמסרו על ידי משתף פעולה ד"ר Chuanbin מאו.

1. רקמות עכבר פרק הכנה

1. מניחים איבר העכבר שלם של עניין (מוח, כליות, כבד, וכו ') למרכז של פלסטיק קטן היטב (למשל, צלחת תרבית תאים 12 גם), לצלול רקמות הטבעה המתחם עד בערך בגובה 10 מ"מ. ודא אין בועה נוצרה במתחם הטבעת רקמות שהאיבר מושם בכיוון הרצוי (כלומר, sagittal, עטרה, וכו ').
2. מיד למקום רקמות לתוך חנקן נוזלי להקפאה פלאש. עבור אחסון לטווח ארוך, לאחסן דגימות קפוא במקפיא -80 ° C.
3. קח את איבר העכבר קפוא להפשיר כדי -15 ° C ב טמפרטורותמחדש מבוקר cryomicrotome.
4. רקמה מאובטחת על בסיס פלדה עם כ 500 μl של מתחם הטבעת רקמות ומניחה על גבי cryomicrotome חתך הר כך את כיוון החתך הרצוי מוצג בפני הסכין.
5. סעיף הרקמה בעובי 12 מיקרומטר. מניחים פרוסות הרקמה מחולק על גבי שקופיות מיקרוסקופ פוליקרבונט ולהשאיר לייבוש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. עבור אחסון לטווח ארוך, לאחסן את השקופית קפוא במקפיא -80 ° C.

2. תרבית תאים

הערה: תרבית תאים בוצעה ארון בטיחות ביולוגי (רמה II הבטיחות הביולוגית) בתנאים סטריליים. קו התא הלה שמש כמערכת מודל, ותאים היו בתרבית בינונית תרבות השלמה עם הפרוטוקולים הקונבנציונליים הבאים:

1. ריאגנטים חמים (כלומר, טריפסין, בופר פוספט (PBS), ו תרבית תאים בינוני) ל -37 מעלות צלזיוס.
   הערה: בינוני תרבית התאים מכיל sa האורגניLTS, חומצות אמינו, ויטמינים, ואחרים. לקבלת רשימה מלאה של מרכיבים, עיינו ניסוח מהיצרן.
2. השג מדגם תא (למשל, 1 מיליליטר השעית תא הלה) ולהוסיף אותו לתוך 9 מיליליטר של מדיום תרבית תאים שלם בצלחת תרבית תאים סטנדרטית של 10 סנטימטרים. מספר התא הראשוני הוא סביב 0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. שמור תאים בתרבית על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ עבור 2-3 ימים עד פני השטח גדל מכוסים ב 70-80% על צלחת תרבית תאים. מספר מעבר תא שיא עבור כל סיבוב רצוף.
3. בצע passaging תאים (כלומר, תא פיצול) בצלחת תרבית תאים.
   1. מדיום הגידול לשאוב, ולהשתמש 5 מ"ל של PBS 1x כדי לשטוף את התאים. הסר PBS באמצעות קצה השאיפה סטרילי, דגירה התאים עם 2.5 מ"ל של טריפסין (0.25%) עבור ~ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים מהצלחת התרבות.
      שים לב: בפעם טיפול טריפסין בפועל צריכה להיות מותאמת על פי produ טריפסין הספציפיct שנרכשו מהיצרן. זמן טיפול לקוי עוזב את התאים מצורפים הצלחת, ואילו טיפול מופרז גורם מוות של תאים.
   2. תפסיק פעילות טריפסין על ידי הוספת 7.5 מ"ל תרבית תאים בינוניים מלאה, ולאחר מכן באופן אחיד resuspend התאים (הנפח הכולל 10 מ"ל). השתמש השעית התא לתרבות (שלב 2.2) או הכנת דגימות SCMS (שלב 2.4).
4. הכן את דגימות תאים לניסויים SCMS.
   1. מניחים שקופיות כיסוי מיקרו בודדים בצלחת 12-היטב, ולהוסיף 1.8 מדיום תרבות מ"ל התא 0.2 מ"ל של תרחיף תאים לתוך הבאר.
   2. לערבב בעדינות תאים עם תסיסה קלה של הצלחת, דגירה בסביבת 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 24 שעות. כדי לבצע טיפול תרופתי על תאים בתרבית, להוסיף פתרון המתחם תרופה (למשל, ב DMSO (sulfoxide דימתיל)) לתוך צלחת תרבית תאים 12 גם.
      הערה: ריכוז התרופה הסופית (למשל, 10 ננומטר, 100 ננומטר, 1 מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר) tזמן reatment (למשל, 4 hr) הן מגוונות על פי התכלית הספציפית של מחקרים. תאי מחוברי שקופיות מייקרו הכיסוי ומוכנים ניסויי CSMS (שלב 6).

