מאמר שיטה

אימות של Terminators ראפיד שימוש פלסמיד PGR-כחול גולדן גייט האסיפה

DOI:

10.3791/54064

⸱

25 באפריל 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש במכלול שער הזהב ובפלסמיד pGR-blue כדי לכמת במהירות את חוזק הטרמינטורים הנמצאים בסיליקו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר אימות מהיר של טרמינטורים המזוהים ביואינפורמטית. יתר על כן, הפלסמיד (pGR-Blue) תוכנן במיוחד עבור פרוטוקול זה ומאפשר כימות של יעילות המסיים. כהוכחת רעיון, שישה טרמינטורים זוהו ביואינפורמטית במיקובקטריופאג' ברנל13. לאחר שזוהו, הטרמינטורים יוצרו כאוליגונוקלאוטידים עם הקצוות הדביקים המתאימים וחוסלו יחד. באמצעות מכלול שער הזהב (GGA), הטרמינטורים שובטו לאחר מכן ל-pGR-Blue. תחת אור נראה, מושבות חיוביות כוזבות נראות כחולות ומושבות שעברו טרנספורמציה חיובית הן לבנות/צהובות. לאחר אינדוקציה של מקדם השראת ארבינוז (pBad) עם ארבינוז, ניתן לקבוע את חוזק המושבה על ידי מדידת היחס בין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המיוצר לחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) המיוצר. עם pGR-Blue, ניתן להשלים את הפרוטוקול תוך שלושה ימים בלבד והוא אידיאלי במסגרת חינוכית. בנוסף, התוצאות מראות כי פרוטוקול זה שימושי כאמצעי להבנה בתחזיות סיליקון של יעילות הטרמינטור הקשורה לוויסות השעתוק.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקטים גדולים של ביולוגיה סינתטית מחייבים שימוש במסופי שעתוק יעילים ביותר כדי לסייע בוויסות ביטוי הגנים. זיהוי טרמינטורים חדשים דורש ניתוח ביואינפורמטי של גנומים חדשים. עם זאת, ככל שמפותחות כמויות הולכות וגדלות של תוכנות ביואינפורמטיות, כל אחת עם אלגוריתם ייחודי המשמש לחיזוי, מתרחשת אי התאמה רבה יותר בין התוצאות המשוערות. מכיוון שתהליך זה הוא סובייקטיבי במידה מסוימת ונעשה בסיליקו, תחזיות אלה זקוקות לאישור ביולוגי. 1 בנוסף, נפח הטרמינטורים המשוערים שזוהו באמצעות ניתוח in-silico דורש שימוש באסטרטגיות שיבוט שניתן להשלים במסגרת זמן קצרה יחסית.

הפלסמיד PGR-Blue הוא שינוי של הפלסמיד PGR שתוכנן מחדש לשימוש במכלול שער הזהב (GGA) כדי לפשט את הליך השיבוט על ידי מתן אפשרות לבצע את כל שלבי התגובה בו זמנית בצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד. 2,3 בחירת צבע שולבה בפלסמיד כדי להגביר את הקלות בזיהוי מושבות חיוביות. קשירה מוצלחת צריכה להיות לבנה/צהובה באור נראה וירוק זוהר באור כחול (450 ננומטר) או אולטרה סגול (UV) כאשר מגדלים אותה על צלחות המכילות ארבינוז. מכיוון ש-pGR-blue לא חתוך מכיל חלבון כרומו כחול (amilCP), מושבות המכילות פלסמיד לא שונה הן כחולות באור נראה. פישוט זה יחד עם הפרוטוקול היעיל מאפשר לחוקרים להתקדם מזיהוי ביואינפורמטי לאישור ביולוגי תוך שלושה עד ארבעה ימים. האופי העיצובי של מערכת זו יכול להועיל הן במעבדת המחקר והן במסגרות חינוכיות.

