מאמר שיטה

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54042

⸱

12 ביוני 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Radiology, Albert Einstein College of Medicine, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

תקציר

במיקרו-סביבת הגידול, תאי סטרומה מארחים מקיימים אינטראקציה עם תאי הגידול כדי לקדם את התקדמות הגידול, אנגיוגנזה, התפשטות תאי הגידול וגרורות. אינטראקציות רב-תאיות במיקרו-סביבת הגידול עלולות להוביל לאירועים חולפים כולל תנועתיות תאי גידול כיווניים וחדירות כלי דם. כימות חדירות כלי הדם של הגידול השתמש לעתים קרובות בניסויי נקודת קצה כדי למדוד אקסטרוואזציה של צבעי כלי דם. עם זאת, בשל האופי הארעי של אינטראקציות רב-תאיות וחדירות כלי הדם, לא ניתן להבחין בקינטיקה של אירועים דינמיים אלה. על ידי תיוג תאים וכלי דם עם צבעים הניתנים להזרקה או חלבונים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה אפשרה הדמיה ישירה בזמן אמת של אירועים חולפים במיקרו-סביבת הגידול. כאן אנו מתארים שיטה לשימוש במיקרוסקופיה רב-פוטונית לביצוע הדמיה תוך-חיונית מורחבת בעכברים חיים כדי לדמיין ישירות דינמיקה רב-תאית במיקרו-סביבת הגידול. שיטה זו מפרטת אסטרטגיות תיוג סלולריות, הכנה כירורגית של דש עור חלב, מתן צבעים או חלבונים להזרקה על ידי קטטר וריד הזנב ורכישת תמונות זמן-lapse. רצפי הזמן-lapse המתקבלים משיטה זו מקלים על הדמיה וכימות של הקינטיקה של אירועים תאיים של תנועתיות וחדירות כלי דם במיקרו-סביבת הגידול.

מבוא

הפצת תאים סרטניים מגידול החלב הראשוני הוכחה לערב תאים סרטניים רק לא, אבל לארח תאי סטרומה כוללים מקרופאגים ותאי האנדותל. יתר על כן, בכלי הדם של הגידול הוא לא נורמלי עם חדירות מוגברת 1. לפיכך, קביעת האופן שבו תאים סרטניים, מקרופאגים ותאי האנדותל אינטראקציה לתווך חדירות כלי הדם ואת intravasation תאים סרטניים ב במיקרו-סביבה של הגידול הראשוני הוא חשוב עבור גרורות הבנה. הבנת קינטיקה של חדירות כלי דם, intravasation תאים סרטניים ואת מנגנון האיתות הבסיסי של אינטראקציות רבות-תאי ב microenvironment הגידול יכול לספק מידע חיוני בדבר ההתפתחות והמנהל של טיפולים אנטי סרטניים.

האמצעי העיקרי של לימוד חדירות כלי הדם הגידול in vivo כבר למדידת צבעים extravascular כגון אוונס 2 כחול, dextrans משקל מולקולרי גבוה (155 KDA)3 ו fluorophore או חלבונים מצומדות radiotracer (כולל אלבומין) 4 בנקודות זמן קבוע לאחר ההזרקה של צבע. התקדמויות מיקרוסקופיה, במודלים של בעלי חיים ו צבעי ניאון אפשרו הדמיה של תהליכים תאיים ו חדירות כלי הדם בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ intravital 5.

