מאמר שיטה

מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות

DOI:

10.3791/53994

⸱

14 במאי 2016

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה של מיקרוסקופיה ארוכת טווח כדי לעקוב לאורך תאים בודדים בתגובה לטיפולים אנטי-סרטניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התגובה של תאים בודדים לתרופות אנטי-סרטניות תורמת באופן משמעותי בקביעת תגובת האוכלוסייה, ולכן הוא גורם מרכזי תורם בתוצאה הכללית. Immunoblotting, cytometry זרימה וניסויי תא קבוע משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד כיצד תאים מגיבים לתרופות אנטי-סרטניות. שיטות אלה חשובות, אבל יש להם חסרונות רבים. משתנה הם תגובות סמים בין סרטן תאים נורמלים, ובין תאים ממוצא הסרטן שונה, וחולף ותגובות נדירות שקשה להבין באמצעות מבחני מיצוע אוכלוסייה וללא יכולת לעקוב ישירות ולנתח אותם אורכים. המיקרוסקופ הוא גם מתאים במיוחד לתאים חיים תמונה. התקדמות הטכנולוגיה מאפשרת לנו תאי תמונה שגרתי ברזולוציה המאפשרת לא מעקב תא בלבד, אלא גם את התצפית של מגוון תגובות הסלולר. אנו מתארים גישה בפירוט המאפשר הדמיה זמן לשגות רציפה שלתאים במהלך תגובת התרופה בעצם כל עוד רצוי, בדרך כלל עד 96 שעות. באמצעות וריאציות של הגישה, ניתן לנטר תאים במשך שבועות. עם העסקה של תהליכים רבים biosensors פלורסנט מקודד גנטי, שבילים ותגובות יכולה להיות אחריו. אנו מציגים דוגמאות הכוללות מעקב וכימות של גדילת התא התקדמות מחזור התא, דינמיקה כרומוזום, נזק לדנ"א, מוות של תאים. כמו כן נדונו וריאציות של הטכניקה והגמישות שלה, ולהאיר כמה מלכודות נפוצות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה Live- תא מעקב אורך של תאים בודדים היא לא טכניקה חדשה. מתוך המיקרוסקופים המוקדמים, חובבי מדענים הבחינו ולומדים תאים בודדים ואורגניזמים, ההתנהגויות שלהם, ופיתוח 1-3. דוגמה מפורסמת מן דיוויד רוג'רס המנוח באוניברסיטת ונדרבילט בשנת 1950 מראה נויטרופילים האדם כתם דם רודפים חיידק סטפילוקוקוס ולבסוף בתהליך של phagocytosis 4. חי בסרט תא זו הוא המחשה מצוינת לאופן שבו מספר רב של תהליכים שניתן לצפות בקורלציה בניסוי יחיד: חישה של שיפוע כימי, מכניקה ומהירות תנועתיות תא, תא מעצבת דינמיקה, הדבקה, ואת phagocytosis של פתוגן.

הופעתו של מיקרוסקופים אוטומטיים לחלוטין ומצלמות דיגיטליות רגישות גבוהה הביאה מספר גדל והולך של חוקרים באמצעות מיקרוסקופ לשאול שאלות יסוד f החל הביולוגיה של תאrom כיצד תאים להעביר 5,6 ולחלק 7,8 כדי אברון הדינמיקה וסחר הממברנה 9-11. ללא פלורסנט, מיקרוסקופיה brightfield, כולל שלב בניגוד (PC), אשר זכה בפרס נובל פריץ Zernike בשנת 1953, ואת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) לאפשר תצפית של תאים גרעינים, אלא גם במבנים המשנה הסלולר כולל חבילות microtubule , כרומוזומים, nucleoli, דינמיקת אברון, וסיבים יקטינו עבים 12. מקודד גנטית חלבוני ניאון לבין התפתחות של צבעי ניאון נגד אברונים השפיעו באופן דרמטי זמן לשגות מיקרוסקופית 13-15. אמנם לא המוקד של מאמר זה, הדמית spheroids תא באתרו (מיקרוסקופיה intravital) באמצעות confocal במיקרוסקופ multiphoton מייצגת הרחבה נוספת של הגישה, ויש מאמרים מצטיינים המשתמשים ולדון הגישות הללו 16-19.

התגובות של תאי אל-canc אנטיתרופות אה או מוצרים טבעיים נקבעות על הסולם המולקולרי תאי. לאחר טיפול תגובות גורלות תא הבנה כרוך לעתים קרובות מבחני מיצוע אוכלוסייה (למשל., Immunoblotting, אמצעים היטב שלמים), או בזמן נקודות קבועות עם זיהוי immunofluorescent ו cytometry זרימה, אשר מודדים תאים בודדים. הטרוגניות בתגובות תא בודדות לסמים בקרב אוכלוסייה, בפרט בגידולים, עשויות להסביר חלק ההשתנות בתגובה לראות פני שורות תאים וגידולים כי מטופלים עם התרופה הזהה ב רוויה. לטווח ארוך גישות האורך לעקוב תא בודד נתון או אוכלוסייה של תאים הוא גישה נפוצה פחות, אבל רב עצמה המאפשרת לחקר הישיר של מסלולי תגובה מולקולריים, פנוטיפים שונים (למשל., מוות של תאים או חלוקת תא), תצפית של תא אל תא השתנות בתוך אוכלוסייה, ואיך הגורמים הללו תורמים דינמיקה בתגובת אוכלוסיית 20-22. באופטימיות, יכולתלהתבונן ולכמת התגובות תא בודד יעזור לשפר את הבנתנו כיצד תרופות לעבוד, למה הם לפעמים נכשלים, וכיצד להשתמש בהם בצורה הטובה ביותר.

הטכניקה של מיקרוסקופיה לטווח ארוכת זמן לשגות, מעקב אורך, וניתוח תגובות סמים היא העומד לרשות חוקרים רבים והוא יכול להיות פשוט, באמצעות אור המועבר רק להתבונן תגובות פנוטיפ 20,21. הרכיבים העיקריים של הגישה כוללים: ההיערכות מתאימה של התאים בעלי עניין, מיקרוסקופ אוטומטי עם תא סביבתי, מצלמה משולבת עם מחשב לרכוש ולאחסן את התמונות, ותוכנה לעיין לשגות זמן למדוד ולנתח את התאים וכל biosensors ניאון. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם טיפים רבים לניהול מיקרוסקופיה זמן לשגות של תאים בתרבית למשך עוד כמה ימים באמצעות brightfield ו / או מיקרוסקופיה epifluorescent widefield. פרוטוקול זה יכול לשמש לכל שורת תאים שניתן גדלים בתרביתללמוד התגובות שלהם לטיפולים אנטי-סרטניים. אנו מספקים דוגמאות של נתונים רכשה ונותחו באמצעות חיישנים ביולוגיים פלורסנט גנטית בקידוד שונה מרובים דוגמה מיקרוסקופיה שלב בניגוד, לדון סוגים שונים בקצרה של בדיקות, את היתרונות והחסרונות של זמן לשגות לטווח ארוך ומעקב האורך, מה יכול להיות מלומדת הגישה הזאת כי קשה להבין מן הערוצים הלא ישירים, וכמה וריאציות שאנו מקווים יהיה עניין וערך לחוקרים מנוסים שלא נחשבו בגישה, וכדי חוקרים מנוסים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הבא נעשה שימוש בפרמטרים שהוגדרו על ידי ניסויי איורים 4 ו -6 הגדרות רכישה לגבי תנאי ניסוי. רבי פרמטרים אלו ניתן לשנות כדי להתאים ניסויים אחרים (כלומר, זמני חשיפה, binning, ערוצי ניאון, וכו '.). כל הנהלים חייבים לציית להנחיות ולתקנות מוסדיות יאושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית. אתרי היצרן מיקרוסקופ מכילים מידע מעולה עבור הדמיה תא חי.

