Method Article

פיתוח ואפיון של במבחנה כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca 2 +] i וייצור Nitric Oxide

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי. למרות הפיתוח של מכשירי microfluidic כבר אומץ על ידי מהנדסים למעלה משני עשורים, היישומים הביולוגיים שלהם יישארו מוגבלים. מודל microvessel במבחנה רלוונטי יותר פיסיולוגי אומת על ידי יישומים ביולוגיים חשוב לקדם את התחום ולגשר על הפערים בין in vivo ו במבחנה. כאן, אנו מציגים נהלים מפורטים לפיתוח רשת microvessel בתרבית באמצעות מכשיר microfluidic עם יכולת זלוף לטווח ארוך. אנחנו גם מדגימים ושימושיה מדידות כמותיות של שינויים המושרה אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בזמן אמת באמצעות confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. רשת microvessel נוצרהעבודה עם זלוף הרציף הראתה צמתים מפותחות בין ECS. VE-cadherin הפצה היה קרוב יותר לזה שנצפה microvessels השלם מ monolayers EC בתרבית באופן סטטי. ATP-induced עלייה זמנית EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור נמדדו כמותית ברמות תאים בודדות, אשר תוקפות את הפונקציונליות של microvessels התרבותי. מכשיר microfluidic זה מאפשר ECS לגדול תחת זרם רלוונטי מבוקר היטב, מבחינה פיזיולוגית, מה שהופך את סביבת תרבית תאים קרוב in vivo מזה בתרבויות 2D הקונבנציונליות, סטטי. עיצוב רשת microchannel הוא תכליתי מאוד, ותהליך הייצור הוא פשוט דיר. המכשיר ניתן לשלב בקלות למערכת המיקרוסקופית confocal או קונבנציונלית המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה. והכי חשוב, כי רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו תשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצדפתולוגית מרכיבי דם שינו ממדגמים חולים להשפיע ECS אדם ולספק תובנה בנושאים קליניים. כמו כן ניתן לפתח כפלטפורמת הקרנת סמים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי 1,2. טכנולוגית מיקרופלואידיקה מאפשרת נוזל לשלוט באופן מדויק באמצעות microscale המוגבל גיאומטרי ערוצים (תת מילימטר) 3, אשר מספק את ההזדמנות עבור תאים בתרבית, במיוחד עבור כלי דם ECS, לגדול בתנאי זרימה רצויות. תכונות אלו הופכות את תנאי תרבית תאים קרובים in vivo מ בתרביות תאי 2D הקונבנציונליות, סטטי. הם מאוד חשובים כאשר מכשירי microfluidic משמשים מודל סוגים שונים של vasculatures וללמוד תגובות EC גירויים מכאניים ו / או כימיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור מכשיר microfluidic