הדמיה חייה עם רכישת תמונות סטטיות, או רצפי זמן לשגות קצר על מספר נקודות זמן אינה מאפשרת ההבנה המלאה של אירועים דינמיים במייקרו-הסביבה של גידול 6,7. אכן, רכישת תמונה סטטית במשך 24 שעות הראו כי בכלי הדם של הגידול הוא דולף, אולם הדינמיקה של חדירות כלי הדם לא נצפתה 6. לפיכך, זמן לשגות הדמיה רציפה המורחבת עד 12 שעות לוכדת את קינטיקה של אירועים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש multiphot זמן לשגות המורחבתעל מיקרוסקופיה intravital ללמוד אירועים רב-תאיים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול. סוגי תאים מרובים במיקרו-סביבה של הגידול מסומנים עם צבעי בזריקות או באמצעות חיות טרנסגניות להביע חלבוני ניאון. באמצעות קטטר וריד זנב צבעי כלי דם או חלבונים ניתן להזריק לאחר תחילת הדמיה לרכוש נתונים הקינטית של אירועים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. עבור הדמית תא חי גידול החלב חשוף תוך הכנת הכירורגית של דש עור. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד צינורות מכפיל מרובים (PMT) גלאי 8. באמצעות מסננים מתאימים, אלגוריתם חיסור מאפשרת 4 גלאי PMT לרכוש 5 אותות ניאון במיקרו-סביבה של הגידול בו זמנית 9. מיקרוסקופיה intravital multiphoton ברזולוציה גבוהה לוכדת הדמיה ברזולוציה תא בודד של אינטראקציות גידולים stroma ב במיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל טוב understanding של חדירות כלי הדם תאים סרטניים intravasation 10-13. באופן ספציפי, חשף הדמית intravital מורחב מקומי מאוד, אירועים חדירים כלי דם חולפים המתרחשים באופן סלקטיבי באתרים של אינטראקציה בין תאים סרטניים, מקרופאג ו תא האנדותל (מוגדר כגידול microenvironment של גרורה, TMEM 14) 13. יתר על כן, intravasation תאים סרטניים מתרחש רק TMEM והוא במרחב ובזמן בקורלציה עם חדירות כלי דם 13. ברזולוציה תא בודד של הדינמיקה של האירועים הללו התאפשרה באמצעות מיקרוסקופיה multiphoton זמן לשגות המורחבת של תאים שכותרתו fluorescently ב במיקרו-סביבה של הגידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים חייב להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כולל אישור מראש על ידי ע"ש אלברט איינשטיין טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואה ועדת שימוש.

1. גידולים יצירת שכותרתו fluorescently ו המקרופאגים גידולים הקשורים

  1. צור תאים סרטניים שכותרתו fluorescently ידי חציית מודל סרטן שד הספונטני, קדומות, מהונדסים גנטיים עכבר שבו חוזר מסוף ארוך וירוס גידול עכבר החלב שמניע את אנטיגן T באמצע polyoma (MMTV-PyMT) עם עכברים טרנסגניים עם כתבי ניאון [כלומר, פלואורסצנטי ירוק משופר חלבון (EGFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן משופרת (ECFP) או Dendra2] 8,9.
  2. מקרופאגים תווית fluorescently בחיות PyMT עם שכותרתו fluorescently תאים סרטניים על ידי חציית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית עם כתבים ניאון ספציפיים myeloid- ו macrophage- [כלומר, MacGreen 15 או עכברים MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP 16].
  3. לחילופין, ליצור שכותרתו fluorescently גידולים באמצעות השתלת orthotopic של שכותרתו fluorescently תאים PyMT הגידול (syngeneic), שורות תאי סרטן שד אנושיים או גידולים שמקורם בחולה אדם מן המעלה הראשונה (xenografts) 11,17.
    1. שתל fluorescently שכותרתו תאי PyMT גידול לעכברי syngeneic עם תאי מיאלואידית ניאון שכותרתו חלבון כדי ליצור חיות עם תאים סרטניים ותאים מיאלואידית שכותרתו fluorescently 13.
  4. להזריק 100 μl של 10 מ"ג / 70 dextran kDa פלורסנט ק"ג ידי וריד הזנב תוך ורידי (iv) לתוך כשל חיסוני חמור עכברים (SCID) עם גידולים xenograft של שורות תאים אנושיים או גידולים ראשוניים הנגזרות למטופל מקרופאגים תווית fluorescently 2 hr לפני תחילת של הדמיה intravital.

התקנת מיקרוסקופ 2. הכנת ההדמיה

הערה: הליך זה מתאר את ההגדרההדמיה intravital על מיקרוסקופ multiphoton 8.