הפלסמיד pGR-Blue מאפשר כימות של חוזק המסיים. 4 מקדם יחיד הניתן להשראת ארבינוז משמש לייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). הטרמינטור משובט לתוך הפלסמיד לאחר רצף ה- GFP אך לפני רצף ה- RFP, ובכך עוצר את השעתוק של חלבון ה- RFP. חוזק הטרמינטור נקבע על ידי היחס בין GFP המיוצר ל-RFP המיוצר.

דוח החזון והשינוי5 הציע שחינוך למדע, טכנולוגיה, הנדסה ומתמטיקה (STEM) ישלב חוויות מבוססות מחקר בכיתה. 6 עם זאת, זה דורש פיתוח של פרוטוקולים שיכולים להיעשות על ידי תלמידים עם סט מיומנויות מוגבל במסגרת זמן מוגדרת. בעוד שניתן לבצע את הפרוטוקול תוך שלושה ימים בלבד, הוא גם תוכנן כך שניתן יהיה לבצע כל שלב משמעותי בתקופת מעבדה שבועית נפרדת (2-3 שעות) כדי ליצור חווית מחקר קורס (CRE). כאשר משתמשים בו באופן זה, ההליך יימשך בין שלושה לשישה שבועות ומתאים הן לקורסי מבוא והן לקורסים מתקדמים בגנטיקה, ביולוגיה של התא או ביואינפורמטיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנון 1. Oligonucleotides הזמין עם הקצוות הדביקים המתאימים

  1. זהה terminators Rho-עצמאית פוטנציאליים באמצעות ניתוח גנטי באמצעות תוכניות שכרגע מחוברים לאתר גלוי. 7
  2. כשעובדים עם DNA גדילי כפול, לקבוע את הכיוון של terminator להיבדק. 7 הפלסמיד-כחול PGR רק מאמתת terminators ligated ב 5 'ל 3' כיוון על החלק העליון (גדיל קדימה).
    1. המרת terminator גדיל תחתון (הפוך) כדי להשלים התהפך שלה לארגון מחדש של הרצף לבדיקות PGR-הכחולה באמצעות תוכנה ברשת בחינם, למשל, APE.
  3. לאחר האורינטציה נקבעת כנכון, להוסיף את הקצה הדביק "5'-CGAC-3" "ל -5" סוף הגדיל העליון. מוסיף את הקצה הדביק "5'-CCGC-3" "ל -5" סוף הגדיל התחתון. 8 פעולה זו תבטיח כי כנס ligated יוכנס המתאיםאוריינטציה באמצעות GGA.
  4. לאחר רצפים נקבעים, להורות כמו oligonucleotides גדילי יחיד מסחרי.

2. Oligonucleotides חישול (חל רק על מיובשים בהקפאה DNA)

  1. Re- להשעות oligonucleotides בודדים במים חינם nuclease לריכוז של 100 מיקרומטר.
  2. הפוך חיץ חישול 10x: 1 M NaCl ו 100 mM Tris-HCl pH 7.4. חיץ חישול יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. לאחר חיץ חישול הוא עשה oligonucleotides מחדש תלוי, להתחיל את החישול 8.
  3. עבור כל terminator להיבדק, להוסיף 16 μl של מים טהורים כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  4. הוסף 2 μl של חיץ חישול 10x על צינור אחד microcentrifuge.
  5. הוסף 1 μl של oligonucleotide הגדיל העליון (100 מיקרומטר) מן terminator הרצוי.
  6. הוסף 1 μl של oligonucleotide הגדיל התחתון (100 מיקרומטר) מן terminator הרצוי.
  7. צור ba מים רותחיםה באמצעות מבחנה 1,000 מ"ל המכיל כ 400 מ"ל של מי ברז ומניחים על צלחת חמה.
  8. מניחים את הצינורות microcentrifuge משלב 2.6 ב לצוף ומרתיחים במשך 4 דקות. לאחר 4 דקות, לכבות את צלחת חום אבל להשאיר את הצינור לצוף באמבטיה מים O מגניב לאט / N (18 שעות) 8. אחסן את terminators annealed ב -20 ° C.

