הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

Summary

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

Abstract

הפיתוח האחרון של טכניקת בדיקה של תא בודד בתפוקה גבוהה מאפשר סינון של אנזימים חדשים המבוססים על פעילויות פונקציונליות מספרייה מטאגנומית בקנה מידה גדול¹. הצענו בעבר מערכת סינון אנזימים גנטית (GESS) המשתמשת בווסת דימתילפנול המופעל על ידי פנול או p-ניטרופנול. מכיוון שכמות עצומה של תגובות אנזימטיות טבעיות מייצרות את התרכובות הפנוליות הללו ממצעים שמקורם בפנול, ניתן ליישם באופן תיאורטי את מערכת הסינון הגנטית היחידה הזו כדי לסנן למעלה מ-200 אנזימים שונים במסד הנתונים של RENDA. למרות היישום הכללי של GESS, יישום תהליך הסינון דורש הליך ספציפי כדי להגיע לאותות ציטומטריית הזרימה המקסימלית. כאן, אנו מפרטים את תהליך הסינון שפותח, הכולל עיבוד מקדים של מטגנום עם GESS והפעלת ממיין זרימה ציטומטרית. שלושה סובסטרטים פנוליים שונים (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט) עם GESS שימשו לסינון ולזיהוי שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין), בהתאמה. פעילויות האנזים המטאגנומי שנבחרו אושרו רק עם ציטומטריית הזרימה, אך ניתן להשתמש בריצוף DNA וניתוח מגוון במבחנה לזיהוי גנים נוסף.

Introduction

טכניקת assay שפותחה לאחרונה תפוקה גבוהה תא בודד מאפשרת אנזימי רומן שיוקרו מספריה גנטית בקנה מידה גדולה מבוססת על הפעילות התפקודית שלהם ^1. ברמת התא הבודדה, חלבונים בויסות שעתוק מועסקים כדי לעורר ביטוי גני כתב על ידי חישת מולקולות קטנות מיוצרות כתוצאה של פעילות אנזים היעד. הגישה מוקדם אחד המעורבים את הבידוד של אופרון משפיל-פנול מ Ralstonia eutropha E2 באמצעות הביטוי הגנטי-induced המצע ההקרנה (SIGEX) שיטה, שבה המצע גורם הביטוי של עיתונאי חלבון ^2. NhaR של Pseudomonas putida שמש כדי לבחור dehydrogenase benzaldehyde ^3, ו LysG מ glutamicum Corynebacterium נוצל להקרנת התפוקה הגבוהה של L- ליזין-ייצור זן חדש מספרי מוטציה מגוונות ^4.

בעבר, screeni אנזים גנטימערכת ng (GESS) הוצעה כפלטפורמת הקרנה החלימה בדרך כלל ^5. מערכת זו משתמשת רגולטור dimethylphenol הכרה-פנול, DmpR, של פ putida. DmpR (E135K), ו מוטציה של DmpR, יכול להיות מועסק גם GESS (PNP-GESS) לצורך זיהוי של p -nitrophenol (PNP). בנוכחות אנזימי יעד ייצור תרכובות פנוליות, GESS ב E. קולי תאים פולטים אותות קרינה, מה שמאפשר את הבידוד המהיר של תאים בודדים באמצעות סדרן תא מופעל פלואורסצנטי (FACS). אבל הביטוי של אנזים metagenomic שנראה חלש יותר מזו של אנזימים רקומביננטי קונבנציונליים; ולכן, תוכננה GESS לזהות תרכובות פנוליות ברגישות המקסימלית על ידי חוקר את השילוב של אתר ריבוזומלי מחייב (RBS) ורצפים terminator יחד עם תפעול אופטימלי בתנאים ^5.

אחד היתרונות הבסיסיים של GESS היא שיטה אחת זה תיאורטי מאפשרת הקרנת ovאה מ -200 סוגים שונים של אנזימים באתר ברנדה (טבלה 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) על ידי העסקת מצעים שונים פשוט. זה היה הראו כי cellulase, lipase, ו hydrolase parathion מתיל (MPH) ניתן לאתר באמצעות PNP-GESS עם מצעים מתאימים של בוטיראט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl-cellotrioside, ו parathion מתיל, בהתאמה ^5. לאחרונה, הוכח כי phosphatase אלקליין (AP), אשר הוא אחד האנזימים רומן שזוהו באמצעות PNP-GESS, הוא AP thermolabile הראשון נמצא metagenomes ימיים קר המותאמות ^6.