  1. הפעל את כל מרכיבי מיקרוסקופ ליזר כולל לייזרי שני פוטונים ואת הגלאי.
  2. הפעל את תיבת חימום עד 30 מעלות צלזיוס מראש לחמם את הבמה. שלב זה הוא קריטי לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של החיה.
  3. לשימוש על מקום מיקרוסקופ הפוך להכניס בשלב מחוייט על במת מיקרוסקופ. את כנס המנהג הוא גיליון 1/8 "אלומיניום עבה במכונה כדי להתאים את החלל הבימתי הכנס ועם 1" קוטר דרך חור במרכז הדמיה.
    1. נגב את במת מיקרוסקופ כנס במה עם 70% אתנול ו אוויר יבש.
    2. מניחים ירידה גדולה של מים על המטרה מיקרוסקופ NA 20X, 1.05 לשמור על קשר אופטי עם מכסה זכוכית.
    3. זכוכית מכסה מקום (# 1.5 עובי) מעל נמל ההדמיה על להכניס במת מיקרוסקופ. Secure במקום עם קלטת מעבדה.
    4. השתמש ניקוב חורים אגרוף חור 2 ס"מ X 2 ס"מב רפידת גומי גמישה למקם את רפידת הגומי על הבמה מיקרוסקופ עם חור הכרית מיושרת עם החור להכניס בשלב המותאם אישית.

3. הכנת זנב וריד צנתר ריאגנטים עבור הזרקה במהלך הדמיה

  1. חותכים באורך 30 ס"מ פוליאתילן צינורות (PE).
  2. בעזרת מלקחיים, להזיז את המחט מתכת של מחט 31 G הלוך ושוב עד שהוא קוטע את דבריו של פלסטיק חלק חיבור לצנרת.
  3. בעזרת מלקחיים, הכנס את הקצה הקהה של המחט מנותקת לתוך צינורות PE.
  4. הכנס מחט 31 G אל הקצה השני של צינור PE.
  5. ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם בופר פוספט סטרילית (PBS) ולהכניס אותו לתוך 31 המחט G ולשטוף את כל האוויר מתוך צינור ומחט עם PBS. PBS משמש לשמירה הידרציה osmolarity דם 9,18, לעומת זאת סליין איזוטוני יכול לשמש גם.
  6. ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם 200 μl של 3 מ"ג / ק"ג 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) או נקודות קוונטיות עבור תיוג כלי דם.
  7. הכן כל החלבונים בזריקות אחרות כגון איזופורם חומצה 165 אמינו של גורם (vascular endothelial growth VEGFA 165) בתוך מזרק 1 סמ"ק ומניחים על קרח. להזריק 0.2 מ"ג / ק"ג VEGFA 165 19 בריכוז של 0.05 מ"ג / מ"ל.

קלטי 4. זנב שכינת צנתר וריד

  1. מניחים את החיה תחת הרדמה באמצעות חדר אינדוקציה עם isoflurane 5% עם O 2 כגז המוביל.
  2. מעביר את העכבר על הפלטפורמה כירורגית לכשזו בהרדמה מלאה ולא מגיבה קמצוץ בוהן.
  3. קו ההרדמה להרחיב isoflurane לפלטפורמה כירורגית, לסגור את קו ההרדמה לתא האינדוקציה ומקום חרטומו על החוטם של החיה. מנמיכים את isoflurane בין 5% ל -2.5%.
  4. החל משחת עיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
  5. מחממים את החיה תחת מנורת חימוםעבור 2 דקות נוספות כדי להגביר את זרימת הדם בזנב כתפוצה מאטה עם הרדמה עמוקה.
  6. לעקר וריד הזנב העכבר עם 70% אתנול.
  7. הכנס את קצה המחט 31 G מן קטטר נבנה בסעיף 3 לווריד הזנב לרוחב של החיה ודחוף את מחט 2-3 מ"מ.
  8. משוך את הבוכנה לראות דם, להבטיח את הקטטר ממוקם וריד הזנב.
  9. השתמש אורך 1 סנטימטר של קלטת המעבדה הניחה על המחט להחזיק את המחט במקביל מקום הווריד לאורך הזנב.