3. אסיפת שער זהב (Mix הרגיל - עלות יעילה)

  1. הפוך דילול 40 ננומטר של terminators המרותק. להוסיף 124 μl של מים nuclease חופשי 1 μl של תמהיל terminators annealed (100 מיקרומטר).
    1. צנטריפוגה דגימות עבור 30 שניות ב XG 10,000 ולאחסן על הקרח.
  2. לתוך מתאים צינור חדש עבור thermocycler בשימוש, להוסיף 6 μl של מי nuclease חינם.
  3. הוסף 1 μl של מסחרי DNA האנזים הצפת [300 mM Tris-HCl (pH 7.7-7.8), 100 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ DTT, ו -10 מ"מ ATP]. ביצוע כל הצעדים הבאים על קרח.
  4. לְהוֹסִיף1 μl של PGR-כחול (35-50 ng / μl) פלסמיד היעד אל הצינור microcentrifuge.
  5. הוסף 1 μl של terminators annealed 40 ננומטר אל הצינור microcentrifuge.
  6. הוסף 0.5 endonuclease הגבלת μl המסחרי באיכות הגבוהה BsaI אל צינור microcentrifuge.
  7. הוסף 0.5 μl של אנזים דנ"א המסחרי אל צינור microcentrifuge.
  8. צנטריפוגה תערובת התגובה ב XG 10,000 עבור 120 שניות. אז במקום צינור ישירות לתוך thermocycler.
  9. הפעל את התוכנית thermocycler: 20 מחזורים של 1 דקות ב 37 ° C ואחריו 1 דקות ב 16 מעלות צלזיוס, ואחריו 1 מחזור של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. 8

4. אסיפת שער זהב (מיקס מאסטר מסחרי - זמן יעיל)

  1. להוסיף 124 μl של מים nuclease חופשי 1 μl של 100 מיקרומטר annealed terminators שנוצרה בשלב 2. זה מדלל את ריכוז ה- DNA terminator ל -40 ננומטר.בצע פעולה זו בדרך חדשה, שכותרתו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  2. לתוך מתאים צינור חדש עבור thermocycler, מוסיף 14 μl מי nuclease חינם. ודא הצינור החדש מסומן בהתאם.
  3. הוסף 2 μl של מסחר מיקס מאסטר הצפת צינור microcentrifuge.
  4. הוסף 1 μl של פלסמיד PGR-כחול (35-50 ng / μl) אל הצינור microcentrifuge.
  5. הוסף 2 μl של terminators annealed 40 ננומטר אל הצינור microcentrifuge.
  6. הוסף 1 μl של מסחר מיקס מאסטר אל צינור microcentrifuge.
  7. צנטריפוגה הצינור 40 ננומטר ב XG 10,000 עבור 120 שניות. אז במקום צינור ישירות לתוך thermocycler.
  8. הפעל את התוכנית thermocycler: 1 מחזור של 60 דקות ב 37 ° C ואחריו 1 מחזור של 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