  1. ייצור פוטו-ליתוגרפיה רגיל של עובש מאסטר 50 SU-8
    1. נקה את פרוסות סיליקון לפני ציפוי ספין. לשטוף פרוסות סיליקון 2 אינץ חשופה עם אצטון במשך 15 דקות ואחריו אלכוהול איזופרופיל (IPA) במשך 15 דקות. מייבש את הפרוסות על ידי הצבתו על פלטה חמה ב 150 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. לאחר התייבשות, לקרר את רקיק בטמפרטורת החדר.
    2. ספין מעיל פרוסות סיליקון עם photoresist SU-8. הוסף 2 מ"ל photoresist SU....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מציג כמה מהתוצאות שהושגו עם רשת microvessel בתרבית שפותחה עם פרוטוקול זה. דפוס microchannel הוא רשת הסתעפות שלוש רמות (איור 1 א). בתכנון זה, סניפי ערוץ אמא רחבים 159 מיקרומטר לשתי 126 מיקרומטר ערוצים רחבים, וענפים שוב לארבעה 100 מיקרומטר ערוצי בת רחבים. סימולצית נומרית 3D בוצעה על מנת להעריך את הפצות לחץ גזירה תחת קצב הזרימה של 0.35 μl / min (איור 1 ב '), אשר מציין שלוש רמות שונות של מאמץ גזירה בתוך רשת mic.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לפיתוח רשת microvessel התרבותי, האפיון של צמתי EC ו cytoskeleton הפצת F- תקטין, ואת מדידות כמותיות של EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור באמצעות מכשיר microfluidic. מכשיר microfluidic perfused מספק מודל במבחנה המאפשר סימולציה קרובה של גיאומטריות כלי דם vivo פנימה תנאי זרימת גזירה. מאז רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו יכולה לשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצד פתולוג.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים שום אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מעניק HL56237, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מכון DK97391-03, הקרן הלאומית למדע (NSF-1,227,359 והרווח למניה-1,003,907).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
אצטוןפישר סיינטיפיקA929
ביופסיה אגרוףMiltex33-31 AA
אלבומין בקרMP ביו-רפואי810014
תמצית מוח בקר (BBE)LonzaCC-4098
Cover-slipFisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
חמור נגד עיזים IgG (H+L) נוגדנים משנייםטכנולוגיות חייםA-11055
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco14190-250
DRAQ5 (צביעת גרעינים) טכנולוגיית איתות תאים4084
תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
סרום בקר עובריGibco16000-044
פיברונקטיןGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
ג'לטין מעור חזירSigma-AldrichG1890-100G
ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)Gibco15750-078
כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-548B
פיפטת פסטר זכוכיתVWR14672
מלח נתרן הפרין מרירית מעי חזירSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES תמיסת מלח חוצצתLonzaCC-5024
תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs)LonzaCC-2517
איזופרופיל אלכוהול (IPA)VWR89125
L-גלוטמין (200 מ"מ)Gibco25030-081
מרכיב
NaCl (132 מ"מ)פישר סיינטיפיקS671-3
KCl (4.6 מ"מ)פישר ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 · 7H2O (1.2 מ"מ)Fisher ScientificM63-500
גלוקוז (5.5 מ"מ)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5.0 מ"מ)Fisher ScientificS233-500
מלח הפס (9.1 מ"מ)Research Organics6007H
חומצת הפס (10.9 מ"מ)Research Organics6003H
MCDB 131 טכנולוגיות חיים בינוניים של תרבית10372-019
מיקרוסקופיה אלקטרוניתשל פרפורמלדהיד15710
פלואידין (צביעת F-actin)סיגמא-אולדריץ'P1951
מי מלח חוצץ פוספט Life Technologies14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
ScalpelExel Int29552
סקוטשטייפ 3M34-8711-3070-3
פרוסת סיליקוןVWR14672
SU-8 PhotoresistMicroChemSU-8 2050 Y111072
מפתח SU-8MicroChemY020100
צלוחיות תרבית רקמותSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
תמיסת מנטרל טריפסיןGibcoR-002-100
תמיסת טריפסין/EDTA (TE)GibcoR-001-100
צינורותCole-Parmerצינורות מיקרו PTFE, 0.012 אינץ' מזהה x 0.030 אינץ' OD
VE-cadherinסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-6458
<חזק>שם הציוד<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות/תיאור
חזק>בטיחות ביולוגית מכסה מנוע למינריNuAireNU-425 Class II, סוג A2
מצלמת CCDHamamatsuORCA
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
פלטה חמהWenescoHP-1212
חממהForma Scientific3110
תנור איזוטמפBarnstead3608-5
ליטוגרפיה ספסלקארל סוסMA6 ליתוגרפיה
מיקרוסקופ אופטיNikonL200 ND & תריס דיאפוד 300
למצלמת CCDמכשיר סאטרלמבדה 10-2
מנקה פלזמהPVA TePla/Harrick פלזמהM4L/PDC-32G
ציפוי ספיןBrewer ScienceCee 200X
מערכת משאבת מזרקמכשיר הרווארד703005
<חזק>שם התוכנה<חזק> חברהCatalog NumberComments/Description
CAD softwareAutodeskAutoCAD 2015
CFD סימולציה תוכנהCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
תמונות רוכשות ומנתחות ללא ייצור הדמיה אוניברסליתMetafluor
תמיסת רינגר יונקיםמדעי מגע

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

Related Articles