Method Article

פיתוח של במבחנה Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

DOI:

10.3791/53974

⸱

June 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את הפיתוח והיישום של בדיקת התכווצות ג'ל להערכת תפקוד התכווצות בתאים מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס מעורב לעתים קרובות בפתוגנזה של מחלות מתקדמות כרוניות שונות כגון מחלת ריאות אינטרסטיציאלית. סימן ההיכר הפתולוגי הוא היווצרות מוקדים פיברובלסטיים, הקשורים לחומרת המחלה. תאים מזנכימליים המורכבים מהמוקדים הפיברובלסטיים מוצעים להיגזר ממספר מקורות תאים, כולל פיברובלסטים תוך-ריאתיים ששוכנים במקור ופיברוציטים במחזור ממח העצם. לאחרונה, תאים מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) אמורים גם הם לתרום לפתוגנזה של פיברוזיס. בנוסף, ניתן לגרום ל-EMT על ידי שינוי גורם הגדילה β, וניתן לשפר את ה-EMT על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כמו גורם נמק גידול α. בדיקת התכווצות הג'ל היא מודל אידיאלי במבחנה להערכת התכווצות, שהיא אחת הפונקציות האופייניות לפיברובלסטים ותורמת לתיקון פצעים ופיברוזיס. כאן מודגמת התפתחות של בדיקת התכווצות ג'ל להערכת יכולת ההתכווצות של תאים מזנכימליים שעברו EMT.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס מעורב בפתוגנזה של מחלות פרוגרסיבי שונות כרוניות, כגון מחלת ריאות אינטרסטיציאלית, סיסטיק לב, שחמת כבד, אי ספיקת כליות סופנית, טרשת מערכתית, ומחלות אוטואימוניות מחלה 1. בין מחלות ריאה אינטרסטיציאלית פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) הוא מחלה מתקדמת כרונית ומראה פרוגנוזה גרועה. סימן היכר הפתולוגי של IPF הוא הפיתוח של מוקדי fibroblastic המורכבים פיברובלסטים מופעל myofibroblasts המשויכים הפרוגנוזה. מקורותיה של פיברובלסטים ריאתי כאלו מוצעות לנבוע מכמה תאים mesenchymal, כולל fibroblasts ריאות תושב במקור ומדחסים fibrocytes ממח העצם. לאחרונה, מעבר mesenchymal-אפיתל (EMT) הוצע להיות מזוהה עם ההיווצרות של תאי mesenchymal <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכשירי 1. והתרבות של תאי אפיתל הריאות

