הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54090

⸱

4 באוגוסט 2016

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

תקציר

רצף RNA (RNA-seq) הוא שיטה צדדית שיכול להיות מנוצל כדי לזהות ולאפיין ביטוי גנים, מוטציות, בשילובי גן, RNAs noncoding. תקן RNA-seq דורש 30 - 100 מיליון רצף קורא ויכול לכלול מוצרים RNA מרובות כגון mRNA ו RNAs noncoding. אנו מדגימים כיצד ממוקד RNA-seq (לכיד) מתירה מחקר ממוקד על מוצרי RNA שנבחרו באמצעות ברצף שולחן עבודה. לכידת RNA-seq יכולה לאפיין תמלילים ללא ביאור, נמוכים, או זמני הביעו שאחרת עשויה להחמיץ בשיטות RNA-seq מסורתיות. כאן אנו מתארים את החילוץ של RNA מן שורות תאים, דלדול RNA ריבוזומלי, סינתזת cDNA, הכנת ספריות המינימרקטים, כלת לכידתו של תמלילי ממוקד וסדר זמנית על ברצף שולחן עבודה. אנחנו גם להתוות את צינור ניתוח חישובית, הכולל הערכה בקרת איכות, יישור, זיהוי היתוך, כימות ביטוי גנים וזיהוי nuc יחידגרסאות leotide. assay זה מאפשר רצף תמליל ממוקד לאפיין ביטוי גנים, בשילובי גן, ומוטציות.

מבוא

Whole transcriptome or RNA sequencing (RNAseq) היא שיטת ריצוף בלתי משוחדת להערכת כל תוצרי ה-RNA. המטרה של RNAseq ממוקד (לכידה) היא הערכה ממוקדת של תעתיקים נבחרים עם רגישות מוגברת, טווח דינמי, עלות או קנה מידה מופחתים ותפוקה מוגברת בהשוואה ל-RNAseq סטנדרטי. בדומה ל-RNAseq סטנדרטי, ניתן להשתמש בגישות העשרה ממוקדות כדי להעריך ביטוי גנים, מיני RNA מרובים כגון mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, RNAs אחרים שאינם מקודדים2, איחוי גנים3 ומוטציות4-6.

לכידה כוללת הכלאה של אוליגונוקלאוטידים משלימים כדי להעשיר ספריות cDNA לריצוף. הרציונל ללכידת RNAseq דומה לגישות מיקרו-מערך שבהן אוליגונוקלאוטידים או בדיקות משלימים מוכלאים לדגימות ולאחר מכן נמדדים לשפע יחסי. עבור טכנולוגיות מיקרו-מערך, הביטוי מבוסס על אות יחסי שנמדד עבור תעתיקים הנקשרים לבדיקות אלה. מיקרו-מערכים מוגבלים אפוא על ידי טווח, רעשי רקע פוטנציאליים מקשירה לא ספציפית והכלאה צולבת של בדיקות. יתר על כן, למערכים יש טווח דינמי מוגבל עבור תעתיקים נמוכים וביטויים גבוהים בהשוואה ל-RNAseq1. מיקרו-מערכים נמצאים בשימוש נרחב בשל עלותם המופחתת ויכולת התפוקה הגבוהה שלהם בהשוואה ל-RNAseq.

כאן, אנו מדגימים שיטה ללכידת RNAseq המציעה דרך ביניים בין גישות RNAseq ומיקרו-מערך להערכת הטרנסקריפטום. ל-RNAseq Capture יש תפוקה בינונית, טווח דינמי ורגישות גדולים יותר, והוא מותאם לסיבוב מהיר בסיקוונסרים שולחניים. לכידת RNAseq דורשת גם משאבי חישוב מופחתים במונחים של שטח אחסון ועיבוד נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה מתאר עיבוד בו זמני וניתוח של ארבע דגימות. שיטה זו תואמת RNA שבודד מתאי, רקמות קפואות ורקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין (FFPE). פרוטוקול זה מתחיל עם 50 - 1,000 ננוגרם (250 NG מומלץ) של הפעלת קלט RNA עבור כל דגימה.

