Method Article

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

DOI:

10.3791/53924

⸱

May 17th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD הוא גורם שעתוק מיוגני בעל יכולת חזקה לגרום לטרנסדיפרנציאציה מיוגנית של קווי תאים רבים שאינם שריר מובחנים לחלוטין. המנגנונים האפיגנטיים המעורבים בטרנסדיפרנציאציה זו אינם ידועים ברובם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור זיקה כפולה ואחריה ספקטרומטריית מסה כדי לאפיין באופן ממצה שותפי MyoD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידול מסוף שרירי שלד מתחיל עם המחויבות של תאי מבשר mesodermal פלוריפוטנטיים כדי myoblasts. תאים אלה עדיין את היכולת להתרבות או שהם יכולים להבדיל הפתיל לתוך myotubes multinucleated, אשר לְהַבשִׁיל נוספת ליצירת myofibers. בידול מסוף שריר השלד בניצוחו של פעולה מתואמת של גורמי שעתוק שונים, בפרט חברי גורמים רגולטוריים שרירים או MRFs (Myod, Myogenin, Myf5, ו MRF4), המכונה גם משפחת גורמי שעתוק bHLH myogenic. גורמים אלה לשתף פעולה עם מתחמי שיפוץ-הכרומטין בתוך רשת רגולצית תעתיק משוכללת להשיג myogenesis שלד. לפי גישה זו, Myod נחשבת גורם שעתוק מאסטר myogenic המעוררים בידול מסוף שריר. רעיון זה מתחזק לנוכח היכולת של Myod להמיר תאים שאינם שרירים לתאי שריר שלד. כאן אנו מתארים גישה המשמשת לזיהוי Myodשותפי חלבון באופן ממצה על מנת להבהיר את הגורמים השונים המעורבים בידול מסוף שרירי שלד. המטרה לטווח הארוכה היא להבין את המנגנונים אפיגנטיים מעורבים בויסות גני שרירי שלד, כלומר., מטרות Myod. שותפי Myod מזוהים באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) ממערכת Heterologous מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון, ואחריו אימות של תפקיד שותפים רלוונטיים במהלך בידול מסוף שרירי שלד. צורות Aberrant גורם myogenic, או התקנה הסוטה שלהם, קשורות עם מספר הפרעות שריר: מיאסטניה מולד, ניוון myotonic, ראדומיוסרקומה וליקויי התחדשות שריר. ככזה, גורמי myogenic לספק מאגר של מטרות טיפוליות פוטנציאליות בהפרעות שריר, הוא לעניין המכאניזם שיוצר מחלה עוצמה, מנגנון שיקום שיכול לשפר את הטיפול במחלה. לפיכך, להבין." המפורטדינג של האינטראקציות מולקולאריים ואת התוכניות הגנטיות בשליטת גורמי myogenic חיוני תכנון רציונל של טיפולים יעילים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגניזמים רבים תאי איקריוטיים מורכבים של איברים ורקמות שונים. לכל רקמה תפקודית ביטוי דפוס גן ספציפי, אשר נקבע בכל שלב התמיינות. התמיינות תאים כרוכה הפעלה של גנים ספציפיים, תחזוקת הביטוי שלהם, בדרך כלל, השתקה של סט של גנים כאלה המעורבים התפשטות תאים. בידול שרירי השלד, או myogenesis, הוא אפוא תהליך רב שלבי, המתחיל קביעת תאי גזע mesodermal לתוך myoblasts, ולאחר מכן מוביל בידול הטרמינל של myoblasts אלה לתוך מונו בעלי הגרעין הראשון, ולאחר מכן רב-גרעיני, myotubes . לפיכך, myoblasts הוא "נקבע" תאים, כי הם עדיין מסוגלים להתרבות, אבל הם מחויבים שושלת שרירי השלד, ובכך יכולים להבחין אך ורק לתאי שריר שלד גם במהלך התפתחות עוברית או התחדשות שריר מבוגרת. תהליך מסוף שרירי שלד שונהentiation הוא מתוזמר על ידי תוכנה גנטית מיוחדת שמתחילה ביציאת צמיתת מחזור התא של תאי מבשר myoblast שמוביל השתקה מוחלטת של גנים הקשורים התפשטות, כגון גני מטרת E2F 1. ואכן, במהלך התהליך של בידול הטרמינל, מעצר התפשטות myoblast הוא צעד חיוני שמקדים את הביטוי של גנים ספציפיים שריר שלד ואת ההיתוך של myoblasts לתוך myotubes 2. תכנית כזו מאפשרת תאי גזע שריר בוגרים, המכונים גם תאי לווין, להבדיל במהלך תהליך ההתחדשות בעקבות פציעה בשרירי שלד.