5. עור דש הליך כירורגי כדי לחשוף את גידול החלב

  1. עם החיה על הפלטפורמה כירורגית ספוגית הגידול ואת משטח הגחון עם אתנול 70%. הערה: כפי שתואר, הליך זה לא מבוצע לחלוטין בסביבה נקייה מחיידקים. הפעלות הדמיה ארוכות שבו זיהום יכול להיות גורם בלבול, מומלץ להשתמש בטכניקה מזוהמת נכונה.
  2. שימוש Steriמלקחיים le, להרים את העור הגחון במספריים סטריליות לעשות חתך תת עורי לאורך קו האמצע הגחון כ 1 ס"מ אורך. הימנע ניקוב הצפק במהלך החתך.
  3. בעדינות לחתוך את רקמת חיבור הצמדת בלוטת החלב ואת הגידול הרחק הצפק לחשוף את גידול החלב.
  4. בעזרת מספריים מלקחיים, להסיר בעדינות וחתך את fascia ושומן מן השטח החיצוני של הגידול תוך שמירה על שלמות כלי הדם הגידול ומזעור דימום. שלב זה הוא קריטי בשמירה על אדריכלות גידול בכלי דם אספקת הגידול.

6. הכנת בעלי חיים למיקרוסקופיה

  1. מעביר את החיה על במת ההדמיה המחוממת מראש עם הגידול החשוף דגש על coverslip על להכניס הבמה מעל המטרה מיקרוסקופ הדמיה. תשמור על עצמך כדי להעביר את הקטטר זנב וריד בעדינות עם החיה כדי לא לסלק את המחט.
  2. ה מקוםחרטומו דואר הרדמה על החוטם של החיה לשמור סט הרדמת isoflurane 3%.
  3. מקם את החיה כך שהגידול נח החור של כרית הגומי יוצר קשר עם coverslip הזכוכית.
  4. השתמש בשתי כריות גומי כדי להחזיק את הגידול בעדינות במקום ולתקן אותם הבמה מיקרוסקופ עם קלטת מעבדה להפחית תנועה במהלך רכישת תמונה.
  5. ממלא את החדר מפנקס הגומי עם PBS כדי לשמור על רקמת hydrated ולשמור על קשר אופטי עם coverslip.
  6. התחל מעקב אחר הסימנים החיוניים של החיה עם בדיקת oximeter הדופק. צרף חיישן קליפ לירך של החיה. לחלופין צווארון כי הוא מוגדר כך שיתאים סביב הצוואר יכול לשמש.
  7. מניחים את תיבת חימום על החיה לשמור 30 ° C 20.
  8. לאט להפחית את רמת isoflurane ל 0.5-1% כדי לשמור על הרדמה לשמור על זרימת הדם.