1. rRNA דלדול ופיצול של RNA נוהל

  1. rRNA אזילה
    1. הסר elute, הממשלה, שילוב שבר, תערובת הסרת rRNA, חיץ rRNA מחייב חיץ resuspension מ -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר. הסר חוצץ elution, חרוזים הסרת rRNA ו- RNA / cDNA חרוזים פאראמגנטיים ספציפיים מתוך 4 ° C ומביאים לטמפרטורת החדר.
    2. להוסיף 0.25 מיקרוגרם של RNA כדי צינור PCR. לדלל את RNA המוחלט עם nuclease ללא מים טהורים לנפח סופי בסך הכל 10 μl. הוסף 5 μl של חיץ מחייב rRNA על צינור אחד ולאחר מכן להוסיף 5 μl של תמהיל rRNA הרחקה בעדינות pipettדואר מעלה ומטה כדי לערבב. המקום צינורות ב Cycler תרמית עם מכסה מחומם מראש ל -100 מעלות צלזיוס, Cycler תוכנית תרמית ל -68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל את הרנ"א.
    3. לאחר denaturation RNA, להסיר צנורות Cycler תרמי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. צינור הסרת חרוז וורטקס rRNA נמרצות כדי resuspend את החרוזים. להוסיף 35 μl של חרוזי הסרת rRNA צינורות חדשים ולהעביר את תגובת denaturation RNA (20 μl) לצינורות המכילים חרוזי הסרת rRNA.
    4. התאם פיפטה 45 μl ו פיפטה במהירות מעלה ומטה 20x לערבב. דגירה צינורות ב RT עבור 1 דקות. אז במקום צינורות לעמוד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. העברת supernatant צינורות PCR שכותרתו החדש ומניחים צינורות אלה שוב לעמוד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. הדבר מבטיח כי אין חרוזים מועברים. העברת supernatant צינורות PCR שכותרתו חדשה.
    5. RNA וורטקס / חרוזים פאראמגנטיים ספציפיים cDNA ולהוסיף 99 μl של חרוזים על צינור אחד. כל פיפטה בעדינותעד נפח ולמטה 10x לערבב. אם מתחילים עם-RNA מושפל, להוסיף 193 μl של חרוזים פאראמגנטיים RNA / cDNA ספציפיים מוּרבָּך על צינור אחד. לדגור על RT במשך 15 דקות. אז במקום צינורות על מעמד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. סר וזורק supernatants.
    6. הוסף 200 μl של אתנול 70% מוכנים טרי (EtOH). שמור צינורות על מעמד מגנטי ולדאוג לא להפריע את החרוזים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר ולסלק supernatant. אפשר צינורות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות לייבוש.
    7. צנטריפוגה מופשר חיץ הטמפרטורה elution חדר בבית גרם 600 × במשך 5 שניות. להוסיף 11 μl של חיץ elution לצינור כל פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x לערבב. דגירת צינורות ב RT במשך 2 דקות. מניחים צינורות על מעמד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. העבר 8.5 μl של supernatant לצינורות PCR שכותרתו החדש.
  2. פיצול של rRNA המדולדל RNA
    1. להוסיף 8.5 μl אליוטה, 8.5 ממשלה μl, ו -8.5 תמהיל שבר μl על צינור אחד. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x לערבב. מקום צינורות ב Cycler תרמית עם התכנית הבאה: מכסה מחומם מראש ל -100 מעלות צלזיוס, 94 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, ולאחר מכן חזק 4 ° C..
      הערה: צעד זה נועד ליצור גודל כנס ממוצע של 155 נ"ב. אם גודל שבר ממוצע של מדגם RNA נמוך מ -200 נ"ב, לדלג על שלב זה והמשך סטרנד ראשון cDNA סינתזה.

2. סינתזה cDNA

  1. לסנתז סטרנד ראשון cDNA
    1. סור תערובת סינתזת הגדיל ראשונה מ C -20 ° להפשיר בטמפרטורת חדר.
    2. לתכנת מראש את Cycler התרמית עם ההגדרות הבאות: אפשרות מכסה מראש מאש ומניח ל -100 מעלות צלזיוס, אז 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 42 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וחזקות ב 4 ° C . שמור תוכנית זו כמו "לסנתז -1 סטרנד."
    3. צנטריפוגה גדיל צינור לערבב סינתזה מופשרת ואחת ב 600 & #215; גרם במשך 5 שניות. מערבבים 1 μl הפוכה transcriptase עם 9 μl של תמהיל סינתזת הגדיל הראשון.
    4. הוסף 8 μl של סינתזת הגדיל הראשונה הפוך תמהיל transcriptase על צינור אחד, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 6x לערבב. צנטריפוגה צינורות במשך 4 שניות באמצעות צנטריפוגות שולחן מיני קבוע מהירות 6.0 XG כדי להביא נוזל למטה. מניחים צינורות Cycler התרמית ובחר לסנתז 1 Strand st. כאשר Cycler תרמית מגיע 4 ° C, להסיר צינורות פנה מיד לסנתז השנייה סטרנד cDNA.
  2. לסנתז השנייה סטרנד cDNA
    1. Cycler תרמית טרום החום ל -16 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם מראש ל 30 מעלות צלזיוס. מיקס מאסטר שני גדיל הפשרת חיץ מחדש השעיה על קרח. מראש, להסיר את הבקבוק של חרוזים פאראמגנטיים מ 4 ° C ולתת לעמוד במשך 30 דקות לפחות להביא אותם לטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 5 μl של חיץ resuspension על צינור אחד PCR. שילוב ההורים שני גדיל צנטריפוגה ב 600× גרם במשך 5 שניות ומוסיפים 20 μl על צינור אחד PCR. מקום צינורות ב Cycler תרמית מחוממת מראש על 16 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. כאשר הדגירה תושלם, להסיר Cycler תרמית ולאפשר צינורות להגיע לטמפרטורת החדר.
    3. וורטקס החרוזים פאראמגנטיים עד שהם מפוזרים היטב. להוסיף 90 μl של חרוזים פאראמגנטיים מוּרבָּך על צינור אחד. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב. דגירה צינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. צינורות מקום על דוכן מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. סר וזורק 135 μl של supernatant ואז לעזוב צינורות על המעמד המגנטי לבצע לשטוף EtOH. הוסף 200 μl מוכן טרי 80% EtOH על צינור אחד מבלי להפריע את החרוזים, ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. סר וזורק את כל supernatant מכל אחת מהן. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף 80% EtOH.
    5. בואו צינורות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות לייבוש על מעמד מגנטי. צנטריפוגה טמפרטורה בחדר המופשרתדואר חיץ resuspension ב g 600 × במשך 5 שניות. הסר צינורות PCR מן לעמוד מגנטי. להוסיף 17.5 חיץ resuspension μl על צינור אחד PCR בעדינות פיפטה כל נפח מעלה ומטה 10x לערבב ביסודיות. דגירה צינורות עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. צינורות מקום על הדוכן המגנטי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר 15 supernatant μl (גדילים כפולים cDNA) ל -0.2 מיליליטר צינורות רצועת PCR.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה כמו cDNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים.