Myogenesis יונקים תלויה באופן מכריע משפחה של לולאה בצורת סליל סליל בסיסית myogenic (bHLH) שעתוק גורמי Myod, Myf5, MRF4 ו Myogenin, מכונה לעתים קרובות כמו המשפחה של גורמים נחישות שרירי השלד או MRFs (גורמי תקינה שרירים) 3. כל אחד מהם ממלא תפקיד חיוני במפרט ו DIFferentiation של תאי שריר שלד ושיש לו דפוס ביטוי ספציפי 4 5-7. הפעלת Myf5 ו Myod מהווה את הצעד הקובע כי מתחייב לתאי שושלת myogenic, והביטוי הבא של Myogenin מפעיל myogenesis עם הפעלה של גנים ספציפיים שריר שלד, כגון MCK (שרירים קריאטין קינאז). גורמי שעתוק bHLH myogenic פעולה עם בני משפחת MEF2 בהפעלת גנים שריר מ לוקוסים שותק בעבר 8. הם גם מגרים שעתוק הגנים שרירי השלד כמו heterodimers עם חלבונים bHLH בכל מקום, E12 ו E47, המכונה חלבונים E, המחייבים כביכול E-תיבות 8 גנים רגולטוריים שונים אזורים. טוויסט, זיהוי (מעכב של בידול) וגורמים נוספים שלילי לווסת את התהליך הזה, על ידי מתחרה עם Myod עבור חלבוני E מחייבים 8.

Myod נחשב לשחקן המרכזי מפעילת בידול מסוף שרירים 9 מאז יש לו את היכולת להשפיע על קביעת myogenic / בידול (טרנס-דיפרנציאציה) תכנית ברבים באופן מלא מערכות בדיל הלא שריר 10-13. אכן, ביטוי כפוי של Myod ומשרה את בידול טרנס מסוגים סלולריים שונים גם אלה נגזרו אחר ממוצא embryologic 12. לדוגמה, Myod יכול להמיר hepatocytes, פיברובלסטים, מלנוציטים, neuroblasts, ו adipocytes לתאים דמויי שריר. הפעולה חוצה בהתפלגותו של Myod כרוכה הפעלה תקינה של התכנית הגנטית myogenic (גני המטרה שלה בעיקר) בסביבה לא-שרירי, במקביל כדי השתקת התכנית הגנטית המקורית (בעיקר, גני התפשטות).

בשנת מתרבים myoblasts, Myod מתבטאת אך אינו מסוגל להפעיל גנים היעד שלה גם כאשר הוא נקשר היזמים שלהם 14-16. לכן, הדרישה Myod להתבטא ברציפות myoblasts מובחן נשאר elu למדיsive. Myod יכול להדחיק גני ליעדו בשל הגיוס של אנזימי שינוי-הכרומטין דיכוי ב מתרבה myoblasts לפני הטעינה של הפעלת שיפוץ הכרומטין אנזימי 14,17. לדוגמה, ב מתרבים myoblasts, Myod קשורה תעתיק שיתוף מדכא KAP-1, deacetylases היסטון (HDACs) ו methyltransferases ליזין הדיכוי (KMTs), כולל היסטון H3 ליזין 9 או H3K9 ו H3K27 KMTs, פעיל לדכא ביטוי גנים היעד שלה על ידי הקמת 14,17 מבנה הכרומטין מקומית דיכוי. חשוב לציין כי הדו"ח האחרון עולה כי Myod הוא עצמו מפוגל ישירות על ידי H3K9 KMT G9a וכתוצאה מכך עיכוב של transactivating שלה פעילות 16.

המנגנונים אפיגנטיים המעורבים טרנס-הבחנה זו של תאים שאינם שריר ידי Myod הם ידועים ברובם. יש לציין, שורות תאים בעלי עמידות בידול טרנס-induced Myod. לכן, תאי הלה, Myod הוא גם פעיל אואפילו יכול לתפקד כמו מדכא ולא activator של שעתוק בשל חוסר ביטוי של למקטע BAF60C של הכרומטין שיפוץ המורכב SWI / SNF 18. מודל זה ולכן יכול להיות בחירה לאפיין את המנגנונים טובים יותר של דיכוי גני מושרה Myod. זה מתאים גם כדי assay את היכולת של Myod לגרום סביבת הכרומטין דיכוי בבית לוקוסי היעד שלה עם השותפים הקשורים אליו ולכן לחשוף את מנגנוני הדיכוי תלוי Myod ב מתרבה myoblasts מכוונן בידול סופנית.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי שותפי Myod באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון. השימוש בתאי הלה-S3 להביע ביציבות הדגל-HA-Myod רשאי לקבל מספיק חומר כדי לטהר את מתחמי Myod מתמציות גרעיניות מופרדות. זיהוי שותפי Myod במערכת Heterologous לווה validatiעל במערכת רלוונטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת הלה-S3 גרעיני מלח-שניתן להפיק ושברי הכרומטין הנכנס

