מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Summary

מוצגת כאן שיטה להמחשת מבנה אולטרה-מבנה של מטריצה חוץ-תאית ברקמות לב נטולות תאים.

Abstract

פיברוזיס הוא מרכיב בכל צורות מחלות הלב ללא קשר לאטיולוגיה, ולמרות שנעשתה התקדמות רבה בתחום הביולוגיה של מטריצת הלב, עדיין ישנם פערים גדולים הקשורים לאופן שבו נוצרת המטריצה, כיצד שיפוץ פיזיולוגי ופתולוגי נבדל, והכי חשוב כיצד ניתן לתמרן את הדינמיקה של מטריצות כדי לקדם ריפוי ולעכב פיברוזיס. כיום אין אפשרות טיפול לשליטה, מניעה או היפוך של פיברוזיס לבבי. חלק מהסיבה היא ככל הנראה המורכבות העצומה של היווצרות צלקת לבבית, כמו זו המתרחשת לאחר אוטם שריר הלב כדי להחליף מיד קרדיומיוציטים מתים או גוססים. המטריצה החוץ-תאית עצמה משתתפת בעיצוב מחדש על ידי הפעלת תאים תושבים וגם על ידי סיוע בהנחיית תאים חודרים לנגע שנכחד. המטריצה היא גם מעין ארונית אחסון לחלבונים מטריאליים החיוניים לתחלופה תקינה של מטריצות, כמו גם לאיתות פיברוטי. בנוסף הוכח כי המטריצה ממלאת תפקיד אלקטרומכני ברקמת הלב. רוב הטכניקות להערכת פיברוזיס אינן איכותיות באופיין, אלא מספקות תוצאות כמותיות שימושיות להשוואה בין שתי קבוצות אך אינן מספקות מידע הקשור למבנה המטריצה הבסיסי. מודגשת כאן טכניקה להמחשת אולטרה-מבנה של מטריצת הלב. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של רקמת לב נטולת תאים חושף הבדלים בולטים במבנה שאחרת עלולים להחמיץ בשיטות מחקר כמותיות מסורתיות.

Introduction

פיברוזיס משבש את רשת הקולגן התקינה של שריר הלב, שהיא קריטית לתפקודים מכניסטיים תקינים של קרדיומיוציטים ^1,2 כמו גם לתקשורת בין-תאית, איתות תוך-תאי והישרדות תאים ³. התפתחות פיברוזיס היא גורם מכריע בתפקוד הלב, ושיפוץ פיברוטי של אינטרסטיציום הלב הנובע ממגוון אטיולוגיות מוביל לנוקשות מוגברת של החדר השמאלי ולתפקוד דיאסטולי ⁴. פיברוזיס שריר הלב עלול גם להוביל להפרעות קצב, ובין אם התקדמות השיפוץ הפיברוטי היא תופעה כללית או מקומית, היא קשורה מאוד לפרוגנוזה גרועה בחולים עם קרדיומיופתיה איסכמית ולא איסכמית ⁵. כמו כן, היעדר פיברוזיס בשריר הלב הוא מנבא חזק להתאוששות תפקודית חדרית והישרדות לטווח ארוך ⁶.

סימן ההיכר של פיברוזיס הוא שקיעה של עודף קולגן, בעל חוזק מתיחה של פלדה ⁷ ויכול להשפיע לרעה על תפקוד הקרדיומיוציטים במספר רמות. כוחות מכניים הנובעים ממטריצה קולגנית יתר על המידה יכולים להוביל לניוון קרדיומיוציטים ^8,9, נוקשות רקמה פסיבית ¹⁰, נוקשות שריר הלב הנגרמת על ידי התכווצות טוניק ^11-13, ואספקת חמצן מופחתת לאוכלוסיית הקרדיומיוציטים הנותרת. צימוד צומת פער של קרדיומיוציטים ו-myoFbs יכול גם לפגוע במאפיינים החשמליים של הלב, וליצור סיכון גדול יותר להתפתחות הפרעות קצב ^14-16. פיברוזיס פריבסקולרי משנה את התגובתיות כלי הדם של העורקים הכליליים והעורקים התוך-מורליים ¹⁷ ותורמת להיצרות לומינלית המפחיתה את אספקת החמצן ובכך את הישרדותם של קרדיומיוציטים ^17-22. שיפוץ פיברוטי וחשמלי פתוגני, הנובע מאתר ראשוני של פגיעה איסכמית או חוסר איזון אנרגטי, מתקדם בהכרח לאי ספיקת לב.

נמק קרדיומיוציטים יוזם את התגובה הפיברוטית, ושיפוץ פיברוטי שלילי לאחר מכן יכול להתרחש ללא קשר לאטיולוגיה. מציאת דרך לשלוט בפיברוזיס הלבבי תועיל מבחינה קלינית לטיפול בקרדיומיופתיה איסכמית ואידיופטית, מחלות לב יתר לחץ דם, קרדיומיופתיה היפרטרופית, מחלות לב מסתמים ודיסטרופינופתיות ^23-42. ללא קשר לאופן שבו מתחיל תהליך המחלה הפיברוטית, גורמים מסיסים ופרו-פיברוטיים יכולים לחצות את החלל הבין-רקמתי ולעורר הפעלה של פיברובלסטים אינטרסטיציאליים ואדוונטיציאליים באתרים מרוחקים לצלקת הפיברוטית הראשונית, וליצור אפקט מפל שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת לב. התרחיש האופטימלי יהיה לנצל את התהליך הפיברילוגני באמצעות טיפול ממוקד שניתן ליישם במהלך השלב ההיפרטרופי המפצה של קרדיומיופתיה לפני שהוא מתקדם לכשל במשאבה הסיסטולית או אי ספיקת לב דיאסטולית או תוצאות אחרות בשלב הסופי. המטרה הסופית תהיה להפוך את הפיברוזיס כך שניתן יהיה להחליף קרדיומיוציטים מתים ולשקם את תפקוד הלב לחלוטין.

חשיבותה של המטריצה מובנת באופן נרחב, אך שיטות לחקר המטריצה מוגבלות בעיקר למדידות כמותיות של רכיבים מבניים עיקריים, במיוחד קולגן, ורמות יחסיות של מטריצה וחלבונים מטריאליים שונים. פרוטוקול זה מדגיש טכניקה נדירה בשימוש שימושי להערכת הבדלים איכותיים במטריצת הלב. טכניקה זו שימשה לאחרונה כדי להשוות ולהנגיד הבדלים מהותיים במטריצות לב מאטיולוגיות שונות של מחלות לב (בצמחים אנושיים), לבחון לבבות מחזירים לאחר אוטם שטופלו באיזופורם גורם גדילת גליה (GGF) של נוירגולין-1β, בהשוואה לבעלי חיים שלא טופלו ⁴³, ולחקור הבדלים במטריצות של רקמות לב מ-MDX עכברים (מודל חי נפוץ של ניוון שרירים דושן) בגילאים שונים ובהשוואה לקבוצת ביקורת מסוג בר. טכניקה זו הוצגה לראשונה על ידי ד"ר קולפילד ובורג ב-1979 ⁴⁴, אך מחקרים מעטים השתמשו מאז בטכניקה רבת עוצמה זו ^45-47, שהוצגה כאן מחדש עם שינויים קלים בלבד. מתודולוגיה זו היא כלי מחקר רב ערך, מכיוון שהיא מספקת מידע איכותי על מבנה מטריצה חוץ-תאית, שאחרת ניתן להתעלם ממנו בעת מדידת תכולת רכיבי המטריצה ו/או רמת הפיברוזיס.

Protocol

משפט ואתיקה: הפרוטוקולים עבור טיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת שימוש (IACUC, פרוטוקולי מספר M / 10/117 (חזירים) ו- M / 10/219 (עכברים) ו נערכים על פי תקני AAALAC-בינלאומיים. שימוש של רקמות לב אנושיות פקידה אושר על ידי IRB במרכז הרפואי של האוניברסיטה ונדרבילט (מספר פרוטוקול 100,887).

לדוגמא 1. איסוף ואחסון

1. הפוך glutaraldehyde 4% טרי ב 0.1 M חיץ פוספט פתרון (PB).
   זהירות: Glutaraldehyde הוא רעיל, ללבוש כפפות ולעבוד במנדף.
   1. בצע פתרון 0.2 M המניות של PB, pH 7.4 באמצעות 21.8 גרם Na ₂ HPO ₄ ו -6.4 גרם לאא _{2 4} PO. Quantum satis (QS) 1,000 מ"ל DH ₂ O.
   2. להוסיף 400 μl של glutaraldehyde 50% עד 2.5 מ"ל של פתרון המניות PB ו -2.1 מ"ל DH ₂ O.
2. לטבול נתח (לא גדול מ -2 גמ ^'2) של רקמה לתוך פתרון glutaraldehyde 4%. הערה: חתיכות קטנות יכולות לשמש גם אבל צריך להיות בגודל מספיק (לא קטן מ -5 מ"מ ²⁾ להיות מדמיינים בקלות על ידי עין על מנת להקל צעדים מאוחר יותר של הפרוטוקול.
3. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, ולאחר מכן לאחסן לזמן בלתי מוגבל ב 4 ° C..

2. Decellularization של רקמת לב

1. הפוך בתמיסה מימית NaOH 10% טריים באמצעות 10 כדורי גרם NaOH / 100 מ"ל DH ₂ O.
   זהירות: פתרונות NaOH הם מאכלים והוא יכול לגרום אלקלי כוויות, ללבוש כפפות.
2. לשטוף רקמות ב DH ₂ O.
3. דגירה בתמיסה 10% NaOH בטמפרטורת החדר למשך 6 - 10 ימים (עד שינויים ברקמה מן אדמדם-חום מחוץ לבן או לבן).
4. יש לשטוף ב DH ₂ O עד הרקמה הופכת שקופה.
5. לטבול רקמות בחומצה טאני 1% ל -4 שעות בטמפרטורת החדר. השתמש 1 מ"ל 5% מניות פתרון לכל 4 מ"ל DH ₂ O.
   זהירות: חומצה טאניתהוא מגרה חזק, ללבוש כפפות.
6. יש לשטוף ב DH ₂ O לילה.

3. Osmication והתייבשות של רקמת לב (ב פומה הוד לבטיחות)

1. בצע פתרון 0.2 M המניות של חיץ נתרן cacodylate באמצעות cacodylate 21.4 גרם נתרן, סידן כלורי 10.0 גרם ו 450 מ"ל DH ₂ O. מערבבים, ולאחר מכן להוסיף חומצה הידרוכלורית לפי הצורך כדי להתאים את pH 7.4. Qs 500 מ"ל עם DH ₂ O.
   זהירות: cacodylate נתרן וחומצה הידרוכלורית רעילים, ללבוש כפפות ולעבוד במנדף.
2. הפוך פתרון המניות 2% מימית של tetroxide אוסמיום במנדף לבטיחות ידי המסת גביש tetroxide אוסמיום 1 גרם ב 50 מ"ל DH ₂ O.
   זהירות: tetroxide אוסמיום הוא מפגע משאיפת חמור; קיבעון האדים של ממברנות ריר או העיניים אפשרי, ומכאן להתמודד רק במנדף עם כפפות. שומר סנסציה מומלצת.
3. לשטוף רקמות במאגר cacodylate 0.1 M נתרן (לערבב פתרון מניות 1: 1 עם DH _{2 O) במשך 5 דקות על הכתף (או תסיסה עדינה).}
4. חזור על השלב הקודם פעמיים, עבור סכום כולל של שלוש שטיפות חיץ.
5. לטבול רקמות tetroxide אוסמיום 1% ב 0.1 M נתרן חיץ cacodylate (לערבב cacodylate נתרן המניות אוסמיום המניות tetroxide 1: 1) על הכתף במשך שעה 1.
6. לשטוף רקמות 0.1 M נתרן cacodylate חיץ 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד על הכתף.
7. לשטוף רקמות באמצעות ריכוזים גוברים של אתנול (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, ולבסוף 100%) במשך 15 דקות כל אחד על כתף.

4. הכנת פני שטח חתך עבור SEM

1. העברת רקמות באתנול 100% כדי בצלחת פטרי רדודה גם המכילה אתנול 100%.
2. להחזיק שני סכיני גילוח חד מאוד כך ולדירות הצדדים נמצאות בקשר אחד עם השני, וצלב קצות החיתוך ליצירת שני צדדים של משולש שווה צלעות מעל הדגימה. כדי להשיג זאת, להשתמש ביד שמאל למקום להב אחד בצד הימני או השמאלי של המדגםחתך שמאלה. במקביל, השתמש ביד ימין להציב את הלהב השני בשמאל הקיצוני של ימינה המדגם פרוס. לפיכך, הלהבים יהיו החליקו אחד נגד השני מכיוונים מנוגדים לעשות חתך אחד חלקה.
3. חלק את צדדי להב שטוח אחד נגד השני כדי לעשות חתך מאוד נקי של הדגימה עם עיוות מינימאלית או לקרוע כוח, רצוי לחשוף שטח פנים גדול ככל האפשר מבלי לפגוע הדגימה.
4. חזור על פעולה עבור כל דגימה לחשוף משטחי החתך האפשריים הנקיים לבדיקה ב SEM.

5. ייבוש נקודה קריטית (CPD) של רקמת לב

1. השתמש מרית או פינצטה להעביר רקמות לבעל המדגם של מייבש הנקודה הקריטי (CPD), להבטיח כי נשארה רקמה באתנול 100% בכל העת. ודא כי בעל שקוע אתנול כי העברת מושגת עם הרקמה החשופה לאוויר לא יותר מכמה שניות.
2. Operate CPD לכל לנוהוראות אה להשלים 3 טיהור-ו-למלא מחזורים להחליף אתנול עם פחמן דו חמצני נוזלי.
3. Operate CPD לכל ידנית של המשתמש כדי להשיג ייבוש נקודה קריטית של דגימות ולהחזיר אותם בלחץ אטמוספרי עם אוורור מבוקר של CO _2.

שמת 6. דוגמאות רקמה לב עבור SEM

1. כן בדל מדגם SEM עבור כל דגימה, על ידי דבקות כרטיסייה דבקה פחמן אל פני השטח העליון של בדל האלומיניום.
2. בעזרת סטראו, בזהירות לדבוק דגימה ללשונית הדבקה עם משטח החתך של עניין פונה כלפי מעלה (הרחק הכרטיסייה, גלויה), וקרוב ככל האפשר מקבילה עם המטוס של פני שטח בדל מדגם. אין לחקור או לגעת במשטח של עניין.
3. לשבור מקל מוליך עץ כדי להשיג מברשת מחודדת, אידיאלית עבור יישום צבע. החל כסף או צבע פחמן בבסיס והדפנות של הדגימה, כדי לשפר את דבקות הבדל.
4. הרחב קו דק מאוד של כסף או פחמן לצייר עד יתרון של פני השטח של עניין, כדי לספק נתיב תשלום מפני השטח של עניין הקרקע.
5. החל 2 או 3 מורח קטן של כסף או צבע פחמן מסביב בכרטיסיית פחמן, כדי לספק נתיב מוליך מפני שטח כרטיסיית פחמן אל בדל מתכת ובכך לקרקע.
6. אפשר צבע מוליך להתייבש במשך שתי שעות.
7. Operate coater גמגום לכל מדריך למשתמש להחיל ציפוי כבד יחסית (טווח היעד של 30 - 40 ננומטר) של סגסוגת זהב-פלדיום או זהב. משאבת תא דגימה כ -0.1 mbar; כוונו את הטיימר ל -40 שניות. שסתום סט פתוח 08:00 המיקום (זרימת גז ארגון מתון). לחצו על התחל כדי ליזום ציפוי גמגום 30 מילי-אמפר. הפרשות זוהרות סגולות צריכות להיות גלויות בתא הדגימה.

7. בדיקת SEM של דגימות רקמת לב

1. לבצע סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים במתח האצה נמוך יחסית כדי למזער הדמיה problems הקשורים פיזור חסותה המסכן במדגם (טעינה). מצב הדמיה הראשונית מוצעים הם: 5 kV מאיץ מתח, 10 מ"מ ומרחק עבודה.
2. עם סיוע של מפעיל מנוסה, להעסיק גדל עובד מרחק להאריך עומק השדה בתנאי הדמיה הדורשים מוקד הסיבים במטוסים מספר מוקדים, או סיבי הארכה עבור אורך ניכר בממד z.
   1. עבור המיקרוסקופ משמש כאן (ראה טבלה של חומרים), בתוך גישת הממשק המשתמש על כרטיסיית הניווט ב ימני עליון.
   2. גש לכרטיסיית הקואורדינטות מתפריט השלב. כדי להגדיל מרחק עבודה, זן ערך גדול במילימטרים עבור Z קואורדינטות ואז ללחוץ על עבור לכרטיסייה כדי להזיז את הבמה מדגם למרחק עובד נכנס.
3. עם סיוע של מפעיל מנוסה, להעסיק הטית דגימה וסיבוב כדי למקם את השטח של מאונך המעניין את אלומת האלקטרונים. הטיה נוספת של 10 עד 30 degrEES מתוך עמדה זו עשויה לשפר תצפית ותיעוד של המבנה מטריקס.
   1. עבור המיקרוסקופ משמש כאן (ראה טבלה של חומרים), בממשק המשתמש, לחץ לחיצה ממושכת על כפתור העכבר הימני, ולאחר מכן חלק שמאלה או ימינה כדי למקד את הדגימה ליד בפריפריה של מטוס המשטח המוכן של עניין, תוך ציון מרחק העבודה הממוקד .
   2. נווט עם ג'ויסטיק הממשק הידני על מנת לעבור ליד הקצה היריב של מוקד השטח וחזור. אם עובדי מרחק אינו שווה בערך במיקום הראשון, דגימה להטות להשיג סכם משוער בשני המקומות באמצעות לשונית הקואורדינטות של תפריט השלב (ראה 7.2) והזנת ערך הטיה של T לתאם.
   3. סובב דגימה תשעים מעלות (להזין ערך לתוך R לתאם שדה) וחזור על התהליך עד שכל העמדות ממוקדות על מרחק העבודה הזהה כ.
      הערה: SEM לחץ משתנה עשוי להיות מועסק על מנת לשפר את פיזור תשלוםאם זמין. ואקום גבוה הוא מצב הפעלה סטנדרטית עבור במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

Results

הטכניקה המודגשת יושמה לרקמות לב מתורם השתלת לב אנושית בשימוש (איור 1), רקמות explanted מן המושתלים, לבבות מ wild-type ועכברים דיסטרופי (איור 3), ו בדגימות לב אוטם שלאחר שריר לב מתוך חזירים מודל של פגיעה לבבית (איור 2). כפי שניתן לראות בתרשים 1, מטריצת לב האדם הוא מארג מורכב של חלבונים צולבים המציגים דפוס חלת דבש דמוי כאשר צפו ב חתך. "חלת דבש" כל מבנה הוא כ 40 מיקרומטר רחב, עקיף בדר...

Discussion

הכנת שטח חתך היא השלב הקריטי ביותר במהלך הפרוטוקול. כדי לשמר מבנה עדין, דגימות מיובשות חייבות להישאר באתנול 100% בכל העת עד הציגו את תהליך ייבוש נקודה הקריטי. לכן החיתוך של דגימות כדי להשיג משטחים לבדיקה EM חייב להיעשות תוך דגימות קומטי באתנול בצלחת רדודה. זה גם קריטי, כי המשטח החשוף לא נגע או נחקר במהלך טיפול שלאחר מכן. אין שינויים גדולים צפויים עבור יישום של טכניקה זו כדי סוגי רקמות אחרים לתצפיות מטריקס דומות, אם כי חלק SEM של הפרוטוקול עשוי לדרוש פתרון בעיות במיקרוסקופ אלקטרוני...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סידן כלוריד	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית	12340	100 גרם
דבק פחמן	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי	12664	30 גרם
דבק פחמן לשוניות	מיקרוסקופיה אלקטרונים מדעי	77825	סדר להתאים לבדלים
סכיני גילוח קצה כפול נירוסטה	טד פלה, בע"	121-6	250/חבילה
אתנול	אלקטרון מדעי המיקרוסקופיה	15055	450 מ"ל
גלוטרלדהיד, 50% תמיסה	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית	16310	דרגת EM, זיקוק מטוהר
חומצה הידרוכלורית	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	16760 או 16770	100 מ"ל
מונוסודיום פוספט NaH<תת>2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 גרם
אוסמיום טטרוקסיד	אלקטרונים מיקרוסקופיה	מדעית 19100	1 גרם
כסף דבק מוליך	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי	12686-15	15 גרם
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	סיגמא-אולדריץ	S8045-1KG	1 ק"ג
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 גרם
חומצה טאנית, 5% מימי	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	21702-5	500 מ"ל
טריהידרט נתרן קקודילאט	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	12300	100 גרם
סגסוגת זהב-פלדיום או	מערכות זיקוק זהב, בע"מ	משתנה	ספציפי ליצרן ודגם ציפוי המקרטע
מייבש נקודה קריטית	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	850
אפליקטורים מעץ רגיל	פישר סיינטיפיק	23-400-102
קוונטה 250 SEM סביבתי FEI		Q250 SEM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	דגם 108
אלומיניום SEM דגימה דפי	מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי	75220-12	ספציפי למיסקרוסקופ