הנה, הפרטים של תהליך המיון מוצג עם PNP-GESS גילוי הפעילויות של שלושה סוגים שונים של lipase enzymes-, cellulase, ו phosphatase אלקליין -ואז במהירות בזיהוי אנזימים מועמדים חדשים מספריה metagenomic ^5,6. התהליכים כוללים עיבוד מקדים metagenome עם PNP-GESS ותפעול flow סדרן cytometry. בעוד הלהיטים המתקבלים יהיו צורך הרצף של זיהוי נוסף, פרוטוקול זה מכסה את ההליך עד מדרגות אישור פעילות אנזים באמצעות cytometry זרימה.

Protocol

1. הכנת הספרייה metagenomic עם PNP-GESS

1. לבנות ספריה metagenomic ב E. coli עם וקטור fosmid באמצעות ערכת ייצור הספרייה fosmid פי פרוטוקול של היצרן ^5.
2. Aliquot 100 μl של הספרייה לאחסון ב -70 ° C, אשר מהווה מקור של תאי ספרייה metagenomic.
   הערה: הצפיפות האופטית של מדגם נמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ של מניית ספרייה זה עומדת על כ -100.
3. להפשיר 100 μl של הספרייה metagenomic המניות על הקרח ולחסן בבקבוק 500 מ"ל המכיל 50 מ"ל לוריא- Bertani (LB) ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ואחריו 37 הדגירה מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
4. קציר התאים צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
5. Resuspend גלולה במהירות 50 מ"ל מים מזוקקים קרים כקרח (DW) ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C שוב.
6. מילuspend גלולה ב 50 DW μl קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול. השתמש 50 μl של aliquot תא זה עבור electroporation.
7. מניחים את התערובת של תאים electrocompetent 50 μl ו pGESS (E135K) DNA ⁵ (100ng) בתוך קובט electroporation קרים כקרח electroporate (1.8 ק ו / ס"מ, 25 μF) את התערובת.
8. להוסיף במהירות 1 מ"ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני ו resuspend התאים בעדינות.
9. העברת התאים לתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית בעזרת פיפטה לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
10. מורחים 500 μl של תאים התאושש על צלחת מרובעת LB 20 x 20 ס"מ המכיל chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירת צלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
11. גרדו את מושבות באמצעות מגרד תא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל באמצעות אמצעי אחסון תא קר כקרח.
12. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 °. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל אמצעי אחסון תא קר כקרחלהגיע OD של ₆₀₀ 100.
13. Aliquot 20 μl של תאים לאחסון ב -70 ° C.

2. הסרת תוצאות חיוביות שגויות מספריית metagenomic

1. להפשיר את תאי ספריית metagenomic מניות (משלב 1.13) המכילים fosmid DNA metagenomic ו pGESS (E135K) על קרח.
2. לחסן 10 μl של התאים 2 מ"ל LB המכיל אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​בתוך שפופרת 14 מ"ל מסביב לתחתית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 4 שעות.
3. בינתיים, מפעיל את מחשב FACS ולפתוח את תוכנת FACS מחדל. השתמש בהגדרות הבאות: קוטר נחיר, 70 מיקרומטר; פינת פיזור קדימה (FSC-A) רגישות, 300 הגברת V-לוגריתמים; פינת פיזור בצד (SSC-A) רגישות, 350 הגברת V-לוגריתמים; והעמסת isothiocyanate שטח (FITC-A) רגישות, 450 הגברת V-לוגריתמים; פרמטר הסף, FSC-ערך 5.
   הערה: גדרות טיפוסיות מובאותעבור מכשיר FACS כפי שמופיע בטבלה של חומרים. התאם את ההגדרות עבור התקני FACS אחרים.
4. לדלל את תאי ספריית metagenomic משלב 2.2 ידי הוספת 5 μl של המדגם לצינור 5 מיליליטר עגול תחתון המכיל 1 מיליליטר PBS.
5. מניח את מדגם הספרייה מדולל על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load על לוח מחווני רכישת תוכנת FACS.
6. התאם את קצב אירוע 1,000 - 1,500 אירועים / sec ידי לחיצה ושליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים.
7. צור יומן מדורג FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור בגיליון גלובלי על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בסרגל הכלים. התאם את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים.
8. מגרש היסטוגרמה עם ספירת תאים לעומת יומן מדורג FITC-A בגיליון העבודה על ידי לחיצה על כפתור היסטוגרמה. לאחר מכן, להתאים את מתח FITC מן Cytomeכרטיסיית גדרות ter על החלון מפקח הבקרה כזה כי שיאו של ב"התפלגות הפעמון הוא פחות מ -10 ^2-A FITC.
9. צור-A FSC מדורג יומן vs. ביומן FITC-העלילה על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגליון העבודה הגלובלי. הגדרת R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים כך שהשער ממוקם בין + 5% ו -5% תאים ממרכז החלוקה (תאי 10% בסך הכילו סביב הפסגה של הפעמון עקום בצורה).
10. מניחים צינור אוסף המכיל 1.2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ו אמפיצילין chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל במוצא המכשיר FACS ולמיין את 10 ⁶ תאים העונים הן R1 ו- R2 שערים.
11. הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות.