3. ייצור חד חללי

1. מניחים את צינורות קוורץ כפול נשא (קוטר פנימי (ID) 127 מיקרומטר, קוטר חיצוני (OD) 500 מיקרומטר) לתוך חולץ micropipette לייזר ולמשוך מחט קוורץ כפול לשעמם. השתמש בפרמטרים הבאים כנקודות פתיחה: חום = 400, פיל = 3, Vel = 80, Del = 150, ו Pul = 250 (כל היחידות הינן יחידות של היצרן). ודא את המחט קוורץ כפול נשא משך יש קצה קונים עבור נכסי בדיקה אופטימליים. חותך את קצה המשך כך שיש ~ 5 מ"מ ארוך של נימי קוורץ unpulled כפול נישא עזבו בקצה השני.
   הערה: הפרמטרים בפועל של חולץ לייזר צריך להיות מותאם בהתאם לתנאים המפורטים עבור המכשיר.
2. חותכים מקטע ~ 80 מ"מ של סיליקה התמזגו נימי (ID 40 מיקרומטר, OD. 105 מיקרומטר) כמו ממס מתן נימים, ולהכניס אותו לתוך משעמם אחד בסוף השטוח של המחט קוורץ הכפול לשעמם.
3. חותכים מקטע ~ 40 מ"מ של סיליקה התמזגו נימי (ID 40 מיקרומטר, OD 105 מיקרומטר) ולהשתמש תער לגלח ~ 5 מ"מ של הציפוי polyimide מן-נקודת אמצע. השתמש להבת פרופן כדי לחמם במהירות למשוך את הנימים התמזגו לתוך פולט ננו electrospray יינון (ESI) עם להתחדד בסדר. חותכים פולט ננו-ESI (~ 7-10 מ"מ אורך), ולהכניס אותו לתוך הקדח השני בסוף השטוח של המחט קוורץ כפול לשעמם. לחלופין, השתמש חולץ לייזר לייצר להתחדד בסדר.
4. למרוח כמות מינימאלית של (~ 1-2 μl) שרף ריפוי UV על קצו השטוח של המחט קוורץ הכפול נשא ולהתעבות השרף באמצעות מנורת UV LED עבור ~ 20 שניות כדי לאבטח את ממס מתן נימים ואת ננו פולט ESI. הנהלים כדי להרכיב את החלקים הבודדים לתוך החללית-יחיד שמוצג באיור 1 א.
5. חותכים GL מיקרוסקופ רגילשקופית התחת (1 "x 3") לתוך לחצי לאורך. מניח את החללית האחת על קצה אחד של שקופית הזכוכית כך פולטת ננו-ESI הוא הצביע החוצה. החל אפוקסי הרגיל לגוף של-בדיקה האחת, כך הוא הופך להיות מאובטח על (איור 1b) שקופיות זכוכית. השאר למשך הלילה התקשות. זוג החללית חד המפוברקת עם ההתקנה יחידה בדיקה המשולבת (איור 1 ג '), אשר מחוברת ספקטרומטר מסה כפי שמודגם 1D איור.

4. לבנות את ההתקנה המשולבת יחיד חללית MS

1. שנה את מקורבות ממשק מקור יון של ספקטרומטר מסה לפברק דוכן (עם המיקום וגובה מתכוונן) של דיגיטלי סטריאוסקופ (1E דמויות 1F).
   1. לקדוח מקורבות ממשק מקור יון עם שני חורים המאפשרים את הקובץ המצורף של לוח אופטי אלומיניום. הפוך מכשיר מעקה שקופית מוט כוונון גובה (מצורףבשלב XY לתפקיד כוונון עדין), כך שמערכת סטריאוסקופ הדיגיטלית ניתן לחבר ללוח אופטי אלומיניום (1e האיור).
2. צרף מיקרוסקופ סטריאו הדיגיטלי השונה, מיקרוסקופ דיגיטלי USB, שלב תרגום מיניאטורי ידני XYZ עם בעל מהדק גמיש, מערכת תרגום הבמה הממונעת XYZ ללוח האופטי האלומיניום, שהוא רכוב על מקורבות ממשק מקור יון האישיות של ספקטרומטר המסה (איורים 1 ג ו 1F). השתמש בעל מהדק הגמיש לתקן את שקופית הזכוכית מצורפת עם א-בדיקה אחת.
3. צרף את ההתקנה חד בדיקה כדי ספקטרומטר מסה (1F איור). התאם את בעל מהדק גמיש הבמה XYZ מיניאטורי למקם את פולט של החללית-יחיד מול מפרצון של ספקטרומטר מסה. השתמש מיקרוסקופ דיגיטלי USB (עם זווית תצוגה מתכווננת) בצד של חללית בודדת במטרה לספק תמונה מוגדלת-ב של-p היחידטיפ חלוק או פולט ננו-ESI, ואת סטריאוסקופ דיגיטלית (עם גובה מתכוונן) מעל-בדיקה אחת כדי להציג את התאים ואת קצה החללית.
   הערה: שימוש מקורב מקור יון המקביל, מערכת חד בדיקה משולבת זה יכול להיות מצמיד את כל סוגים אחרים של ספקטרומטרים המוני מצויד מקורות יינון סביבה.