  1. אוסף של תאים
    1. לגדול הלה-S3 דגל-HA-Myod והלה-S3 דגל-HA (קו תאים בלתי מבוקרת) ב בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% נסיוב עגל עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (צמיחה בינוני) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולח.
      הערה: תאים הלה-S3 להביע ביציבות תאי הדגל-HA-Myod והלה-S3 transduced עם וקטור הריק (הלה-S3 הדגל-HA) יכולים להיות גם הוקמו באמצעות הפרוטוקול מתואר: 19,20, או שנמסרו על ידי המחברים.
    2. להגביר תאים עד 10 150 מנות מ"מ ומחוברות מלאות של כל שורת תא (תאים הלה-S3 הדגל-HA-Myod והלה-S3 הדגל-HA).
    3. אסוף את supernatant (מכיל תת-אוכלוסייה לא חסיד) לתוך הצנטריפוגה L 5.
    4. שטוף את תת-האוכלוסייה החסידה עם 10 מיליליטר של PBS לכל צלחת 150 מ"מ, trypsinize תאי דקות 1 ב TEM בחדרperature (פתרון 0.05% טריפסין- EDTA, 2 מ"ל למנה 15 ס"מ).
    5. הוסף 4 מ"ל של המדיום לכל צלחת 150 מ"מ לאסוף את התאים לתוך צינורות 50 מ"ל.
    6. מערבבים את supernatant משלב 1.1.3 (ב טווה 5 L) והתאים משלב 1.1.5, להוסיף 500 מ"ל של מדיום הגידול מראש התחמם טריים עבור כל קו התא.
    7. להעביר את ההשעיה התא לתוך 5 טווה L ולגדול תאים עבור 60 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולח.
    8. הוסף 500 מיליליטר של מדיום גידול טרי לגדל תאים למשך 24 שעות.
    9. להוסיף 1 ליטר של מדיום גידול טרי לגדל תאים למשך 24 שעות.
    10. להוציא 1 מ"ל של השעיה התא לספור את התאים ולבדוק כדאיות התא. צבע 30 μl של ההשעיה תא עם 30 μl של 0.4% trypan כחול לספור בחיים (לא כחול) התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
    11. שמור את צפיפות התאים של 2 - 6 x 10 5 תאים / מ"ל ידי הוספת בינוני צמיחה טריים מדי יום; לא יעלה על 1 x 10 6 תאים / מ"ל. המקסימוםנפח עבור טווה אחד 5 L הוא 2.5 ל '
      הערה: השלבים הבאים, המשך על-ידי קבוצות של 2 - 2.5 ליטר של תרבות בצפיפות 1 x 10 6 תאים / מ"ל. חזור על שלבים 1.1.12 - 1.1.14 לאסוף כ 20 L (≈ 20 גרם של גלולה יבשה) של כל קו תא לפני שתמשיך לשלב הבא.
    12. תאים גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
    13. תאים Resuspend ב 100 מ"ל של קר כקרח PBS על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את הכדור.
    14. חזור על לשטוף על ידי resuspending את התאים עם 25 מ"ל של PBS קר כקרח, העברת ההשעיה לתוך צינור 50 מ"ל ו צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
      הערה: כדורי תא ניתן גם להשתמש מיד או קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.
  2. בידוד של הגרעינים
    הערה: בצע שלבים 1.2.1 - 1.4.3 בחדר הקר.
    1. buffe טרום צמרמורתrs ו homogenizers.
    2. אם באמצעות חומר קפוא, במהירות להפשיר את כדורי תא באמבט מים ב 37 ° C.
    3. Resuspend 20 גרם (≈ 20 מ"ל) של תאים 20 מ"ל (נפח שווה לגודל של התא גלולה) של חיץ hypotonic (לוח 3) באמצעות 10 מ"ל של חיץ בהתחלה, ולאחר מכן הוספת 5 מ"ל, ואז הוספת עוד 5 מ"ל. שטוף את טפטפות היטב עם חיץ טרי כדי לקבל את המקסימום של תאים.
    4. העברת 40 מיליליטר השעית תא לתוך homogenizer מראש צונן עם עלי צמוד.
    5. Homogenize תאים עם 20 משיכות בתוך homogenizer (20 פנימה והחוצה בתנועות) ולהעביר ההשעיה התא לתוך צינור 50 מ"ל.
    6. שטפו את homogenizer עם 7 מ"ל של חיץ סוכרוז (1/3 מנפח התא הראשוני, טבלה 3) כדי לשחזר את המקסימום של תאים. עבר השעיה זו במהירות לתוך צינור 50 מיליליטר משלב 1.2.5 לשמר את הגרעינים ולהגביל את הזליגה.
    7. להכתים aliquot 30 μl עם 30 μl של 0.4% TRypan כחול, לנתח תחת מיקרוסקופ כדי לשלוט יעילות תמוגה (אם תמוגה הוא מוצלח, כל הגרעינים צריכים להיות כחולים). במידת הצורך, חזור על שלב המגון.
    8. צנטריפוגה במשך 7 דקות ב XG 10,000 ו -4 ° C עד גלולת הגרעינים. שמור את supernatant כמו חלק cytoplasmic.
  3. הכנה גרעינית מלח-שניתן להפיק (SE) שבר
    1. Resuspend גלולה גרעינים ב 8 מ"ל של חיץ סוכרוז (נפח שווה לגודל של גלולה גרעינים). הוסף טיפה אחר טיפה תוך ערבוב ביסודיות על מערבולת 8 מ"ל של חיץ מלח גבוהה (נפח גלולה 1 גרעינים, טבלה 3) כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מ"מ NaCl. דגירה במשך 30 דקות על הקרח ומערבבים כל 5 דקות.
    2. הקטנת ריכוז NaCl 150 מ"מ על ידי הוספת 8 מ"ל (1/3 הנפח הכולל) של חיץ סוכרוז. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. אסוף את supernatant (חלק מלח-שניתן להפיק גרעיני, SE).
      הערה: או המשך לשלב 1.3.3 או לעזוב את SEחלק על הקרח במהלך הכנת חלק הנכנס הכרומטין ואז אולטרה צנטריפוגה שני שברים זמנית.
    3. SE Ultra-צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 85,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קח supernatant (≈ 26 מ"ל).
    4. להקפיא 100 aliquot μl בחנקן נוזלי. עבור לשלב 2 "טיהור מורכבת חלבון", באמצעות שאר לחלץ.
      הערה: aliquot היא לשמש פקד קלט במהלך שלב 5.1.1.
  4. הכנת שבר נכנס הכרומטין
    1. Resuspend גלולה (משלב 1.3.5). בקפדנות 7 מ"ל (נפח שווה לגודל של גלולה) של חיץ סוכרוז.
    2. להוסיף CaCl 2 לריכוז סופי של 1 מ"מ (28 μl של 0.5 מ 'CaCl 2 במשך 14 מ"ל של השעיה) כדי להפעיל MNase (שלב 1.4.4) ומערבבים.
    3. השעיה טרום חום 1 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף 70 μl nuclease micrococcal (MNase) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.0025 U / μl (1/200 דילול מ 0.5U / μl המלאי) ומערבבים.
    5. דגירה בדיוק 12 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבבים כל 4 דקות.
    6. מיד למקום את התגובה על הקרח.
    7. כדי להפסיק פעילות MNase, להוסיף 112 μl של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1/125 דילול) לריכוז סופי של 4 מ"מ. דגירה במשך 5 דקות על קרח.
    8. Sonicate 5 פעמים 1 דקות ב משרעת גבוהה, בין שני sonications לאפשר הפסקה של 1 דק '(10 דק' בסך הכל).
    9. Ultracentrifuge למשך 30 דקות ב 85,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
    10. אסוף את supernatant (חלק מועשר הנוקלאוזום, NE, ≈ 12 מ"ל).
    11. להקפיא 50 aliquot μl בחנקן נוזלי. עבור לשלב 2 "טיהור מורכבת חלבון", באמצעות שאר לחלץ.
      הערה: aliquot היא לשמש פקד קלט במהלך שלב 5.1.1.