3. הקרנת אנזים metagenomic

1. דגירה תאים ממוינים (משלב 2.11) בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד עד ₆₀₀ OD מגיע 0.5.
2. הוסף 1 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל"ד.
3. כדי להכין תאים למיון, להוסיף 0.5 מ"ל של תאים בתרבית ו מצע המתאים (אצטט -nitrophenyl p, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, או פוספט פניל) לתוך צינור 14 מ"ל מסביב לתחתית בריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   1. למדגם שליטה, להוסיף 0.5 מ"ל של תאים בתרבית משלב 3.2 לתוך צינור 14 מ"ל מסביב לתחתית. מוסיפים את נפח זהה של PBS כמו נפח המצע בשלב 3.3.
4. דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 3 שעות.
5. בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3.
6. הוסף 5 μl של תאים (למיון) ותאי הבקרה שני צינורות 5 מ"ל מסביב לתחתית המכילה 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
7. מניחים את הצינור המכיל תאים שליטה על tהוא טוען היציאה של FACS ולחץ על הכפתור Load בלוח המחוונים רכישת התוכנה FACS. כוונון קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec ידי שליטת כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
8. יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה הגלובלי של התוכנה ולהתאים את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע על סרגל כלים.
9. יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג FITC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה ולקבוע R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן מצולע השער בסרגל הכלים כך פחות מ -0.1% של תאים שליליים מזוהים בתוך שער R2.
10. החזר את הצינור מלא המדגם עם צינור מדגם המיון, להתאים את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec על ידי שליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים.
11. מניחים צינור איסוף המכיל 0.5מיליליטר LB במוצא מכשיר FACS ולמיין את 10 ⁴ תאי עונים הם שערי R1 ו- R2.
    הערה: קריטריון המיון יכול לנוע בין 0.1% עליונים עד 5% של-A FITC בשער R2. בפרוטוקול זה, תאי 1% עליונים נאספו תוצאות חיוביות.
12. הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות.
13. מורחים את דגימות 0.5 מ"ל שנאספו על שתי צלחות אגר (90 מ"מ צלחות פטרי) המכיל LB, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​chloramphenicol דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
14. במידת הצורך, לבצע סיבובים נוספים של מיון FITC-A העשרה על ידי חזרה על שלבים 3.1-3.14.