5. אמביינט MSI

1. ההפשרה ניתן למצוא בסעיף דוגמת בטמפרטורת החדר ומניחים אותו על מערכת הבמה תרגום ממונע XYZ מתחת-בדיקה אחת. לשנות את מיקום מדגם ידי שינוי קואורדינטות תוכנות שליטה.
2. באמצעות המזרק לשאוב ממס הדגימה בקצב מתאים (למשל, 0.2 μl / min), ולהחיל את מתח היינון (למשל, 5 kV). הבחירה של ממס הדגימה היא גמישה, ואת הנפוצים כוללים MeOH: מים (9: 1) ו אצטוניטריל. היקף המת של פולט ננו-ESI נאמד ~ 3 nl, והזמן בין החללית-surfaקשר ce והתבוננות אות יון הוא בדרך כלל פחות מ -1 שניות ^15.
   ההערה: מקורב ממשק מקור יון האישי מאפשרת מתח היינון להיות מועבר מן ספקטרומטר המסה לאיחוד מוליך דרך קליפ תנין. המתח יינון מכן מועבר באמצעות איחוד מוליך אל הממס בתוך הנימים ואת הערוצים חד בדיקה, וכן להחיל על פולט ננו-ESI כדי ליינן את analytes שנדגמו. ודא שמתח היינון כבוי בעת חיבור קליפ התנין עם האיגוד המוליך.
3. התאם את הגובה של חללית-היחידה, כך הוא מונח בדיוק מעל פני השטח של המדגם ומסוגל לבצע שאיבת שטח של מטבוליטים. הרם בזהירות את הבמה Z, ולאחר מכן להשתמש מיקרוסקופ דיגיטלי USB (בצד של-בדיקה אחת) כדי לפקח על שינוי המרחק בין קצה חד בדיקה השטח רקמות. מעקב אחר השינויים בספקטרום ההמוני במהלך כוונון גובה זה, ולהפסיק להריםing את במת Z כאשר שינוי של אות היון מרקע ממס מטבוליטים רקמות הוא ציין.
4. צעד 5.3 חזור שלוש פעמים כדי להגדיר בשלוש נקודות שונות בתוך תכנית בקרת במת התאמה משטחת שטח אוטומטי. הנח את הקצה של החללית-היחידה בשלוש נקודות על פני שטח מדגם ממרחק של כ -10 מ"מימ מלבד אחד את השני. בצע כוונון גובה על ידי לחיצה על למעלה ולמטה סמלים, ולנעול את השלוש נקודות למקומו תחת "שיטת התכנית".
5. הגדר פרמטרים אחרים עבור rastering לרוחב פיסת עניין בתוך המדגם באמצעות תוכנית זו. עבור סעיפי כליות עכבר המוצגים כאן, להשתמש במהירות 10.0 מיקרומטר / sec rastering ו -20 מיקרומטר מרחק בין השורות. מערכת הבמה הממונעת יש תנועת תוספת 0.1 מיקרומטר מינימום. המרחק בין הקצה חד החללי והרקמות מתקבל צעד 5.3.
6. הגדרת שיטה לרכישה האוטומטית של MS ספקטרה מן ספקטרומטר המסה. For ברזולוציה גבוהה המונית MSI על מדגם כליות העכבר, השתמש בפרמטרים הבאים: רזולוציית המוני 60,000 (m / Δm), ~ 5 קילו וולט במצב חיובי, 1 microscan, 150 msec מקסימום זמן הזרקה, ו AGC על. כל ספקטרום MS רכש לייצג קווי בודדים של תמונת MS היה אותו המספר של סריקות עם ריווח זמן אחיד בין כל סריקה, המציין כי בגדלים פיקסל לתמונות המיוצר היו מפוזרים באופן אחיד.
7. ליזום את רכישת נתוני MSI. ליזום את רצף רכישת MS עבור ספקטרומטר מסה, ולאחר מכן ליזום את רצף rastering לתוכנית מלאה XYZ.
   1. לדוגמה, בתוכנית רכישת נתונים MS מנוצל כאן, עבור אל "הגדרת רצף", בחר "רצף חדש", לייצר סדרה של קבצים עבור רצף חדש הממוספרים מ 01 X, כאשר X הוא מספר השורות המשמש תמונת MS רצוי להילקח, ולאחר מכן ללחוץ על "רצף מפעיל".
   2. השתמש מכשיר אלקטרוני ביתי כדי לאפשר לתוכנה לייצר contaאות ct סגירה ספקטרומטר מסה כדי לאסוף את הנתונים. התרשים מעגל מוצג באיור משלים (איור S1) כהפניה.
8. לבנות תמונות MS מקבצי גלם MS באמצעות תוכנה ויזואליזציה MSI מתאימה. לדוגמה, בעת שימוש בחבילת התוכנה שפותחה על ידי קבוצתו של לסקין בגיל ¹⁷ PNNL, בצע את השלבים הבאים.
   1. לחץ על "גבות קובץ." בחר בקובץ הראשון המתקבל ניסוי MSI. ציין שבו מתחיל ומסיים הקובץ תחת "מספר הקווים". בחר טווח הערכים מ '/ z עבור מגוון תמונת MS תחת "טווח MZ זן".
   2. לחצו על כפתור "התחל" כדי להתחיל בתהליך יצירת התמונה. לאחר תמונת MS הוא עשה, לחץ על "שמור תמונה" תחת "סרגל כלים" כדי לאחסן תמונות במחשב.

6. In-situ חי SCMS

1. הגדרת מערכת-בדיקה אחת לפי להורותיונים עבור MSI. התאם את הממס (למשל, MeOH / H ₂ O או אצטוניטריל) קצב הזרימה (למשל, ~ 25 NL / min).
2. שוטף את התאים בתרבית, אשר מחוברים בשקופיות הזכוכית לכסות מייקרו, עם PBS להסיר תקשורת תרבותית ורכיבי תרופה תאיים. מניח תא המכיל זכוכית שקופית על מערכת במת תרגום ממונע XYZ עבור ניסוי.
   הערה: לחלופין, להשתמש במדיום תרבית תאים הטרי (ללא המכיל סרום שור עובר) כדי לשטוף תאים בתרבית. פחות דיכוי יון נצפה. בנוסף, התא יכול לשרוד במשך זמן ארוך יותר במהלך הניסוי שבו טמפרטורת הסביבה (~ 20 ° C) נמוכה משמעותית מטמפרטורת תרבות (37 מעלות צלזיוס). סוג התרופה, ריכוז פתרון, וזמן טיפול להשתנות במחקרים שונים.
3. פוקוס מיקרוסקופ סטריאו הדיגיטלי (מעל המדגם) על הקצה של החללית-היחידה לפקח חדירת תא במהלך הניתוח. השתמש מיקרוסקופ דיגיטלי USB (על sIDE של-בדיקה אחת) כדי לפקח על תנאי העבודה של פולט ננו-ESI על-בדיקה אחת.
4. השתמש תכנית בקרת במה הממונעת XYZ ומיקרוסקופ סטריאו הדיגיטלי (מעל תאים) כדי לאתר תאים של עניין, ודווקא עמדת הקצה חד החללי מעל המדגם. התחל רכישת נתוני MS לפני הקצה חד החללי מוכנס לתוך התא.
   1. השתמש בפרמטרים הבאים בתור אזכור לניתוח MS באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה: ברזולוציה המונית 100,000 (מ '/ Δm), ~ 3 קילו וולט במצב חיובי ושלילי, 1 microscan, 150 msec זמן הזרקת מקסימום, מצב AGC על. רכישה אוטומטית של ספקטרום MS נעשית על ידי לחיצה על "התחל" בתכנית רכישת נתוני MS.
   2. הרם את Z-הבמה הממונע על ידי לחיצה על הסמל לחדור את קרום התא ולשמור הקלטת אות MS שנוצרה מהתא. השהיית זמן של 1-2 שניות בדרך כלל הוא ציין בין החדרת החללית לבין זיהוי האות MS. כמו אישור נוסף על כךחדירה לתא, שינוי דרמטי של אותות MS ניתן לצפות על חדירה של קרום התא. אותות MS של תרכובות תאיות בדרך כלל יכולים להימשך ~ 15-20 שניות לפני הירידה משמעותית.
   3. תחתון למטה את התא המכיל צלחת למשוך את קצה חד בדיקה החוצה מהתא. זה בדרך כלל לוקח <15 שניות עבור אותות היון של תרכובות הסלולר להתקרב רמת הרעש. תן את זרימת הממס עבור ~ 3 דקות לחלוטין כדי לשטוף את החללית היחידה. בינתיים, למקם את מערכת במת XYZ הממונעת לאיתור בתא הסמוך כדי להיות מנותח. ניסוי כל תא דורש ~ 3 דקות כדי להיות מושלמות.

תוצאות

הסינגל-החללית שימש בהצלחה לניתוח MSI הסביבה של רקמת כליה עכבר מחולק ^15. המכשיר משתמש במנגנון של שאיבת מייקרו נוזלי משטח (איור 1 א), המספק חילוץ אנליטי יעיל ביותר מאזור קטן, שמוביל עוצמות אותות יון בשפע בתוצאות MSI. לדוגמא, עוצמת האות של יותר מ -10 ⁷ הושגה כמה מטבוליטים בשפע (איור 2 א). מספר רב של מטבוליטים התגלו באופן זה, כולל מספר ספינגומיילין (SM) ו phosphatidylcholine (PC) מינים כגון [SM (34: 1) + Na] ⁺ (725.5575 m / z), PC [(32: 0) + H] ⁺ (734.5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] ⁺ (782.5696 m / z), ו [PC (38: 5 + Na)] ⁺ (814.5726 m / z). תרכובות אלה זוהו עם רזולוציה גבוהה המונית ודיוק המוני כאשר מצמידי tOA ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זיהוי הושג עם פחות מ -4 עמודים לדקה m / דיוק המוני z (כלומר, ההבדל בין הערכים שנצפו ותיאורטי) עבור כל המטבוליט (איור 2b) בתוצאות שהוצג כאן. בנוסף, בד בבד MS מנתח (כלומר, MS / MS) נערכו גם לזיהוי בטוחים יותר מינים של עניין. ¹⁵