2. חלבון טיהור מכלולים

הערה: המשך תמציות במקביל מכל שורת תאים (הלה-S3 דגל-HA-Myod ואת השליטה, הלא-S3 דגל-HA).

  1. טיהור מבוססת Flag-
    1. שרף דגל טרום לשטוף. השתמש 600 μl של דגל שרף (הממלאים המסחריים 50%) עבור כל נקודה ניסיון (SE ו NE שברים עבור כל קו תא).
    2. העברת שרף לתוך 15 מ"ל צינור, resuspend ב 13 מ"ל של קר TEGN (לוח 3), צנטריפוגות במשך 2 דקות XG ב 1000 ולהסיר supernatant. חזור 5 פעמים. אחרי שרף דגל האחרון לשטוף גלולה לתוך נפח שווה של TEGN (300 μl לכל נקודת ניסיוני).
    3. עבור כל נקודה ניסיוני, לערבב 600 μl של שרף דגל שטף תמציות חלבון המתאים (בתוך שפופרת 15 מ"ל עבור NE 12 מ"ל ו בתוך שפופרת 50 מ"ל במשך 26 מ"ל SE שברים, בהתאמה). דגירה על לילה גלגל מסתובב ב 4 ° C..
    4. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C, לשים בצד את supernatant ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד תוצאת מבחן יעילות הטיהור (2.2).
    5. עבור דגימות SE, resuspend שרף דגלב 4 מ"ל של TEGN ולהעביר שפופרת 15 מ"ל. חזור על פעולה זו 3 פעמים, כל פעם מעבירה אל שפופרת 15 מ"ל אותו כדי למנוע אובדן חרוזים. צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C ולהסיר supernatant.
    6. דגל לשטוף שרף 7 פעמים בתוך שפופרת 15 מ"ל באמצעות 13 מ"ל של TEGN ו צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C.
    7. לאחר לשטוף האחרון, resuspend ב 1 מיליליטר TEGN והעביר לתוך צינור 1.5 מיליליטר נמוך מחייב. צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    8. Resuspend ב 200 μl של פתרון פפטיד דגל ב 4 מ"ג / מיליליטר ב- pH 7.8 עבור כל נקודה ניסיון. מערבבים את החרוזים פפטיד. הוסף 200 μl של חיץ TEGN דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה, כדי elute חלבונים כבולים.
    9. צנטריפוגות במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C ולהעביר את שרף supernatant (eluate Flag) לעמודה ספין ריק להציב צינור 2 מ"ל.
    10. צנטריפוגה העמודה, לאסוף שמאל-על supernatant בצינור 2 מ"ל.
    11. אסוף שרף הדגל ידי הוספת חיץ TEGN לעמודה ומשך elution הדגל השני עם 200 μl של פתרון פפטיד הדגל (4 מ"ג / מיליליטר) הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך כל נקודה ניסיון.
    12. חזור על שלבים 2.1.9 - 2.1.10 לאסוף elution השני. שלב eluates הראשון והשני.
  2. מבחן של יעילות הטיהור
    הערה: במהלך שלב 2.1.11 - 2.1.12, לבצע SDS-PAGE ו מכתים כסף (2.2.1 - 2.2.2).
    1. קח 15 μl של eluates, להוסיף 5 μl של חיץ טעינת 4x ו -2 μl של 10x סוכן צמצום, להרתיח במשך 5 דקות ב 96 ° C ולהפעיל SDS-polyacrylamide 4 - ג'ל 12% על פי הוראות היצרן.
    2. כתם ג'ל באמצעות ערכת צביעת כסף (בהתאם להוראות היצרן). אם יש הבדלים ברורים בדפוסי חלבון בין דגל-HA-Myod ודגל-HA eluates מדומה, בפרט הלהקה של דגל-HA Myod (סביב 50 kDa, איור 1 א), המשך STE הבאp.
  3. Hemagglutinin (HA) טיהור מבוססת
    1. שרף לשטוף HA על ידי העברת לתוך 15 צינור מ"ל, resuspending ב 13 מ"ל של TEGN ו צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C.. צעד חוזר כביסה 5 פעמים. לאחר לשטוף האחרון חרוזים resuspend בנפח שווה של חיץ TEGN.
      הערה: הנפח חייב להיות מותאם על פי היעילות של טיהור הדגל מבוססת. התחל עם 300 μl ממלאי 50% המסחריים עבור כל נקודה ניסיון.
    2. עבר שרף HA עבור כל נקודה ניסיון לתוך צינור מחייב נמוך 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C, לחסל את המקסימום של החיץ לשטוף (לוח 3) ומוסיפות את eluates מן הטיהור מבוססת דגל שרף HA.
    3. דגירת צינורות על לילה הגלגל מסתובב ב 4 ° C..
    4. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C, לשים בצד את supernatant ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד תוצאת מבחן יעילות הטיהור (2.3.12.).
    5. מִחָדָשׁלהשעות את שרף HA ב 0.5 מ"ל של TEGN, להעביר לשפל חדש מחייב 1.5 מ"ל צינור. חזור resuspension פעם הוספת אל הצינור 1.5 מ"ל אותו כדי למנוע אובדן חרוזים דקות צנטריפוגות 2 XG ב 1000 ו 4 ° C. הסר supernatant.
    6. לשטוף חרוזים 8 פעמים באמצעות 1 מ"ל של TEGN בכל פעם, צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C והסרת supernatant (להימנע חרוזים לאבד). לאחר לשטוף האחרון, להעביר את החרוזים לתוך צינורות 0.5 מ"ל.
    7. להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. הוספת 100 μl של פתרון פפטיד בחינם HA (4 מ"ג / מ"ל) ב- pH 7.8 על חרוזים elute החלבונים כבול. דגירה על הגלגל מסתובב במשך הלילה ב 4 ° C..
      הערה: הכמות-פפטיד HA צריכה להיות מותאמת תלוי השפע של המתחמים.
    8. צנטריפוגות במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C ולהעביר את שרף supernatant (eluate HA) לעמודה ספין ריק להציב צינור 2 מ"ל.
    9. צנטריפוגה העמודה לאסוף שמאל-על supernatant בצינור 2 מ"ל.
    10. בצע elution שנייה עם 100 μl של פפטיד HA (4 מ"ג / מיליליטר) עבור כל נקודה ניסיון. דגירה על הגלגל מסתובב במשך הלילה ב 4 ° C.. חזור על שלב 2.3.8 - 2.3.9 לאסוף elution השני.
    11. שלב eluates הראשון והשני.
    12. יעילות הבדיקה טיהור על ידי SDS-PAGE ו מכתים כסף (ראה צעדים 2.2.) (איור 1 א).
    13. לרכז את eluate HA 30 μl באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם (מגבלת משקל מולקולרי נומינלית, NMWL) 10 kDa חתוכים על פי הוראות היצרן.
    14. מחלק את הדגימות המרוכזות לשני חלקים: 22.5 (3/4) ו -7.5 (1/4) μl. הצמד להקפיא 1/4 של דגימות בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. השתמש 3/4 חלק לעבור לשלב 3.
      הערה: החלק הקפוא 1/4 הוא לשמש לאישור של תוצאות ספקטרומטריית מסה על ידי כתם מערבי (ראה שלב 5.1).

3. ניתוח ספקטרומטריית מסה

הערה: השלבים הבאים יש לדון עם מתקן ספקטרומטריית מסה כי יבצע את הניתוח.

  1. מוסף 3/4 (22.5 μl) של דגימות עם 7.5 μl של חיץ טעינת 4x ו -3.3 μl של 10x סוכן הפחתת ומרתיחים במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
  2. דגימות טען על SDS-polyacrylamide 4 - ג'ל 12%. ג'ל לרוץ 150 V קבוע במשך 5 דקות כדי לאפשר לכל החלבונים להיכנס ג'ל ללא הפרדה.
  3. שטפו את הג'ל עם מים; לתקן במשך 20 - 30 דקות עם פתרון מקבע (חומצה אצטית 10%, 50% מתנול, 40% מים אולטרה נקיים) ולאחר מכן לשטוף את הג'ל 5 פעמים הקבועות במים אולטרה-נקיים.
  4. חותכים את רצועות המכילים חלבונים, חנות 1 מ"ל של מים בצינור 1.5 מ"ל ולשלוח למתקן ספקטרומטריית מסה.

ניתוח 4. נתונים

הערה: זוהי הנחיה כללית לניתוח. השלבים המדויקים יהיו תלויים במצב המסוים של הנתונים שנמסרו על ידי מתקן MSהמשמש לביצוע הניתוח (למשל, 21,22).

  1. השווה את הרשימה של החלבונים שזוהו "Myod" eluates עם הרשימה המתקבלת מקבילים כן בקרה שלילית. אל תכלול מניתוח החלבונים נמצאו בשתי הרשימות.
  2. סור חלבונים בעלי ≤2 מספר כולל של פפטידים מזוהה מרשימה נותרת.
  3. ביאור גישה תפקודי וסיווג תפקודי של הרשימה של חלבונים שהושגה באמצעות DAVID ביואינפורמטיקה משאבים (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) ולסווג את הרשימה של החלבונים 23,24.
  4. (אופציונאלי) הסרת מהרשימה "טרמפיסטים", טעונה חלבונים שאינם גרעיניים עם בכריכה adventitious חזק טעונים שלילית 25 DNA. אלה מכילים חלבוני cytoskeletal, cytoplasmic, המיטוכונדריה, קרום קולטן (קיפול חלבונים, חלבוני קבוצת נוגדנים ושונים בלוחות 1 ו -2).
  5. השווה בין הרשימה שהושגה של interactors Myod מתוך שברי SE ו NE לזהות חלבונים נפוצים חלבונים ספציפיים עבור כל חלק (איור 2).

5. אישור של interactors מזוהה על ידי המערב כתם

  1. אישור ב הלה-S3 דגל-HA-Myod והלה-S3 דגל-HA
    1. דגימות eluate הפשרה המתקבל הצעד 2.3.14 (7.5 μl) על קרח. להוסיף 12 μl של חיץ TEGN, 10 μl של חיץ טעינת 4x ו -3 μl של 10x צמצום סוכן. מרתיחים דגימות במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו דגימות קלט עבור המערבי סופג.
      1. להפשיר aliquots ממדרגות 1.3.9 ו 1.4.11 ולמדוד ריכוז חלבון, למשל באמצעות ערכת BCA (אחרי הוראות היצרן).
      2. השתמש 15 מיקרוגרם של חלבון לכל נתיב. מדוד את הכמות המתאימה של תמצית ולהתאים את עוצמת הקול של המדגם עד 15 μl עם חיץ TEGN.
      3. הוסף חוצץ טעינת 4x 5 μl ו1.5 μl 10x צמצום סוכן. מרתיחים דגימות במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
    3. ביצוע ניתוח כתם מערבי עם נוגדני עניין (ספציפיים עבור מועמד שותף שזוהה במהלך ניתוח MS) באמצעות 15 μl של דגימות eluate. השתמש תמציות קלט כביקורת של רמות חלבון אנדוגני (איור 3 א).
  2. אישור במערכת הסלולרית הרלוונטית
    1. הכנת התמצית גרעינית הכוללת של myoblasts עכבר C2C12.
      1. לגדול myoblasts העכבר C2C12 במדיום DMEM בתוספת 15% נסיוב עגל עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל ו סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולח. אין לחרוג 80% תא מפגש לשמור תאי מדינת שגשוג.
      2. לגדול לפחות שני 150 מנות מ"מ של C2C12 עבור נקודה אחת (נוגדן אחד) של immunoprecipitation (IP). לשאוב את המדיום, לשטוף תאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS.
      3. גרדו את התאים ולאסוף לתוך צינור 15 מ"ל. לִספִירַת הַנוֹצרִיםntrifuge ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant מחק.
      4. לאמוד את היקף התא הגלול (= תא V). בעדינות resuspend גלולה בתא 3 כרכים V של B חיץ hypotonic לשבש הממברנה cytoplasmic (לוח 3).
      5. להוסיף נפח תא V 0.44 x 10% NP-40 כדי להגיע לריכוז סופי של 1% (v / v). בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב.
      6. להוסיף נפח תא V 0.89 x של SR (לוח 3) כדי לשמור על שלמות הגרעינים. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי homogenize ההשעיה, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 2,000 XG כדי גלולה גרעינים.
      7. הסר את supernatant (חלק cytosolic). לאמוד את ההיקף גלול גרעינים (= nuc V). גלולת גרעינים גלולה ב nuc V נפח אחד של חיץ סוכרוז.
      8. הוסף טיפה אחר טיפה תוך ערבוב ביסודיות על nuc V נפח מערבולת אחד חיץ מלח גבוהה כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מ"מNaCl, דגירה במשך 30 דקות על הקרח. מערבבים כל 5 דקות.
      9. להוסיף nuc V נפח אחד של חיץ סוכרוז (כדי להקטין ריכוז NaCl 150 מ"מ) ו CaCl 2 (הריכוז הסופי 1 מ"מ). לְעַרְבֵּב.
      10. השעיה טרום חום 1 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף nuclease micrococcal להגיע סופי של ריכוז 0.0025 U / μl (1/200 ממלאים של 0.5 U / μl). לְעַרְבֵּב.
      11. דגירה בדיוק 12 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבבים כל 3 דקות.
      12. מייד למקום תגובה על קרח ולהוסיף EDTA (ריכוז סופי 4 מ"מ) כדי להפסיק פעילות MNase. דגירה במשך 5 דקות על קרח.
      13. Sonicate 5 פעמים עבור 0.5 דקות כל אחד ב משרעת גבוהה. בין שני sonications, לאפשר הפסקה של 0.5 דקות (5 דקות בסך הכל).
      14. Ultra-צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 85,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. אסוף את supernatant (תמצית גרעינית כוללת).
      15. מדוד ריכוז חלבון של תמצית הכולל הגרעינית, למשל באמצעות ערכת BCA (אחרי הוראות יצרן) והמשך immediatאיליי לשלב 5.2.2.
    2. Immunoprecipitation (IP) של Myod אנדוגני.