טרנספורמציה 5. בחירת קולוני

  1. הכין המאגר לוריא (LB) אגר צלחות פטרי המכילות 1 מ"מ תרכיזיםיון של אמפיצילין (AMP) וכן ריכוז 10 מ"מ של arabinose (ARB). הכן לפחות 10 מ"ל של 1 M L -arabinose פתרון המניות, כי פתרון המניות זה ישמש צעדים מאוחר יותר.
  2. השתמש בכל יעילות גבוהה (אוגוסט 10 - ספטמבר 10 transformants / מיקרוגרם) כימי E. המוסמכת coli (JM109) תאים לטרנספורמציה. 9 לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להוסיף 3-5 μl של תגובת הקשירה 50 μl של תאים מוסמכים. בעת שימוש תאים מוסמכים כימיים, לעקוב אחר פרוטוקול השינוי ספציפי לתא בשימוש.
  3. מורחים מחצית (25 μl) של תאים טרנספורמציה על מחומם מראש LB (Amp / ARB) צלחות אגר באמצעות "מקל הוקי" סטרילי בצורת L דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס. בשל קצב הפירוק המהיר של אמפיצילין, לא לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
  4. לבצע בחירת מושבה המבוססת על צבע על ידי בדיקה ויזואלית. קשירה מוצלחת צריכה להיות לבנה / צהובה אור הנראה לזרוח ירוק undeכחול r (450 ננומטר) או אור UV. קשירה מוצלחת תפיק מושבה כי הוא בצבע כחול תחת אור הנראה לאחר 18 - 20 שעות.

אימות 6. וכימות של Terminator

  1. הכן 5 מ"ל צינורות LB-מרק סטרילית עם אמפיצילין 1 מ"מ ו 10 מ"מ arabinose. מספר הצינורות הדרושים תלוי במספר terminators הנבדקת בתוספת שולטת (תאים עם התנגדות אמפיצילין שאינו לזרוח ותאים המכילים פלסמיד PGR-הכחול נימול).
  2. תחת אור הנראה לבחור 2-3 מושבות לבנות / צהובות (שלב 5.4) באמצעות לולאה סטרילי. אפשר דגימות כדי לדגור broths על שייקר ב 37 ° C ו 160 סל"ד במשך 16-18 שעות. אין דגירת דגימות אלה במשך יותר מ -24 שעות.
    1. לחילופין, השתמש ספקטרופוטומטר לקבוע צפיפות התאים אופטי ב 600 ננומטר (OD 600) כדי להבטיח צמיחת תאים נאותה. באופן כללי, OD של 600 ~ 0.8-1.0 הוא ציין לאחר 16-18 שעות של צמיחה.
  3. להשתמשצלחת 96-היטב סטרילי עבור השלבים הנותרים. לנהל את הפעולות הבאות בסביבה היגיינית בשלושה עותקים. להוסיף 199 μl של מרק LB + Amp / arabinose סטרילית (1 מ"מ אמפיצילין / 10 מ"מ arabinose) זה טוב. כלול חדר על הצלחת במשך שלוש בקרות נפרדות.
    1. השתמש בפקדים שלוש הבאות: באר (1) המכיל LB + Amp / arabinose מרק רק ובאר (2) עבור תאים המוסמכות untransformed (ריק) כדי לשמש ריק. עבור כימות (3) של כוח terminator, התאים המכילים PGR המקורי נימול או PGR-כחול המכיל ligated עם רצף הפסקת עישון צריך להיות כלול (שליטה התייחסות כימות). ראה איור 1 עבור פריסת קורא צלחת.
  4. Pipet 1 μl של פתרון התא מן O / broths N לתוך בארות בודדות של הצלחת 96-היטב.
  5. צלחות חותמות עם כיסוי לנשימה ולנער עבור 18-20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 160 סל"ד.
  6. באמצעות קורא צלחת, לקבוע OD 600 על ידי קריאהספיגה ב 600 ננומטר. מדוד GFP קרינה כדלקמן: קרינת RFP מדוד עירור 395 ופליטת 509 כדלקמן: עירור 575 ופליטה 605. לאחר 18-20 שעות, OD 600 צריך להיות כ 0.5.
  7. כדי לנרמל עבור וריאציה בצמיחה, השתמש המשוואה: figure-protocol-1 הן GFP ו RFP.
  8. לאחר נורמליזציה, לקבוע כוח terminator ביחס באמצעות המשוואה figure-protocol-2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יהיה לייצר תאים המכילים PGR-כחול עם terminator ligated בין ה- GFP ו RFP באמצעות שער זהב עצרת (איור 2). מושבות חיוביות המכילות כנס ligated ניתן לבחור על בסיס צבע. באור נראה מושבות חיוביות תהיינה לבנות / צהובות חיוביים שגוי תפקנה מושבות כחולות לאחר 18-20 שעות של דגירה על 37 ° C (איור 3).