4. Hit בחירת אישור פעילות האנזים

1. Cytometry זרימת הניתוח
   1. מהצלחת וטופחה על שלב 3.14, בחר מושבה מראה שום קרינה באמצעות בורר מושבה תחת התצפית של גל 488 ננומטר של נורת ה- LED.
   2. לחסן את המושבה שנבחר 14 מ"ל roאונד תחתית שפופרת המכילה 2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ו -12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד עד OD שלה ₆₀₀ מגיע 0.5.
   3. הוסף 2 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל"ד.
   4. להכין צינור מסביב לתחתית 14 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של תאים בתרבית (שלב 4.1.3). הוסף מצע מתאים (תצטט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, או פוספט פניל) בריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
      1. עבור פקד, להוסיף תאים בתרבית 1 מ"ל משלב 4.1.3 לתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית ולהוסיף אותו נפח של PBS כמו נפח המצע בשלב 4.1.4.
   5. דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 3 שעות.
   6. בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3.
   7. הוסף 5 μl של תאים שטופלו מלאה המצע עד 5 מ"ל צינורות מסביב לתחתית המכילה 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
   8. מניח את התאים מלאים המכיל צינור על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load בלוח מחווני רכישת תוכנת FACS. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
   9. לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC.
   10. החזר את הצינור מדגם שליטה עם הצינור מדגם מטופלים המצע. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
   11. לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC.
   12. השווה את הקרינה של שתי הקבוצות של תאים על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים לעומת ביומן מדורג-A FITC.
2. מבחני אחרים כדי לאשר פעילות האנזים
   1. עבור זיהוי נוסף של המועמדים אנזים שנבחרו, לחלץ DNA fosmid באמצעות פרו מיצוי סטנדרטיפרוצדורות מן ערכות ההפקה המסחרית ולנתח את רצף נוקליאוטידים, או לבדוק את פעילות האנזים במבחנה ^6,7.

Results

השלושה המצעים פנוליות נבחנו לזהות אנזימי metagenomic רומן מספריה metagenome של משקעים שטוחים גאות אוקיינוס ​​Taean, דרום קוריאה על ידי ביצוע הפרוטוקול המוצע. לבניית הספרייה, ממוצע 30 - 40 רצפי metagenome kb הוכנסו fosmids, אשר מבוססים על E. coli F replicon גורם והציג כעותק יחיד בתא. שים לב fosmids היה בשימוש נרחב לבניית ספריות גנומית מורכבת בשל התפשטות ⁸ היציבה שלהם.

Discussion

הגדלת יעילות של biocatalysts ייצור היא מפתח להצלחה-כימי ביו מבוסס תעשיית ⁹ ו metagenome נחשב לאחד מקור האנזים הטבעי הטוב ביותר. במובן זה, זה הכרחי כדי הקרנת אנזימים רומן מן metagenome שבו רוב המשאבים הגנטיים לא נחקר ^10. כמה שיטות הקרנה פותחו ישירות לזהות מוצרי אנזים באמצעות activators תעתיק ^{11, 12} אולם טכניקות אלו דורשות מערכת תעתיק המטבוליט-תגובה ספציפית. מצד שני, GESS הוא החלים רחב בהתאם לשימוש של פנול או PNP מתויג מצעים. למרות שרוב האנזימים דיוו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl		Epicentre CCFOS110	ערכת הפקת ספריית Fosmid
פתרון אינדוקציה CopyControl	Epicentre	CCIS125	תמיסת אינדוקציה העתק Fosmid
EPI300	Epicentre	EC300110	תא אלקטרו-מוכשר
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	וקטור Fosmid
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		קובטה אלקטרופורציה ומערכת אלקטרופוראט
FACSAria III	בקטון דיקינסון		ציטומטריית זרימה (מכונת FACS)
AZ100M	מיקרוסקופ ניקון
אולטרה סלים	תאורת לד	מאסטרוגן
50 מ"ל צינור חרוטי	BD Falcon
14 מ"ל צינור תחתון עגול	BD Falcon
5 מ"ל צינור תחתון עגול	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876& נ.ב.פ;	המצע
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 גרם/ליטר, סודיום כלוריד 10 גרם/ליטר
מרק סופר אופטימלי (SOB)	BD Difco	244310	טריפטון 20 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 גרם/ליטר, סודיום כלוריד 0.5 גרם/ליטר, מגנזיום גופרתי 2.4 גרם/ליטר, אשלגן כלורי 186 מ"ג/ליטר
מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט (SOC)		SOB, 0.4% גלוקוז
2x תמצית שמרים טריפטון (2xYT)	BD Difco	244020	עיכול לבלב של קזאין 16 גרם/ליטר, תמצית שמרים 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 גרם/
ליטר אמצעי			2x מרק YT, 15% גליצרול, 2% גלוקוז
pGESS(E135K)			וקטור DNA המכיל dmpR, גנים egfp עם המקדמים המתאימים שלהם, RBS וטרמינטור. ראה הפניה 5 בכתב היד עבור פרטים נוספים.
כלורמפניקול	סיגמא	C0378
אמפיצילין	סיגמא	A9518
BD FACSDiva	בקטון דיקינסון		זרימה ציטומטריית תוכנה גרסה 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4