מיקרוסקופי 1. ותוכנת הדמיה

  1. בצע הדמית תא חייה על מגוון רחב של מיקרוסקופים הפוכים. מיקרוסקופים הנפוצים ביותר הם widefield epifluorescence ו confocal ספינינג-דיסק. הנה, משתמש במיקרוסקופ epifluorescence widefield אוטומטי הממונע עם 200 ואט מקור מתכת הליד אור.
  2. השג-גבי במה או מיקרוסקופ חדר סביבתי. הנה, להשתמש במה-tבתא סביבתי op.
  3. השתמש בתוכנה מסחרית לפעול מיקרוסקופים עם כלי עזר לביצוע מיקרוסקופיה זמן לשגות.
  4. השתמש זמינה מסחרי תוכנה או ImageJ לניתוח תמונה. רבי כלי ניתוח אחרים זמינים מסחרי, ויש מחוייט תוכניות שרבים מהם פורסם 8,18.

2. חזותי תהליכים תאיים ותגובות פנוטיפי

  1. דמיינו תאים עם מיקרוסקופיה brightfield. בניגוד ניגודיות שלב התערבות הפרש לבד יכול להיות מאוד אינפורמטיבי ללמוד תגובות לתגובות תרופה אנטי-סרטניות. תהליכים אלו יכולים לכלול מיטוזה, תנועתיות התא אפופטוזיס.
  2. דמיינו מבנים תאיים, אברונים ותהליכים עם biosensors ניאון. בדיקות ניאון הם למידע בלבד מעקב תהליכים subcellular ספציפיים. אלו יכולים לכלול הדינמיקה microtubule, המיטוכונדריה ודינמיקה reticulum endoplasmic, הצטברות חלבון ולוקליזציה, ואיתות מולקולרית (למשל., זרחון, סידן).

3. הכנת דוגמאות

  1. לגדל תאי מנות מוסמכות תרבות תאי סטנדרט, תרבית תאי חממת humidified (למשל, 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2, 80% לחות יחסית).
    1. לגדל תאים HT1080 ב MEM עם EBSS. מוסף התקשורת עם FBS v / v 10%, 1% v / v פן / סטרפטוקוקוס, 1% v / פירובט נתרן נ ו 1% v / v חומצות אמינו לא חיוניות.
  2. ימים לפני ההדמיה, צלחת 50,000 תאי HT1080 FUCCI לתוך 3 בארות של צלחת 12-טובה # 1.5 זכוכית תחתונה במנדף למינרית זרימת סטרילי מוסמכת. התאם את מספר תאים מצופים להשיג ~ 60% מפגש לתחילת הניסוי. בהתאם לקו התא ואופי הניסוי צפיפות התאים עשוי להיות פחות.
    הערה: צפיפות התאים עלולה להיות השפעה עמוקה על הצמיחה של הקו הסלולרי ועל תוצאות הניסוי. ספירת תאים כדי למזער ניסוי אל ניסוי variability עקב צפיפות.
    1. בהתאם הקאמרי הסביבתי התנאים הדרושים לצורך הניסוי, תאי צלחת במנות גם אחת (בדרך כלל 35 או 60 מ"מימ), 4 גם מנות בגודל 35 מ"מ, 6, 12 או 24 גם צלחות תרבית תאים, או coverslip שקופיות בפורמטים שונים. השתמשו צלחות זכוכית תחתונה עם # 1.5 זכוכית כמו רוב העדשות האובייקטיביות ממוטבים עבור עובי זה של זכוכית, והדמיה באמצעות פלסטיק תרבית תאים שהוא ברמה מאוד ירוד.
      הערה: שורות תאים מסוימים אינם לגדול ולשרוד על זכוכית. במקרים אלה, הזכוכית יכולה להיות מצופה על מנת לשפר דבקות התא (למשל., פולי-ליזין או קולגן). חברות מסוימות לייצור פלסטיק תרבית תאים אופטי, זה צריך להיקבע באופן אמפירי אם זה הוא אפשרות מעשית.

4. סביבת לשכת קמה

  1. לפני כל התנסות, הגדרת התא הסביבתי, כך היא פועלת בתנאי לחות ~ 80% וכן הלאה הטמפרטורה במיקום המדגם היא 37 מעלות צלסיוס. רוב התאים בתרבית לגדול ב 5% CO 2 / איזון אווירת אוויר עקב חיץ סודיום ביקרבונט במדיום. בהתאם ההגדרה, או להגדיר את הבקר הסביבתי עד 5% CO 2 וזה יהיה לערבב 100% CO 2 באוויר, או להשתמש מראש מעורב, מוסמך 5% CO 2 / איזון גז באוויר. עקוב להנחיות יצרן בנוגע לספיקת גז.
    הערה: שורות תאי חלק לגדול ב- CO 2 בינוני עצמאי ובמקרה כזה הם יכולים להישמר ללא CO 2. באופן ספציפי תקשורת הדמית תוכנן זמינה גם שמגבילה תוספת של תרכובות autofluorescent. צמיחת מדיומי תזות עבור סוג התא הרצוי צריכה להיקבע באופן אמפירי מראש.
  2. לפני הדמיה, להבטיח את מאגר המים מלא (אם עוקבים אחרי ההוראות של היצרן) עם מים מזוקקים סטריליים. הפעל את בתא הסביבתי להגדרה לטמפרטורה הרצויה ומניח אותו לתוך ההבלעה הבמה מיקרוסקופ. כדי לחסוך דלק, לא להתחיל את הזרימה בשלב זה.
    הערה: אם יש מקום פנוי בין תא במה העליון ושלב ההבלעה ו / או כל מתח על כבלי חיבור לתא הוא עשוי להציג ממצא תנועה לתוך הניסוי.
    1. הנח פיסות סרט פרפין על הקצוות של פתיחת שלב ההבלעה לפני החדרת התא לתוכו כדי זוג בתא עד השלב, ולוודא כי אין קשרים מושכים על החדר.
  3. ולאפשר החדר כדי לאזן ל -37 מעלות צלסיוס לשמור על טמפרטורה יציבה כדי למנוע תנודות טמפרטורה במהלך הדמיה אשר עשוי להשפיע על פיזיולוגית תא להציג להיסחף. איזון טמפרטורה להגיע בדרך כלל דורש 30 דקות עד 1 שעה, בהתאם לסביבה.
    1. הכנס צלחת 'דמה' עם מים בקידוחי ההחדרה תוך ההתחממות. מנת הדמיה מלאה מחק מים המדגמים, עוזרת להבטיח החדר מחוממת מספיק התייצבה. מילוי הקאמרי עם מים סטריליים מחוממים מראשמפחית את הזמן הנדרש כדי ייצוב טמפרטורה וממזער הירידה בטמפרטורה על תוספת של המדגם הניסיון.

5. מיקרוסקופ הגדרה

  1. הפעל את המיקרוסקופ, המחשב קשור, וכל ציוד היקפי נדרש.
    1. בהתאם למקור האור, לחכות כדי להפעיל אותו עד הצורך (למשל., LED).
  2. עם הצריח אובייקטיבי במצב נמוך, בחר את המטרה 20X 0.7 NA לשמש.
  3. מקם את המדגם על המטרה - זה יעשה את זה קל יותר למצוא את התאים כאשר המדגם הוא בתא.
  4. הגדרת פרמטרים הדמיה בשלב זה אם הם ידועים מניסויים קודמים.

6. הובלה לתאים מיקרוסקופ ולתוך הקאמרי

  1. הובלת התאים להיות צלמו מן החממה לתא הסביבתי. ודא כי זה נעשה במהירות להגביל את ההשפעות של CO הנמוכה יחסית 2 אווירה וירידת טמפרטורה על התאים. מלאו אחר כל הנחיות הבטיחות הביולוגיות המוסדיות לתחבורת מדגם וניקוי במקרה של דליפה.
    1. מניח את התאים מיכל קלקר אטום או שקית מבודדת כדי למנוע שינויים סביבתיים גדולים.
  2. הכנס את צלחת ההדמיה מדגם לתוך התא הבא להוראות היצרן.
  3. אחרי התאים כבר מובטחים בתוך החדר הסביבתי, לאטום את החדר כדי לשמור על סביבה יציבה ומייד להפעיל את המקור (ים) של גז האטמוספרי.
    1. כמו תאים סביבתיים מסוימים לא לנצל מכסה הדוק, אטום, כדי לעכב אידוי, שכבת סטרילית, שמן מינרלים-מוסמך העובר על גבי מדיום הגידול. סרט לעטוף פרפין permeant-גז מסביב לקצוות-ההיקף של צלחת המדגם נזהר שלא לחסום את אזור הדמית זכוכית. יכולות להיות מועסקות מקומיות, שיטות humidification משניות. עיבוי על המכסה של צלחת המדגם יכול להפחית performance של מיקרוסקופיה brightfield.
  4. על מנת למזער את ההשפעות של סחיפה תרמית מוקדם במהלך הניסוי, לחכות 30 דקות לפני תחילת זמן לשגות. זמן הדרוש משתנה בהתאם לגודל מנת הדמיה וגורמים אחרים. לקבוע באופן אמפירי.

7. הגדרת ההדמיה

  1. תנאי הדמיה בחרו בצורה טובה ביותר ייצגו את הנתונים. לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע phototoxicity ידי הגבלת החשיפה פעמים, באמצעות אור בעוצמה נמוכה יותר ובחירת בדיקות כי הם נרגשים אורכי גל ארוכים יותר של אור.
  2. גדר x, y ו- z-המטוס רצוי אורך גל (ות) עבור כל עמדה להיות צלם. החלטת הזמן מוגבלת במספר עמדות אורכי הגל. עבור זמן לשגות לטווח ארוך של רוב תהליכים תאיים, לרכוש תמונה אחת כל 10 - 20 דקות; ברזולוצית זמן גבוהה (בפרקי זמן קצרים, למשל., 1 דקות) מספקת נקודות נתונים יותר ולכן מעקב תא חזק יותר, אבל גם תוצאות יותר משולבחשיפה לאור ערכות נתונים גדולות יותר.
    1. כמו HT1080 FUCCI יש חלבוני ניאון ירוק ואדום דינמיים (ראה תוצאות נציג), השתמש פעמי החשיפה הבאות: FITC / GFP - 50 msec, טקסס האדומה / TRITC - 40 msec, Brightfield - 20 msec. השתמש סל 2 x 2.
  3. אפשר autofocusing תוכנה נשלט באמצעות הפרמטרים של ברירת המחדל תחת הגדרות מתקדמות. גדר טווח פוקוס אוטומטי של 10 מיקרומטר עם גודל הצעד המומלץ. הקפד לעשות זאת לפני תחילת זמן לשגות. פוקוס אוטומטי עם תמונות brightfield ולעולם עם הקרינה להפחית phototoxicity ואת photobleaching.
    1. השתמש מערכות autofocusing מבוקרי תוכנה על כל מיקרוסקופ עם במה ממונעת, ולהתמקד ישירות על המדגם. עם זאת, הם יכולים להגביל את מהירות הרכישה של הניסוי. חומרת מבוקר מערכות התמקדות רציפה לעבוד גם עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות ולשפר את מהירות, המאפשרות עמדות יותר להיות צלמה או שיעור גבוה יותר של רכישה. עם זאת, הםלהסתמך על זיהוי של ממשק זכוכית האוויר ועלול לאבד את הפוקוס של המדגם עם וריאציות עובי זכוכית על פני הבאר.
  4. חלף חצי התקשורת עם תקשורת המכילה את ריכוז התרופה הרצויה כי כבר חמם עד 37 מעלות צלסיוס מדיה חלופית חלקית עוזר להפחית סחיפה תרמית. התנאים בניסוי זה הם רכב (DMSO), 1 selinexor מיקרומטר ו 10 מיקרומטר PD0332991.
    הערה: שלב זה יכול להיעשות גם לאחר תחילת הרכישה על ידי השהיית והפעלה מחדש של הניסוי. זה מאפשר מעקב אורך של תגובות לפני ואחרי תרופה של תאים בודדים. אם את יציבות התרופה או מטבוליזם היא דאגה, משתהה והחלפת התקשורת יכולה להיעשות עם אותה שיטה. כדי לבדוק שפלה או מטבוליזם תרופה, מדיה מתאי שטופל ניתן להציב גם על תא נאיבי לבדוק פעולת תרופה.
  5. הפעל את הזמן לשגות.
  6. ככל שהזמן לשגות פועל, ודא שהשדות צילמו להישאר בפוקוס ואת chamber שומרת על לח 37 o C.
    1. להתאים את המיקוד לפי הצורך על ידי השהיית הרכישה במהלך פער זמן בין נקודות הזמן.
  7. אם יש צורך, מוסיפים מים לתא במהלך הניסויים כבר. הימנע קירור החדר על ידי הוספת מראש התחמם, מים מזוקקים סטריליים על 37 מעלות צלסיוס

8. סיום זמן לשגות

  1. כאשר הניסוי יש להפעיל להשלמה, להפסיק את הרכישה אם זה לא היה מוגדר להפסיק באופן אוטומטי.
  2. ודא הזמן לשגות נשמר כראוי על גבי הכונן הקשיח, אם כי חבילות התוכנה ביותר לשמור באופן אוטומטי במהלך הרכישה אם לא הסתיים נתונים כראוי יכולים ללכת לאיבוד.
  3. הסר את התא המיקרוסקופ ועושה את התאים לתוך פסולת ביולוגית מסוכנת בעקבות הליכי בטיחות ביולוגיים מוסדית מאושרים.

9. מעקב אורך וניתוח של נתוני זמן לשגות

  1. בחר את המתודולוגיה לניתוח כי הואלנכס את התהליכים הביולוגיים של עניין. רבי plugins עבור ImageJ, תוכניות באמצעות Matlab, ופלטפורמות מנהג הופקו עבור יישומים ספציפיים. המתודולוגיה הבאה מכסה מעקב של גרעינים וניתוח של בדיקות ניאון גרעינית כפי שמודגם איורים 4 ו -5.
  2. פתח את ערימות תמונת .tif עבור הערוצים מנוצלים ImageJ. לחלופין, קבצי יליד פתוח מתוכנית הרכישה ישירות ImageJ באמצעות תוסף Bioformats.
  3. צייר אזור של (ROI) ואינטרסים בתוך גרעין של תא אחד באמצעות תמונה brightfield או בערוץ התווית גרעיני (אם משתמשים בו) ולהוסיף אותו מנהל ROI. הערה: אם התאים צלמו יש תווית גרעינית (למשל, היסטון H2B-EGFP.), ולאחר מכן מעקב תא אוטומטי עשוי להיות מנוצל כדי ליצור אזורים של עניין (ROIs) המייצג גרעינים בודדים לאורך זמן.
  4. להמשיך עד לנקודה בפעם הבאה ומקם את ההחזר על ההשקעה בתוך אותו nucleuים. מוסיפים את ההחזר על ההשקעה למנהל ROI.
  5. המשך לעקוב אחר ולעשות ROIs עבור תאים בודדים עד שלא יהיה אירוע הסלולר (מיטוזה, אפופטוזיס, וכו.) או התא כבר לא יכול להיות במעקב (כלומר., נע מחוץ למסגרת או שהניסוי מסתיים).
  6. כאשר ROIs הוקם תאים באמצעות הזמן הם בתחום, להרכיב אותם על ערוצי הניאון של עניין. למדוד את עוצמת הממוצע של הקרינה בכל אחד מהערוצים לכל נקודת זמן. שמור את רשימת ROI לשימוש מאוחר יותר.
    1. מדידות שונות יכולות להתבצע בתוך ההחזר על ההשקעה עבור יישומים בניסויים שונים. לחץ מדידות סט ניתוח → ... כדי להציג תפריט כדי לבחור את השיטה האנליטית (למשל., אומר עוצמת בתוך ROI, עוצמת משולבת, וכו.).
  7. הערת גורלות תא עבור תאים בודדים (למשל., אפופטוזיס, חלוקה, הישרדות) תוך מעקב. זה מאפשר יצירת עקומות הישרדות furtheניתוח אוכלוסיית r.
  8. עם עוצמת הממוצע של שני הערוצים, ליצור פיזור עלילה להציג דינמיקת מחזור התא בתגובה רפויה (איור 5 ב, ג).
    הערה: מגרשים ניתן ליצור עבור תאים בודדים לאורך זמן או בממוצע לכל אוכלוסיה של תאים במעקב. הדמיה כמוני יכולה להיות קריטית עבור הקמת תגובות מורכבות ומערכות יחסי תא בתגובה בריפוי הסרטן. מיקרוסקופיה זמן לשגות לטווח ארוך, מעקב אורך וניתוח נתונים הוא תהליך רב שלבים, עם אפשרויות רבות עבור הסוג של כלי מיקרוסקופיה וניתוח, ועוקבת אחר בקווים הכלליים הניתנים באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזמן לשגות לטווח ארוך מיקרוסקופיה מעקב אורך ישיר מאפשר לחקר השפעות רבות נגד הסרטן במהלך תגובת תרופה. בעקבות בקווים הכלליים באיור 1, מספר דוגמאות של תאים מוצגות להביע כתבי ניאון תוקפים כי שטופלו בתרופות אנטי-סרטניות, במעקב, ונותחו באמצעות גישות שונות.

מיקרוסקופ לעומת שלב לבד הוא מאוד אינפורמטיבי מדווח וחסון על שלבי ביניים לעומת מיטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתרונות של זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב לאורך שנים

המיקרוסקופ הוא מכשיר אידיאלי עבור מחקרים ארוכי טווח התגובה התרופה כפי שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים בודדים גורלם וכן את כלל האוכלוסייה. השתנות בתגובת סמים בתוך אוכלוסייה של תאים היא בעיה רצינית עבור עיצוב טיפולי נגד הסרטן. מעקב אורכית תאים בודדים מאפשר לחוקרים להתבונן השונות הזאת ולהתחיל להבין את המנגנונים ואת ההשלכות הבסיסיות כפי שהוא נוגע א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ושוע מרקוס על התמיכה הטכנית ולג'וליאן טיילר, Ph.D., מנהל מתקן הליבה למיקרוסקופיה קלה על שם ריצ'רד ג'יי מקינטוש, על הייעוץ הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מאוניברסיטת קולורדו בולדר ובית הספר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת קולורדו בולדר ל-J.D.O. R.T.B. נתמך חלקית על ידי מענק הכשרה קדם-דוקטורט מה-NIH (T32 GM008759). אנו מודים ל-Karyopharm Therapeutics, Inc. על הסלינקסור ול-Merck Serono על מעכב Kinesin-5. הפלסמידים של FUCCI הם מאטסושי מיאווקי (RIKEN, יפן) דרך MTA. mCherry-BP1-2 היה מ-Addgene. HeLa המבטא H2b-mCherry ו-β-tubulin-EGFP הם מדניאל גרליך (IMBA, האקדמיה האוסטרית למדעים, אוסטריה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טקסול (פקליטקסל)SigmaT7191תרופה מייצבת מיקרו-צינורית
EtoposideSelleckchemS1225מעכב טופואיזומראז II
SelinexorKaryopharm Therapeuticsומעכב XPO1/CRM1, מתנה
מעכב Kinesin-5Merck Seronoבמתנה, זמין גם מ-American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
מדיום גידול תאיםHyClone (פישר) או מדיטקחברות רבות זמינות
5% CO2 / אוויר מאוזן, איירגז מוסמךZ03NI7222004379
35 מ"מ צלחת, תחתית זכוכית 20 מ"מCellvisD35-20-1.5-Nחברות רבות זמינות
35 מ"מ 4 בארות צלחת, 20 מ"מ תחתית זכוכיתCellvisD35C4-20-1.5-Nחברות רבות זמינות
צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית מרושתתMatTekP35G-2-14-CGRDחברות רבות זמינות
רב-בארות, תחתית זכוכיתCellvisP12-1.5H-Nחברות רבות זמינות
אולימפוס IX81 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוךבקר אולימפוס
אולימפוס IX2-UCBאולימפוס
PRIOR LumenPro200קודם מדעיLumen200PRO
PRIOR Proscan III שלב ממונעPrio ScientificH117
STEV תאInVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
יחידת בקר סביבתיInVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD עם בקרHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon
השקת לייזר Nikon
SOLA מנוע אורlumencor
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
תא המועדון של TOKAI HITTOKAI HITTIZSH

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
  5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391(2015).
  35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
  51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Single Cell TrackingHT1080 CellsEnvironmental ChamberFluorescent BiosensorsCell Growth AnalysisChromosome DynamicsDNA DamageCell Death

מאמרים קשורים