  1. תאי אפיתל ריאה אנושית A549 תרבות (שורת תאים חסיד) ב בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 100 IU / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
  2. סר וזורק תקשורת תרבית תאים מן מנת התרבות, ולשטוף פעם עם 5 - 10 מיליליטר של בופר פוספט (PBS). לאחר הכביסה, מיד לשאוב PBS.
  3. הוסף 2 מ"ל טריפסין / חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.05%) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך EMT, תאי אפיתל לאבד סמנים אפיתל, כמו E-cadherin, ולהשיג ביטוי של סמנים mesenchymal, כגון vimentin ו α-שריר חלק אקטין 4,5. דגירה של תאי אפיתל ריאה האנושית A549 עם-β1 TGF ו- TNF-α גורמת EMT. הופעתו של תאי A549 נורמלים הם אבן חלוק כמו צורה וצורה משולשת היא מאפיין של תאי אפיתל (איור 3 א), אלא לאחר מגורה עם TGF-β1 ו- TNF-α, את המראה השתנה לצורתו ציר הארוכה דומה mesenchymal תאים (איור 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שפותח במחקר זה כולל שני שלבים. השלב הראשון מתבצע על מנת לגרום EMT, ואילו השלב השני הוא assay התכווצות ג'ל. מאז חשוב לאשר תאים עברו EMT, שלב 2 מספק השלמה מצוינת שינויי ביטוי מורפולוגיים גן. מחקרים קודמים הראו כי EMT של תאי A549 הושר על ידי TGF-β1 רק 24; עם זאת, כפי שכבר דווח בעבר 10, טיפול-α TNF משפרים EMT ורכישת סמני תא mesenchymal. הוא חשב כי מנגנוני EMT TGF-β בתיווך הוא הסמאד תלוי 25. TNFα משפר EMT-induced TGF-β1 שמוביל שיפור של התכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר טדאשי קויאמה על העזרה הטכנית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; מענק לקבוצת המחקר לאי ספיקת נשימה ממשרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן; מענק למחקר על מחלות אלרגיות ואימונולוגיה, יפן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMsigma aldrich11965-092עבור A549 בינוני
FBSGIBCO10437
גורם גדילה טרנספורמטיבי-ובטא; 1, אנושי, כימיקלים רקומביננטייםשל מעבדת וואקו209-16544
TNF-ואלפא אנושיים רקומביננטיים;מו"פ D systems210-TA/CF
E-Cadherin (24E10)טכנולוגיית איתות תאי31951:3,000 דילול
וימנטין (D21H3)טכנולוגיית איתות תאי57411:3,000 דילול
אנטי-&אלפא;-נוגדן טובוליןסיגמא אולדריץ'T90261:10,000 דילול
חד-שבטי אנטי-אקטין, &אלפא;-נוגדן שריר חלק& נ.ב.פ;סיגמא אולדריץ' A52281:10,000 דילול
נוגדן נגד N-cadherinBD Transduction Laboratories#6109201:1,000 דילול
IgG נגד עכברים, כבשים שלמות מקושרות HRP (נוגדן משני)GE HealthcareNA931-100UL1:20,000 דילול
Anti-Rabbit IgG, HRP מקושר לחמור בטן שלם (נוגדן משני)GE HealthcareNA934-100UL1:20,000
ריאגנט חסימתGE HealthcareRPN4182% ב-TBS-T
6 צלחת תרבית תאים מולטי-באר שקופה עם תחתית שטוחה TC, עם מכסהקורנינג#353046
צלחת תרבית תאים 100 מ"מTPP#93100
DMEM, טכנולוגיות חיי אבקה12100-046ל-4 פעמים; DMEM
סוג 1 קולגן ג'לניטה ג'לטיןCellmatrix סוג I-A
24 באר צלחת תרבית תאיםAGC TECHNO GLASS1820-024
מערכת תיעוד ג'ל ATTOAE-6911FXNGel imager
תוכנת ניתוח ג'לATTODensitograph, ver. 3.00תוכנת ניתוח המצורפת ל-AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), Penol RedLife Technologies25300054-24
Well Plates, לא מטופלIWAKI1820-024
Trypan Blue Solution, 0.4%Life Technologies15250-061
ערכת מיצוי RNAQiagen74106
טכנולוגיות חייםטרנסקריפטאז הפוך18080044
מערכת PCR בזמן אמתStratageneMx-3000P
SYBR ערכת PCR ירוקהQiagen204145
מעכב פרוטאז קוקטייל (100x)טכנולוגיות חיים78429
ממברנתPVDFערכת2392390
ביו-ראד5000006JA 
ג'ל פוליאקרילאמידATTO2331810
מגיב זיהוי כתמים מערביGE HealthcareRPN2232
מצלמת CCD קרהATTOEz-Capture מעכב
סיגמה אולדריךT9003-100MG
פוליאוקסיאתילן (20) סורביטן מונולאורטWako מעבדה כימיקלים163-11512
פוליאוקסיאתילן (9) אוקטיניל אתרWako כימיקלים מעבדתיים141-08321
ארנב mAb# ארנב mAb# דילול בדיקת חלבון ATTO טריפסין MG / ST

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (20....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Mesenchymal TransitionGel Contraction AssayMesenchymal CellsTGF Beta 1TNF AlphaA549 CellsCell ContractilityWestern Blot AnalysisImmunofluorescence StainingCell Culture Incubator

Related Articles