      1. טרום ברור תמציות, לשטוף 10 μl של חרוזים agarose חלבון G עבור כל נקודה IP.
        1. מעבירים את נפח הדרושים של חרוזים agarose חלבון G לתוך צינור 1.5 מ"ל, resuspend ב 1.4 מ"ל של TEGN קר, צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1,800 XG ולהסיר supernatant. חזור 3 פעמים.
      2. מערבבי חרוזי agarose G החלבון מראש שטף עם הנפח המתאים של תמצית גרעינית הכולל. השתמש 500 מיקרוגרם של חלבון תמצית הכולל גרעינית לכל נקודת IP.
      3. לדגור על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות מראש לנקות את התמציות.
      4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1800 XG ב 4 מעלות צלזיוס. שמור supernatant.
      5. מערבבי 5 מיקרוגרם של Myod Ab או 5 מיקרוגרם של IgG ארנב עם 500 מיקרוגרם תמציות גרעיניות הכוללות מראש פינה ב 1.5 מיליליטר צינורות מחייב נמוכים. להוסיף TEGN חיץ עד 1 מ"ל. לדגור על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
        הערה: בצע את following צעדים במהלך שלב 5.2.2.3.
      6. חלבון טרום לשטוף 7.5 μl / G פתרון חרוזי מניות לכל נקודת IP.
        1. מעבירים את נפח הדרושים של חרוזים לתוך צינור 1.5 מ"ל, חרוזים resuspend ב 1 מ"ל של TEGN צנטריפוגות ב 1,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הסר את supernatant. חזור 3 פעמים.
      7. חרוזי חלבון Resuspend / G ב 1.5 מיליליטר חסימת פתרון (לוח 3) לדגור על גלגל מסתובב הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      8. תמציות גרעיניות הכוללות צנטריפוגה מודגרות עם ABS (שלב 5.2.2.5) ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. שמור supernatant.
      9. צנטריפוגה חסמה חלבון A / G שרף (שלב 5.2.2.7) 1,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של חיץ TEGN. Re-צנטריפוגות ב 1,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את חסימת חיץ.
      10. Resuspend חסמו חלבון / G שרף ב 1 מ"ל של TEGN חיץ aliquot לתוך צינורות-חלבון מחייב לשפל חדש להשיג 7.5 blo μlחלבון A / G שרף cked לכל נקודה IP. צנטריפוגה ב 1,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולהסיר ככל האפשר של supernatant.
      11. מוסיף את התמציות הגרעיניות הכוללות מודגרות עם שרירי הבטן (או לשלוט IgG) שרף A / G. מערבבים דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על גלגל מסתובב.
      12. צנטריפוגה ההשעיה 1,800 XG ב RT במשך 2 דקות. בטל supernatant, resuspend ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף ההשעיה העברת לתוך צינורות מחייב לשפל חדש. לדגור על RT על גלגל מסתובב במשך 5 דקות.
      13. צנטריפוגה ההשעיה על 1,800 XG ב RT במשך 2 דקות, resuspend ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף דגירה ב RT על גלגל מסתובב במשך 5 דקות. חזור 4 פעמים. להעברת לשטוף האחרונה לצינור מחייב לשפל חדש.
      14. סר מרבי של supernatant. להוסיף 7 μl של חיץ לשטוף, 7 μl של חיץ טעינת 4x ו -3 μl של 10x צמצום סוכן על חרוזים, לערבב ומרתיחים במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
      15. ביצוע ניתוח כתם מערבי עם נוגדנים של interest (ספציפי עבור מועמד שותף עבור החיסון זרז חלבון). השתמש 1% (5 מיקרוגרם) של תמציות קלט כביקורת של רמות חלבון אנדוגני (איור 3 ב).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין את הסדרת פעילות Myod, ניטלנו האפיון הממצה של מתחמי Myod באמצעות טיהור ביוכימיים, מבוסס על immunopurification של צורה מתויגת כפולה של Myod ואחריו ספקטרומטריית מסה (MS). השימוש קו תא הלה-S3 להביע Myod דגל-HA-tagged וקו תאים בלתי מבוקרת להביע היתרי דגל-HA להשיג מספיק חומר כדי לטהר את מורכבות Myod ידי ביצוע טיהור פעמיים זיקה של דגל-HA-Myod.