בשל היכולת לבצע שאיבת מייקרו נוזלית יעילה על שטח קטן, המכשיר חד הבדיקה שניתן להשתמש בם כדי לבצע ניסויי MSI ברזולוציה מרחבית גבוהים בתנאי סביבת ^15. לדוגמא, תמונות MS מפורטים סעיפי כליות עכבר התקבלו הממחישות את הפריסה המרחבית של מטבוליטים נבחרים (איור 2 ג). הרזולוציה המרחבית של התמונה MS היה נחוש בדעתו להיות 8.5 מיקרומטר, בעקבות מדד בשימוש נרחב של בעל transiti. על הנקודה של תכונה חדה נקבעה בתוך שינוי עוצם 20-80% של אות MS ¹⁸ במקרה של פוספוליפידים [PC (38: 5 + Na)] ⁺ על סעיף כליות _עכבר, המעבר בתכונות בין לשד הפנימי ואת לשד החיצוני מתקיים ברחבי מחזור סריקה אחד chronogram, מראה שינוי ביתר שאת מאשר 20-80 טווח%. בהתבסס על מהירות תנועה המדגם (10.0 מיקרומטר / sec) וקצב רכישת נתונים MS (0.85 שניות / ספקטרום), המדגם נע מרחק ב- MS אחד לסרוק מחזור (8.5 מיקרומטר), כלומר, את הרזולוציה המרחבית MSI, ניתן לחשב (איור 2d). רזולוציה מרחבית זהו מהגבוהים עדיין המושגים עבור טכניקות MSI סביבה שנערכו על דגימות ביולוגיות.

לקבלת SCMS את החללית היחידה הצליחה להשיג את הניתוח של תאי הלה חיים פרט ^16. גודל הקצה-הבדיקה האחת הוא בדרך כלל פחות מ -10 מיקרומטר (איור3a יור), שהוא קטן מספיק כדי להיות מוזן ישירות לתוך סוגים רבים של תאים איקריוטיים, מתוכם הקוטר הוא ~ 10 מיקרומטר, להפקה וניתוח MS. תהליך החדרת קצה חד החללית לתא ניתן לנטר ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו דיגיטלי (איור 3 ב), ואת החדירה קרום התא ניתן לאשר באמצעות שינוי מהיר ומשמעותי של ספקטרה המונית מן PBS (או תרבית תאים טריים בינוני) לתרכובות תאיות (3C דמויות 3D). הניסויים ניתן לבצע הן מצבי יון חיוביים ושליליים לזהות סוגים רחבים של מינים מולקולריים. לדוגמא, 18 מיני שומנים שונים זוהו במצב החיובי, כוללים ספינגומיילין (SM) ו phosphatidylcholines (PC), ואילו פוספטים אדנוזין (AMP, ADP, ו- ATP) התגלו במצב היונים השלילי (3C הדמוי ד). השהיית הזמן בין ה- i ההחדרה חד החלליתn כדי התא ואת גילוי אותות היה בדרך כלל פחות משתי שניות, המאפשר זיהוי כמעט בזמן אמת של מטבוליטים הסלולר. SCMS הוחלה גם בניסויים שבהם התאים טופלו עם תרופות אנטי-סרטניות (למשל, OSW-1, פקליטקסל, ודוקסורוביצין) ^19]. התרופות המקבילות ניתן זוהו בתוך תאי הלה לאחר הטיפול של 4 שעות בכל סדרה של ריכוזים (כלומר, 10 ננומטר, 100 ננומטר, 1 מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר) ב DMSO (sulfoxide דימתיל), באמצעות בתאים שלא טופלו (להוסיף DMSO רק כמו) הבקרות. אותות MS של תרופות לא היו נוכחים בתוך PBS התאי או באמצעות השלט (איור 3E), אך אותרו בתוך התאים הבודדים באמצעות טכניקת MS חד בדיקה (רק 100 תוצאות טיפול ננומטר מוצגות 3F איור). מכיוון שתאים היו שטופים עם PBS (או תרבית תאים בינוני טרי) להסיר תרכובות וזיהומים תאיים, זיהוי של מטבוליטים אנדוגני (למשל, שומני תאפוספטים ד אדנוזין) ותרכובות אקסוגניים (למשל, תרופות נגד סרטן) עולה כי הטכניקה MS חד בדיקה שניתן להשתמש בהם כדי לנתח תרכובות תאיים.