7. תמונה רכישה הזרקת Fluorescצבעי ent וחלבונים בזריקות

  1. באמצעות המוקד העיני מיקרוסקופ על התאים סרטני ניאון על פני השטח של הגידול.
  2. בחר שטח של ריבית על ידי מציאה באזורים עם זורם כלי דם. הבחירה של תחום העניין עם כלי דם זורמים היא קריטית להערכת בכלי דם של גידול.
  3. לאחר באזור של עניין נבחר להחליף את המיקרוסקופ למצב ההדמיה multiphoton.
  4. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של סדרת z. קבע את הגבול העליון של z-series באמצעות שמאי המוקד להעביר את המטרה למיקום ההתחלה הרצוי ולחיצה על מצבה Z "למעלה" כפתור. קבע את הגבול העליון של z-הסדרה על ידי הדמית רשת הסיבים קולגן על פני השטח של הגידול בדור הרמוני השני (SHG) הערוץ וההתבוננות כשאף תאים אבל רק סיב קולגן גלויים.
    1. הגדר את הגבול התחתון של z-סדרה על ידי הזזת המטרה לעומק הדמיה הרצוי (typically 50 - 150 מיקרומטר) ולחיצה על מיקום Z "תחתי" כפתור.
    2. הגדר את גודל הצעד ידי הקלדת הערך הרצוי בשדה גודל הצעד. לקבוע צעד גודל מבוסס על שיקולים לפתרון וזמן רכישה (בדרך כלל 2 מיקרומטר משמש לשיקום 3D ברזולוציה גבוהה 5 מיקרומטר אחר).
  5. הגדר את מרווח זמן לשגות על ידי מעבר ללוח Time-lapse והזנת זמן לשגות הרצוי לתחום זמן לשגות. לקבלת החלטה זמנית אופטימלית להגדיר את מרווח הזמן 0 שניות הדמיה רציפה. הערה: הזמן לשגות הדמיה ארוכה מומלץ להגדיר את פרק הזמן עד 10 שניות בין רכישות כדי לחדש את נוזל הטבילה האובייקטיבי.
  6. לאחר הפרמטרים הדמיה נקבעו, להזריק לאט 155 kDa dextran-TMR.
    1. הסר את המזרק עם PBS הקטטר זנב וריד ולהחליף עם מזרק המכיל מטפלת 155 kDa dextran-TMR לא להכניס שום בועות לתוך line.
    2. לאט לאט להזריק 155 kDa dextran-TMR לעכבר, עם עוצמת קול גבוהה יותר של 200 μl, ולהחליף את המזרק עם מזרק המכיל PBS. שלב קריטי: בצע את הזריקה לאט לנקוט באמצעי זהירות כדי להימנע מקבלת פתרון מחוץ הווריד.
  7. הפעל את רכישת זמן לשגות הדמיה Z- מחסנית על ידי לחיצה על Z-Stack וכפתורים זמן לשגות לדכא אותם ולאחר מכן לחיצה על כפתור ההקלטה.
  8. אם dextrans ניאון האחר, כלומר, 10 kDa dextran-והעמסת isothiocyanate (FITC), או חלבונים, כלומר, VEGFA 165, נערך מראש, להזריק אותם לאחר תחילת רכישת תמונה ב = 0 התחלה דקה.
    1. הסר את המזרק עם PBS ב קטטר וריד הזנב ולהחליף עם מזרק המכיל 10 kDa dextran-FITC או VEGFA 165 נזהרת שלא להציג את כל בועות לתוך קו.
    2. לאט לאט להזריק הזרקה לתוך העכבר באמצעות קטטר וריד הזנבולהחליף את המזרק עם מזרק המכיל PBS.
  9. כל 30-45 דקות, להזריק לאט 50 μl של PBS או תמיסת מלח כדי לשמור על לחות של החיה.

8. המתת חסד

  1. עם סיום רכישת התמונה, להרדימו.
    1. הגדל את isoflurane עד 5%.
    2. שמור את החיה תחת isoflurane 5% עד 30 שניות לאחר שתפסיק לנשום ולהסיר את החיה מן הבמה.
    3. בצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד מוחלט.

עיבוד תמונה 9.