לאחר בחירת מושבה,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא עיצוב oligonucleotide הנכון לפני ההזמנה. Oligonucleotides חייבת להיות הקצוות הדביקים המתאימים הוסיפו אל קצוות "5 של הן בשורה העליונה והן גדילים תחתונים כדי להבטיח כי התאגדות GGA אפשרית. בנוסף, חשוב לעבור את הכיוון של terminators מול שמאלה (terminators לזה לעצור שעתוק על הגדיל התחתון) לזה של זכות מול (מסתיים שעתוק על הגדיל העליון) terminators כי ביטוי GFP ו RFP הוא בפינה הימנית מול (גדיל עליון ) כיוון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות מלקולם קמפבל וטוד Eckdahl עם קונסורציום הגנום להוראת פעילים (GCAT) והברית החינוך HHMI-מדע - ציידים הפאג קידום ג'נומיקס ומדע אבולוציונית (SEA-פאגים) תוכנית.

פרויקט זה מומן על ידי תרומות של המרכז הלאומי לחקר משאבים (P20RR016460) לבין המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (P20GM103429) מן המכון הלאומי לבריאות. מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע תחת IIA-1457888 # מענק. בנוסף מוסדיים (אואצ'יטה המטביל אוניברסיטת) קרנות נמסרו דרך מלגת מחקר קיץ JD פטרסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pGR-כחול פלסמידAddgene68374
pGR-פלסמידAddgene46002
AeraSeal-(יריעות סטריליות)Excel ScientificBS-25גיליונות סטריליים רק
10x T4 DNA ligase BufferNEB
BsaI-HFNEBR3535Sהאנזים שאינו HF יעבוד אך פחות יציב בחום. 
NEB Golden Gate Assembly MixNEBE1600SCommerial Master Mix המוזכר בפרוטוקול.
T4 DNA ligaseNEBM0202S
עגולנובה טק אינטרנשיונלF18875-6401
מלח נתרן אמפיציליןסיגמא אולדריץ' A9518
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA-3256D-Arabinose לא יגרום למקדם pBAD
Luria Base (LB) - מרק, מילרסיגמא אולדריץ'L1900
Luria Base (LB) - אגר, מילרסיגמא אולדריץ'L2025
Tecan-Infinite M200 קורא צלחותTecan
Mix & Go Qualified Cells - זן JM109Zymo ResearchT3005השתמש בפרוטוקול טרנספורמציה מומלץ של החברה
ApE: תוכנת עורך פלסמידhttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, בדרגה מולקולריתPromegaH5121
נתרן כלורי (גבישי/ביולוגי, מוסמך)FisherChemicalS671
סינתזת אוליגונוקלאוטידים קומרסיאליתטכנולוגיות DNA משולבות (IDT)http://www.idtdna.com/site
לוחות תרבית רקמות מיקרו-טסט - 96 באר (סטרילית)Falcon35-3072
מיקובקטריופאג' "Bernal13"גניםKJ510413
משולבות ללא נוקלאז(IDT)IDT004
סטרילי, בצורת L מוצרי מדעי החיים של תא הוקי-סטיק6444-S1
Nano-Drop 2000c ספקטרומטר UV-VisThermo Scientific2000c
ARNold: כלי אינטרנט לחיזוי סיומות שעתוק בלתי תלויות ב-Rho.
מתלה צף מיקרוצנטריפוגה בנק טכנולוגיות DNAhttp://rna.igmors.u-psud.fr/

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  3. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  4. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  5. Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
  6. Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
  7. Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
  8. Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
  9. Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
  10. Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
  11. Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
  12. Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
  13. Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP RFP

מאמרים קשורים