ייצור והתקנה באיור 1. של-בדיקה אחת לניתוח MSI ו- SCMS הסביבה. א) הליכי ייצור של-בדיקה אחת. ב) תצלום של המצורפת חד החללית מפוברק לשקופית זכוכית. ג) צילום של יחיד התקנת בדיקה מצורפת מסת ספקטרומטר. ד) תרשים של ההתקנה חד בדיקה יחד עם ספקטרומטר מסה. במהלך ניסוי, ממס הדגימה מסופק ברציפות מן המזרק, מתח היינון מוחל על איחוד המוליך מן ספקטרומטר המסה, שני מיקרוסקופים דיגיטליים משמשים לניטור מיקום מדגם, הבמה XYZ מהמונעתמערכה משמשת לשליטת מדגם תנועה, ספקטרומטר מסה משמש לניתוח. ה) תצלום של מערכת סטריאוסקופ הדיגיטלית אישית. f) התצלום שבו נראה סטריאוסקופ הדיגיטלית מחוברת המקורב ממשק מקור יון דרך לוח אופטי. נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תוצאות ממחקר MSI סביבה של קטע כליות עכבר עם רזולוציה מרחבית גבוהה המונית. א) ספקטרום המוני נציג מן-הבדיקה היחידה MSI. העוצמת המרבית של מטבוליטים זוהה יכול להגיע 3.39 x 10 ⁷ (יחידות שרירותיות). ב) מבחר של מטבוליטים שזוהו מוצג עם דיוק המסה שלהם. ג)תמונות MS של [PC (32: 0) + H] ⁺ ו [PC (34: 1) + Na] ⁺ שנלקחו קטע כליות העכבר ב -8.5 מיקרומטר ברזולוציה מרחבית. PC: phosphatidylcholine. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ; 0.20 מ"מ (הבלעה) ד) קביעת רזולוציה מרחבית של התמונה MS עבור. [PC (38: 5) + Na] ⁺ (מותאם באישור התייחסות 15). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. תוצאות מניתוח SCMS סביבה של תאים הלה מטופלים בתרופה עם רזולוציה גבוהה המונית. א) זום-אין תצלום של הקצה חד הבדיקה מראה בגודל טיפוסי של <10 מיקרומטר קוטר. ב) צולמו בנקודה החדרה חד חללית לתוך תא הלה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.ג) ספקטרום המוני במצב יון חיובי טיפוסי עם זיהוי של מספר PC (phosphatidylcholine) מינים. ד) רשימה מייצגת של מטבוליטים שזוהו מניתוח SCMS של תאי הלה הוא מצבי היון החיוביים ושליליים. EF) Mass ספקטרום עבור השליטה ומטופל (100 ננומטר OSW-1) תאים (מותאם באישור התייחסות 16). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור S1. מעגל דיאגרמה של המכשיר האלקטרוני המשמש לייצור אות סגירת מגע עבור ספקטרומטר מסה כדי לאסוף נתונים. אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את המספר הזה.

דיון

The-בדיקה האחת היא מכשיר רב תכליתי, שניתן להשתמש בם עבור שני ניסויי MSI ו- SCMS. ההתקנה חד הבדיקה (כולל מערכות במת תרגום, מיקרוסקופים, מקורב ממשק מקור יון, וכו ') נועדה לשמש מרכיב הרחבה כי ניתן להתאים בגמישות ספקטרומטר המסה הקיימת. חילופי דברים מהירים בין התקנה חד החללית לבין מקור יון ESI קונבנציונלי יכול להיות מושלם בתוך דקה אחת. באופן עקרוני, באמצעות מקורבות הממשק המתאימות יון המקור, ההתקנה חד הבדיקה יכולה להיות מותאמת לכל ספקטרומטרים המוני אחרים. בנוסף, ממס הדגימה המכיל מגוון של חומרים כימיים ניתן להשתמש עם ההתקנה יחידה בדיקה לניסויי MSI ו- SCMS תגובתי, אשר משפרת באופן משמעותי האיתור של טווח רחב של ביומולקולות. בנוסף לרקמות חית שורות תאים, את החללית היחידה היא גם מסוגלת לנתח מערכות ביולוגיות אחרות כגון צמחים. לכן, עם אותה התקנה ניסיונית ואימון משתמש דומה, מגוון רחב של מחקרים יכול להתבצע באמצעות מכשיר יחיד על ידי אותם משתמשים, המאפשר ניסויים יעילים צדדיים כדי להיות מושלמים עם זמן ההכשרה המינימאלי ועלות מכשור.

המרכיב העיקרי של הטכניקה MS חד החללית היא החללית עצמה. איכות-בדיקה אחת יש השפעה משמעותית על תוצאות הפעילות שלה, אשר קובע במידה רבה את איכות הן ניסויים MSI ו- SCMS. כאשר בודה-בדיקות יחידות, לוודא כי הנימים הפנימיות של הצינורות הכפולים הנישאים מודבקות היטב לחסל את הסיכוי של דליפה ממסה במהלך הניסויים. זה קריטי כדי להשתמש במינימום של אפוקסי לריפוי UV, כך הנקבים והנימים אינם סתומים במהלך ייצור הבדיקה.

הסינגל-החללית נעשה שימוש כדי לנהל MSI הסביבה ברזולוציה מרחבית גבוהה המונית על דגימות ביולוגיות ^15. היתרון העיקרי של סביבת MSI עלשיטות שאינן סביבה היא כי הכנת מדגם נשמרת לכל הפחות ללא צורך בסביבת דגימת ואקום, מאפשר מדגם להיות מנותחים במצב ⁸ יליד קרוב. אחד המכשולים העיקריים עבור טכניקת סביבת MSI ביותר האחרת כבר חוסר של רזולוצית מרחבית ^1. בהשוואת desorption המבוסס MSI טכניקות (כגון דסי ו LAESI), בגודל טיפ הקטן של-הבדיקה היחידה מאפשר שאיבת מייקרו נוזלי משטח חזקה יותר ויעילה להתבצע על פני שטח קטן, שתוביל לפתרון מרחבית גבוה של 8.5 מיקרומטר, אשר הוא בין אלה הגבוהים ביותר מושגת באמצעות טכניקות MSI סביבת ^15. בנוסף, התאמת הרכיבים של ממס הדגימה מספק גמישות נוספת כדי לבצע את הניסויים. לדוגמא, דגימת ממסים המכילים חומרים כימיים (למשל, תרכובות dicationic) שמשה לביצוע ניסויי MSI תגובתי, המאפשר גידול משמעותי במספר מטבוליטים PE המזוהיםr ניסוי ^20. היתרון השני של-הבדיקה אחת הוא העיצוב המשולב, אשר מספק את קלות התפעול במהלך תהליך רכישת נתונים כולו. בגלל המרחק בין קצה משטח רקמות רגיש מאוד עבור עוצמת אות יון ויציבות, קבלת קטע רקמה שטוחה וניצוח משטח משטחת התאמה כדי למזער את שונות המרחק הוא מפתח לניסויי MSI באיכות גבוהה. מכאן נובע כי טכניקות MSI חד החלליות אינן מתאימות כדי להשיג תמונות MS מרחבית גבוהות של משטחים לא ישרים.

בנוסף בודה בדיקה באיכות גבוהה, בזהירות כוונון כלי חיוני עבור ניסוי MSI מוצלח. בין כל שלבי הכוונון, התאמת גובה הטיפ חד החללי מעל פני קטע הרקמה היא אחד הקריטי ביותר. כאשר התאמת גובה הבדיקה, לשאוב ממס הדגימה ולהדליק את מתח היינון, כך אותות יון רקע הממס רק יכולים להיות observed. ולאחר מכן לעקוב אחר השינוי של הספקטרום ההמוני תוך בחינה זהירה צמצום המרחק-פני בדיקה על ידי הרמת Z-הבמה מהמונע עד אותות יון חזקים ויציבה מן קטע רקמה ניתן לצפות; גובה בדיקה זו תשמש לאיסוף נתונים MSI במהלך הניסוי. בנוסף, קצב זרימה ממס אופטימיזציה חיוני ניסויי MSI. התאם את קצב הזרימה עם גובה הבדיקה המותאמת. ודאו שאין התפשטות ממיס על פני שטח הרקמות (כלומר, קצב זרימה הוא גבוה מדי) או היווצרות בועה בתוך פולט ננו-ESI (כלומר, קצב זרימה נמוך מדי).

The-בדיקה האחת היא מכשיר רב תכליתי עבור bioanalysis. בנוסף ניסויים MSI, הוא מסוגל לנהל כמעט בזמן אמת ב- situ SCMS להבהיר מידע כימי מפורט מתאי איקריוטיים חי ^16, וזה יתרון גדול לעומת ואקום אחרים טכניקות SCMS מבוסס (כגון MALDI ¹⁰ ו SIMS ²¹ ). גדליו הקטנים של הקצה החללי מספקים את היכולת להיות מוכנס לתוך תא אוקריוטים חיים ולמיצוי ליינן התרכובות התאיות לניתוח MS מיידי. באופן דומה, ממסי הדגימה המכילים חומרים כימיים (למשל, תרכובות dicationic) יכולים לשמש בניסויי SCMS, ומגוון רחב של מרכיבים הסלולר ניתן לאתר בתא בודד חי מאשר אי פעם בעבר (מחקר מתמשך, נתונים אינם מוצגים). למרות שהניתוח בזמן האמת יספק את הפרופילים הכימיים של תאי בודדים חיים, בגלל החדירה לתא של קרום וסחיטת תוכן סלולארי, התא תחת החקירה ייהרג לאחר הניסוי, רומז כי טכניקת SCMS חד החללית נמצאת כעת עדיין שיטה הרסנית. בנוסף, את הקצה החללי הפולט ננו-ESI ב-הבדיקה האחת יכולים להיות סתומים בקלות עבור משתמשים לא מנוסים. כדי להקטין את הסיכוי של סתימת המכשיר, להבטיח כדי להימנע ממגע הגרעין כאשר הכנסת קצה חד החללית לתוך cell. אם סתימה מתרחשת, המכשיר יכול להיות מחדש על ידי מתחמם את הקצה החללי הסתום או ננו-ESI פולט באמצעות סליל חימום מהרכבת ^16. מגבלה נוספת של הטכניקה SCMS חד החללית היא שתאי דבק בלבד (כלומר, תאים המחוברים משטחים) ניתן לנתח באמצעות תוכנית ההתקנה הנוכחית. עם זאת, על ידי שילוב מערכת מניפולצית תא לתוך מנגנון MS חד החללי, סוגים רחבים יותר של תא יכולים להיחקר בעתיד.