  1. לרכוש תמונות קבצי TIFF 16 סיביות לכל ערוץ הפרט בכל נקודת זמן ולשמור ברצף.
  2. בצע הפרדת חפיפה ספקטרלית (כלומר, ה- GFP ו CFP), חיסול של סחיפה XY והדור של סרטים מתוך רצפי זמן לשגות בשיטות הוקמה בשנת ImageJ 9. בצע שחזורי משטח 3D של תמונות ברזולוציה גבוהה 13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מיקרוסקופיה intravital הזמן לשגות מורחבת מאפשרת הדמיה ברזולוצית תא בודדת של תהליכים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. על ידי תאים סרטניים תיוג פלורסנטי, מקרופאגים, המרחב וסקולרית, באופן חזותי רשת סיבים קולגן באמצעות האות דור הרמונית השני, מספר תאים ב במיקרו-סביבה של הגידול מתבצע המעקב אחר בו זמנית במהלך ההדמיה. תאים סרטניים שכותרתו עם חלבוני ניאון יכול להיות שנוצר בעכברים טרנסגניים כפי שנעשה בעכברים MMTV-PyMT-Dendra2, עם תאים סרטניים החלב שכותרתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אינטראקציות הסלולר המתרחשות באופן ספונטני במיקרו-סביבה של הגידול יכול להביא לשינויים תנועתיות התא הגידול intravasation. הדמית intravital ברזולוציה גבוהה של רקמת גידול חייה מאפשרת ההדמיה של דינמיקה רבה תאית שיכול להיות 10,13,24 חולף מאוד. סוף-טעם מבחני vivo או זמן לשגות תמונות רכשה עם נקודות בזמן בדיד יכול לספק מידע חיוני על המנגנונים המולקולריים של תהליכים במיקרו-סביבה של הגידול. בדיקות הדמיה Intravital שימשו ללמוד תהליכים במיקרו-סביבה של הגידול המתרחש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי שד משרד ההגנה Cancer Research Program תחת מספר הפרסים (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, ותכנית ההדמיה המשולבת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanateSigma AldrichT1287מרכיבים מחדש ב-20 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS
70 kDa-Texas RedLife TechnologiesD-1830מרכיבים מחדש ב-10 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS
10 kDa דקסטרן-פלואורסצאין איזותיוציאנטSigma AldrichFD10Sמחדשים ב-20 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum DotsLife טכנולוגיותQ21561MPדילול 25 ו#956; l ב-175 μ l של 1x PBS להזרקה
עכברי MMTV-PyMTמעבדת ג'קסון2374
עכברי Csf1r-ECFP (Csf1r-Gal4 / VP16, UAS-ECFP)מעבדת ג'קסון26051
עכברי Csf1r-EGFPמעבדת ג'קסון18549
1x PBSLife Technologies
איזואתזיה (איזופלורן)הנרי שיין בריאות בעלי חיים50033250 מ"ל
מזרק חמצןAirTech
1 מ"ל, קצה החלקה של טוברקוליןBD309659
30 גרם x 1 (0.3 מ"מ x 25  מ"מ) מחטBD305128
פוליאתילן מיקרו צינורות רפואיים Scientific Commodities IncBB31695-PE/10.28 מ"מ I.D. x 0.64 מ"מ OD
מיקרוסקופ כיסוי זכוכיתקורנינג2980-225עובי 1.5, 22 x 50  מ"מ
PhysioSuite MouseSTAT דופק אוקסימטר, תוכנה וחיישניםמדעית
פישרסיינטיפיק159015R
כרית גומי רכהMcMaster-Carr8514K62סרט פוליאוריטן רך במיוחד, 3/16 אינץ' עבה, 12 אינץ' x 12 אינץ', 40 Oo דורומטר,
כרית גומי קשיחהMcMaster-Carr8568K615יריעת גומי ניאופרן בעלת חוזק גבוה בעובי 1/4 אינץ', 12 אינץ' x 12 אינץ', 50  מיקרוסקופ דורומטר
אולימפוסהמיקרוסקופ הוא מיקרוסקופ מולטיפוטון לייזר שנבנה בהתאמה אישית המבוסס על מעמד אולימפוס IX-71 המשתמש בעדשת אובייקט 20X 1.05NA.
סט 7 אגרופיםMcMaster-Carr3429A12קוטר חור 1/4 אינץ' עד 1 אינץ', לאגרוף חורים מונע פטיש
קלטת מעבדה קנט גב רגיל

מקורות

  1. Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
  2. Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
  3. Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
  4. Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
  5. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
  6. Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
  7. Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
  8. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  9. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
  10. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  11. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  12. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
  13. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  14. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  17. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
  19. Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
  20. Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors. In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).
  21. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807(2011).
  22. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  23. Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
  24. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  25. Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  26. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  27. Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
  28. Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
  29. Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790(2013).
  30. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  31. Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים