מאמר שיטה

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של Discoideum Dictyostelium באמצעות אגרגציה מבחנים

DOI:

10.3791/53972

⸱

18 ביוני 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האמבה החברתית Dictyostelium discoideum עוברת מעבר התפתחותי לאורגניזם רב-תאי כאשר היא מורעבת. החלבון המשומר האבולוציוני קורונין A ממלא תפקיד מכריע בהתחלת ההתפתחות. באמצעות מבחני צבירה כשיטה העיקרית שלנו, אנו שואפים להבהיר את תפקידו של קורונין A בהתפתחות מוקדמת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמבת discoideum Dictyostelium נמצאת באדמה, האכלה על חיידקים. כאשר מקורות המזון הופכים נדירים, הם מפרישים גורמים ליזום תוכנית פיתוח רב-תאיים, במהלכה תאים בודדים chemotax לעבר מרכזי צבירה 1-4. תהליך זה תלוי בשחרור של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) 5. cAMP מופק בגלים דרך הפעולה המתואמת של cyclase adenylate ו phosphodiesterases, ונקשר לקולטנים cAMP G- חלבון בשילוב 6,7. Assay בשימוש נרחב כדי לנתח את המנגנונים מעורבים מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium eukaryote הנמוך מבוסס על התצפית של צבירת תא בתנאים שקועים 8,9. פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של התפקיד של coronin במחזור התפתחותי ברעב צלחות רקמות תרבות שקועה תמיסת מלח המאוזן (BSS) 10. Coronin A הוא חבר pr נשמרת נרחבהמשפחה otein של coronins כי היו מעורבים במגוון רחב של פעילויות 11,12. תאים Dictyostelium חסר coronin A הם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, פגם זה יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של cAMP מפל 10. הטכניקות המתוארות מחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים בשלבים הראשונים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium במעלה הזרם של מפל cAMP. לכן, ניצול assay אגרגציה זה עשוי לאפשר מחקר נוסף של coronin פונקציה ולקדם את הבנתנו ביולוגיה coronin.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפחת coronin של חלבונים הוא שמור ביותר ברחבי אאוקריוטים. חלבונים אלה מאופיינים על ידי הנוכחות של אזור אמינו מסוף טריפטופן-aspartate (WD) לחזור המכיל ואחריו אזור ייחודי מחובר לתחום מפותל-סליל carboxy מסוף 13,14 (איור 1). Coronins היו מעורבים במגוון של תפקודים תאיים, כולל רגולציה cytoskeletal האות התמרה 12. ביונקים, עד שש מולקולות coronin קצרות (coronin 1-6) וכן 'טנדם' coronin 7, יכולה להיות שותף הביע 12,15. Coronin 1 הוא בן המשפחה למד בצורה המקיפה ביותר, ו הוצג להיות מעורב הרס הפתוגן, הישרדות תא T ואיתות עצבית. איך, בדיוק, coronin 1 מבצע פעילויות אלה עדיין לא ברורים. בעוד coronin 1 הוצג להסדיר Ca 2 + ו cAMP תלוי איתות וכן F- תקטין cytoskeleton אפנון 16-18, שיתוף הפוטנציאל-expression של עד 7 בני משפחה ביונקים עשתה זה מאתגר ללמוד את הפונקציה מולקולרית של coronins במערכות אלה, בשל כפילויות פוטנציאליים. בניגוד אורגניזמים יונקים, discoideum Dictyostelium eukaryote נמוך מבטא רק שני בני משפחה coronin (א coronin, את ortholog של B יונקים coronin 1 ו coronin, את ortholog של יונקים coronin 7) עם כנראה לא יתירים פונקציות 15,19,20. עובדה זו הופכת discoideum Dictyostelium מודל חזק כדי ללמוד את הפונקציה של coronins.

כדי ללמוד את התפקיד של coronin ב discoideum Dictyostelium, אנו מושרה מעגל ההתפתחות ברעב צלחות רקמות תרבות המכילות תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ או באמצעות תאי סוג ברים או תאים חסרי coronin A 10. מצאנו כי התאים חסרי coronin לא הצליחו ליצור אגרגטים רבים-תאי על רעב. לקבלת הערכה כמותית מדויקת של פנוטיפ זההדמית תא חייה אוטומטית המתואר בפרוטוקול זה היא כלי חיוני. הפגם בייזום של התגובה רעב מוקדם בתאים חסר coronin A יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של מפל cAMP. היישום אקסוגני של פולסים cAMP לדמות לתחילת עבודות הפיתוח נוצל על ידי מספר מעבדות ב 8,9 בעבר. עם זאת, הליך זה ידוע גם להיות תלוי מאוד צפיפות תא ועיתוי. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן שואף להפחית variabilities הללו על מנת להבטיח רמה גבוהה של שחזור. יחדיו, טכניקות נוצלו במחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים במהלך השלבים המוקדמים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium ויש להם את הפוטנציאל לזהות החצים למעלה וכן effectors במורד הזרם של coronin פונקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. שים את התגובה הרעבה מוקדם של discoideum Dictyostelium ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות.
    1. לגדל תאים DH1.10 או תאים -deficient קורה בתוך הבקבוק Erlenmayer המכיל בינוני HL-5 (1 L: 5 גרם proteose peptone, 5 גרם thiotone E peptone, 10 גלוקוז גרם, תמצית שמרים 5 גרם, 0.35 גרם Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0.35 גרם KH 2 4 PO, 0.05 גרם dihydrostreptomycin-סולפט, pH 6.6) בשעה 22 ° C באינקובטור רועד עם סיבוב של 160 סל"ד. שמור התאים בצפיפות בין 0.01 x 10 6 תאים / מ"ל ו -2 x 10 6 תאים / מ"ל.
    2. בדוק צבירת תא, על ידי תאי DH1.10 קצירת יומן פאזיים וגדל 21 או תאי -deficient קורה 10 שנוצרו ברקע DH1.10, גדלים רועדים תרבות עם מדיום HL-5 על 22 מעלות צלזיוס. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ"ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG לשטוף את התאים פעמיים BSS (10 mM NaCl, 10 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl 2, pH 6.5).
    3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. כתוצאה מכך, תאי צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 סנטימטר בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס BSS.
    4. דמיינו צבירה ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות כפי שתואר קודם לכן 10, לקחת תמונות כל 135 שניות. באמצעות הדמית תא חי להגדיר מצויד האובייקטיבי 5X ומצלמת מכשיר אלקטרונים-הכפלת תשלום מצמידים אוטומתית את התוכנה המתאימה (ראה לוח חומרים).
  2. פועם cAMP של תאים discoideum Dictyostelium במהלך רעב.
    1. לבחון את השפעת פולסים cAMP לשימוש חיצוני על התפתחות תאים DH1.10 21 או תאים -deficient DH1.10 קורה 10, על ידי איסוף תאים. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ"ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף פעמיים BSS.
    2. couNT תאים באמצעות hemocytometer ו resuspend התאים בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מ"ל ב BSS. לנער את תרבויות (160 סל"ד) בשעה 22 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני יישום קטניות. להוסיף קטניות cAMP באמצעות משאבת peristaltic נשלט טיימר. לתכנת את המשאבה כדי לספק דופק שניות 5 כל 6.5 דקות של 15 μl של 50 ננומטר cAMP (ריכוז סופי) על פני תקופה של 5 שעות.
    3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. בהמשך לכך, צלחת התאים בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס"מ בצלחת 24 גם. אפשר לדבוק עבור שעה 1 ב BSS.
    4. דמיין צבירה לאחר 16 שעות ב 22 מעלות צלזיוס על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X.
  3. אינדוקציה של פיתוח discoideum Dictyostelium באמצעות חשיפה בינונית מותנה.
    1. כן בינוני מותנה טרי כמתואר 22. איסוף תאי יומן פאזיים DH1.10 21 או תאי -deficient DH1.10 קורית 10, מן רעד כתures עם המדיום HL-5 ב 22 ° C בעזרת פיפטה, צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף תאים שלוש פעמים PBM (0.02 M פוספט אשלגן, 10 מיקרומטר CaCl 2, ו 1 מ"מ MgCl 2, pH 6.1).
    2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, resuspend אלה PBM בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מ"ל ולנער במשך 20 שעות ב 110 סל"ד / 22 מעלות צלזיוס.
    3. אסוף בינוני מותנה לאחר צנטריפוגה ב g 400 × 3 דקות ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב 8000 גרם × במשך 15 דקות ב 4 ° C..
    4. מותנה מסנן בינוני דרך פילטר 0.45 מיקרומטר (ראה לוח חומרים) לדלל משולש ב PBM.
    5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס"מ בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס.
    6. supernatant Exchange של תאים עם המדיום המותנה שהוכן קודם לכן.
    7. דמיינו צבירהחרה 16 ​​שעות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים חסרים coronin מופע פגם בהתפתחות מוקדמת (איור 2). בהעדר coronin תאים אינם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, המהווה את הצעד הראשוני במהלך מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium. לכן, coronin ינוגן תפקיד במהלך התגובה הרעבה מוקדם ו / או איתות cAMP. אכן, חוסר היווצרות המצרפי רב-תאיים ב בהיעדר coronin מלווה cAMP מופחת איתות 10. עם זאת, היישום של פולסים cAMP אקסוגניים מלא משחזר את פנוטיפ wild-type (איור 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החלבונים coronin נמצאים מינים רוב clade איקריוטיים. Coronin Dictyostelium discoideum, את homologue של יונקים coronin 1, הוא מעורב בתגובה רעב מוקדם, מאז coronin A-לקוי התאים אינם מסוגלים ליצור מרכזי צבירה במהלך המוקדמות התפתחותי מחזור 10. כדי להיות מסוגל כמותית להעריך נכונת העיכוב בהתפתחות בין הזנים, הדמית תא מיקרוסקופ חי הגדרה עם בקר השלב אוטומטית היא כלי חיוני.

ד discoideum מנצל cAMP...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרכז המניות של דיקטיוסטליום על זנים וריאגנטים. מחקר זה מומן על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע של שווייץ וקנטון באזל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיה HL-5 (עבור 1 ליטר: 5 גרם פפטון פרוטאוז, 5 גרם פפטון תיאוטון E, 10 גרם גלוקוז, 5 גרם תמצית שמרים, 0.35 גרם Na2HPO4*2H2O, 0.35 גרם KH2PO4, 0.05 גרם דיהידרוסטרפטומיצין-סולפט, pH 6.6)
פרוטאוז פפטוןBD Bioscience211693
תיוטון E פפטוןBD Bioscience211684
תמצית שמריםBD Bioscience212750
גלוקוזAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2O Fluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
dihydrostreptomycin-sulfateSigma-AldrichD1954000
PBM (0.02 M אשלגן פוספט, 10 μ M CaCl<תת>2, ו-l mM MgCl2, pH 6.1)מתוצרת עצמית
(10 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl<תת>2, pH 6.5)מתוצרת עצמית
0.45-μ m פילטר Filtropure SSarstedt83.1826
Falcon 24-well צלחת תרבית רקמותפישר סיינטיפיק08-772-1H
מיקרוסקופ CellobserverZeissשנבנתה בהתאמה אישית
Zeiss
IPC Microprocessor– משאבת חלוקה מבוקרתISMATECISM 931
Axiovert 135M מיקרוסקופZeiss491237-0001-000
שייקר דגירהInforst HT Minitron
BSS תוכנת AxioVision

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Dictyostelium discoideumCoronin AAggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumStarvation ResponseDevelopmental Biology

מאמרים קשורים