א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת מאפשרת זיהוי ממצה של שותפים של גורם שעתוק, Myod. הוא גילה שותפי Myod במערכת Heterologous עמידה בידול נגרם Myod, כלומר תאי הלה-S3. לפיכך, על פי הגדרתו, שותפי Myod מזוהים באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף. אלה כוללים גורמי שעתוק בכלל רצף ספציפי, אנזימי שינוי-הכרומטין, חלבוני עיבוד RNA, קינאזות (לוחות 1 ו -2). מאחר ותאי הלה-S3 עמידים בידול-trans-induced Myod, פעילות Myod היא בעיקר דכאניים השותפים המזוהים צפויים להיות-repressors שיתוף Myod. ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדת Ait-Si-Ali נתמכה על ידי האגודה הצרפתית למיופתיות Téléthon (AFM-Téléthon); המכון הלאומי לסרטן (INCa); הסוכנות הלאומית למחקר (ANR), האגודה למחקר בסרטן (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; אוניברסיטת פריז דידרו ו"מי אני?" מעבדת המצוינות #ANR-11- LABX-0071 ממומנת על ידי ממשלת צרפת באמצעות תוכנית "השקעות לעתיד" המופעלת על ידי ANR תחת מענק #ANR-11-IDEX-0005-01. EB נתמך על ידי מענק INCa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>קווי תאים
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
<חזק>ציוד
ספינר778531
הומוגנייזר:  הומוגנייזר Dounce Wheaton432-1273 ו- 432-1271
מכשיר תסיסה לספינריםBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HemocytometerMarienfeld Superior 640610
צינורות קשירה נמוכהSorenson27210
עמוד ספין ריקBio-Rad7326204
<חזק>ריאגנטים
SDS-פוליאקרילאמיד 4-12%  ג'לטכנולוגיות חייםNP0336BOX
מאגר טעינה פי 4 Life technologiesNP0007
10x חומר הפחתהLife technologiesNP0004
ערכת צביעת כסףtechnologiesA8592
יחידות סינון צנטריפוגליות, 10KMilliporeUFC501024
חלבון G חרוזי אגרוזSigma-AldrichP4691
חלבון A/G  שרףThermo Scientific53132
שרף דגל (ג'ל זיקה נגד דגל M2-agarose)שרף Sigma-AldrichA2220
HA (אגרוז מונוקלונלי נגד HA)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
פפטיד ללא דגל (DYKDDDDK)Ansynth Service BVסינתזה מותאמת אישיתהשעיה של עד 4 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.8
פפטיד נטול HA (YPYDVPDYA)שירות Ansynth BVסינתזה מותאמת אישיתהשעיה של עד 4 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"מ Tris-HCl, ערכת בדיקת
חלבון מבוססת חומצה ביסינצ'וניניתThermo Scientific23225
מעכבי פרוטאזSigma-AldrichS8830
כימילומינסנציה משופרת מבוססת לומינול (ECL) HRP מצע טכנולוגיותחיים34075
BSASigma-AldrichA9647
DNA זרע סלמון גזוז (חומצה דאוקסיריבונוקלאית מלח נתרן מאשכי סלמון)סיגמא-אולדריץD1626
ספרמין טטרהידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'S1141
ספרמידיןסיגמא-אולדריץ'S0266
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS פועל מאגרטכנולוגיות חייםNP0001
DMEM (גלוקוז גבוה)Sigma-AldrichD0822טרום חם  ב-37 מעלות; C לפני השימוש
טריפסין-EDTA (0.05% פנול אדוםLife Technologies25300-054
SerumGE healthcare מדעי החיים PAA A15-102כל מנה של סרום צריכה להיבדק תחילה עבור התאים שלך.
פניצילין וסטרפטומיצין טכנולוגיות חיים15140-122
תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%טכנולוגיות חיים15250-061
מים (מסוננים סטריליים)סיגמא-אולדריץ'W3500
<נוגדנים חזקים>נוגדנים
HA מחולדה (12CA5)דגל 11583816001
סיגמא-אולדריץ'A8592
MyoDSanta Cruzsc-32758לשימוש עבור כתמים מערביים
MyoDSanta CruzSC-760לשימוש עבור משקעים חיסוניים וכתם מערבי
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Cell Signaling Technology8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
טובוליןסיגמא-אולדריץ'T9026
אקטיןסיגמא-אולדריץ'A5441
IgG עכברסנטה קרוזSC-2025
IgG ארנבסנטה קרוזSC-2027
עיזים נגד חולדות -HRPסיגמא-אולדריץ'A9037
עיזים נגד ארנב -HRPסיגמא-אולדריץ'A6154 
עיזים נגד עכבר -HRPסיגמא-אולדריץ'A4416
Life pH 7.8: ערכת BCA ' רוש

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270(2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858(2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MyoD InteractomeTandem Affinity PurificationMass SpectrometrySkeletal Muscle DifferentiationTranscription Factor PartnersCell FractionationFLAG Tag PurificationNuclear Extract AnalysisWestern Blot ValidationProtein Complex Isolation

Related Articles