בדומה לניסוי MSI, קבלת בדיקה באיכות גבוהה ושער זרימת ממס אופטימיזציה הוא קריטי עבור מחקרי SCMS. כאשר כוונון קצב הזרימה הממס, הקצה חד החללי ממוקם מעל המדגם (כלומר, ללא מגע עם המדיום הסלולרי או תרבות), ולוודא כי אין מטפטף ממס מקצה הבדיקה או היווצרות בועה בתוך ננו-ESI פולט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ייצור בדיקה יחידה
>צינורות קוורץ כפולים, 1.120' ’ וזמנים; 0.005 אינץ' וזמנים; 12 אינץ'	פרידריך & דימוק, בע"מ, מילוויל, ניו ג'רזי	MBT-005-020-2Q
חולץ לייזר מיקרופיפטה	סאטר אינסטרומנט ושות', נובאטו, קליפורניה	דגם P-2000
נימי סיליקה התמזגו, ID: 40  ומיקרו; מ', OD: 110  ומיקרו; m	Molex, Lisle, IL	TSP040105
שרף ריפוי UV	Prime Dental, Prime-Dent, שיקגו, IL, ארה"ב	פריט מס' 006.030
מנורת LED UV	פושאן ליאנג יה ציוד שיניים, גואנגדונג, סין	LY-C240
שרף אפוקסי	Devcon, Danvers, MA	חלק מס' 20945
מיקרופילטר מוטבע	IDEX בריאות & Science LLC, לייק פורסט, אילינוי	M-520
Microunion	IDEX בריאות & Science LLC, לייק פורסט, IL	M-539
שקופית מיקרוסקופ (זכוכית)	C & A Scientific - בכורה, Manassas, VA	9105
	המילטון, רינו, NV	1725LTN 250UL
<חזק>ספקטרומטר מסה
LTQ Orbitrap Mass Sprectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	LTQ Orbitrap XL
Xcalibur 2.1 תוכנה	תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ, וולת'אם, MA
Fance Stage Control	Pacific Northwest National Laboratory, ריצ'לנד, וושינגטון
MSI QuickView	Pacific Northwest National Laboratory, ריצ'לנד, וושינגטון
<חזק>התקן סגירת מגע
USB-6009 רב תכליתי DAQ	National Instruments, אוסטין, טקסס	779026-01
DR-5V SDS ממסר	פנסוניק, קדומה, יפן	DR-SDS-5
Logic Gates דוחף קו 50 אוהם	Texas Instruments, דאלאס, טקסס	SN74128N
הגדרת בדיקה יחידה
שלב ליניארי ממונע ובקר (3 סטים)	ניופורט, אירווין, קליפורניה	Conex-MFACC
שלב XYZ מיניאטורי	ניופורט, אירווין, CA	MT-XYZ
שלב XY תרגום	ThorLab, Newton, NJ	PT1 ו-PT102
Thermo LTQ XL אוגן ממשק מקור יונים	מטרה חדשה, Woburn, MA	PV5500
מיקרוסקופ סטריאו דיגיטלי, 250X - 2,000X	שנזן D& F Co., שנזן, סין	Supereyes T004
USB מיקרוסקופ צילום דיגיטלי	DX.com, הונג קונג, סין	S02 25 ~ 500X
משאבת מזרק	Chemyx Inc., סטפורד, טקסס	Nexus 3000
לוח לחם אופטי מאלומיניום מוצק, 8 אינץ' x 8 אינץ' x 1/2 אינץ'	Thorlabs, ניוטון, ניו ג'רזי	MB810
מחזיק מהדק גמיש	Siskiyou, Grants Pass, OR	MXB-3h
<חזק>ממסים
>Methol	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO	34860 Chromasolv
Water	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	W4502
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	34967 Chromasolv
תרבית תאים
>Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)	Cellgro, Manasas, VA	10-013-CV
10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)	Gibco/Life Technologies, לונג איילנד, ניו יורק	10100-139
פניצילין/סטרפטומיצין	Cellgro, Manasas, VA	30-002-CI
10 מ"מ HEPES (pH 7.4)	Cellgro, Manasas, VA	25-060-CI
תמיסת מלח פוספט חומצה (PBS)	Cellgro, Manasas, VA	46-013-CM
TrypLE Express	תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA	12604-013
צלחות 12 בארות	קורנינג בע"מ, קורנינג, ניו יורק	בקבוק פלקון 351143
T25	קורנינג בע"מ, קורנינג, ניו יורק	משקפי Falcon 3055
Micro Cover, עגולים, מס' 1	VWR International, Radnor, PA	48380-046
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	VWR International, Radnor, PA	BDH1115-1LP
<חזק>הדמיית רקמות
Cyro-Cut Microtome	American Optical Coporation
Tissue-Tek, טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)	סאקורה פינטק בע"מ, טורנס, קליפורניה	4583
שקופית מיקרוסקופ (פוליקרבונט)	פתרונות אספקה מדעיים, כפר אלק גרוב, אילינוי	P11011P