3. הכנת הספרייה

  1. קצוות "Adenylate 3
    1. הסר A-עוקב מיקס -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר. לתכנת מראש את Cycler תרמית עם ההגדרות הבאות: בחר באפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחזק על 4 מעלות צלזיוס. שמור תוכנית זו כמו "ATAIL70."
    2. להוסיף 2.5 μl של resuspensionחיץ על צינור אחד. לאחר מכן להוסיף 12.5 μl של תמהיל A-עוקב מופשר. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות. מניחים את צינורות Cycler התרמית ובחר ATAIL70. כשהטמפרטורה Cycler התרמית היא ב 4 ° C, להסיר את צינורות PCR מן Cycler תרמי פנה מייד ולקשור מתאמים.
  2. מתאמים ולקשור
    1. הסר צינורות מתאם RNA מתאימים, להפסיק חיץ קשירת חיץ resuspension מ -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת חדר. אין להסיר את הצינור לערבב קשירה מ -20 ° C עד שיתבקש לעשות זאת בפרוטוקול. הסר את בקבוק חרוזים פאראמגנטיים מ 4 ° C ולתת לעמוד במשך לפחות 30 דקות כדי להביא לטמפרטורת החדר.
    2. טרום לחמם את Cycler תרמית עד 30 ° C ובחר באפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה צינורות מתאם RNA מופשר ב 600 גרם × במשך 5 שניות. מייד לפני השימוש, להסיר את הצינור לערבב קשירה מ -20 ° Cאִחסוּן.
    3. להוסיף 2.5 μl של חיץ resuspension על צינור אחד מדגם. להוסיף 2.5 μl של תמהיל קשירה. החזר את צינור תמהיל קשירת עד -20 ° C אחסון מיד לאחר השימוש. להוסיף 2.5 μl של מדד מתאם RNA מופשר על צינור אחד מדגם. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    4. צינורות צנטריפוגה במשך 4 שניות באמצעות צנטריפוגות שולחן מיני קבוע מהירות 6.0 x גרם. צינורות מקום Cycler התרמית מחומם מראש. סגור את המכסה לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    5. הסר צינורות מ Cycler התרמי להוסיף 5 μl של חיץ קשירת תחנה על צינור אחד כדי להשבית את הקשירה. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    6. חזור על לשטוף כמתואר 2.2.3 - 2.2.4, באמצעות 42 μl של חרוזים פאראמגנטיים מעורבים, השלכת 79.5 supernatant μl. עם הצינורות על מעמד מגנטי, ולתת אוויר יבש דגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות.
    7. הסר את צינורות רצועת PCR מןמעמד מגנטי ולהוסיף חיץ resuspension 52.5 μl על צינור אחד. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות. דגירה צינורות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. מניח את הצינורות על המעמד המגנטי ב RT במשך 5 דקות או עד שהנוזלים ברורים. העברת 50 μl של supernatant מהצינור כל 0.2 חדש מ"ל צינורות PCR רצועה. יש להיזהר שלא להפריע את החרוזים.
    8. חזור על לשטוף כמתואר 2.2.3 - 2.2.4, באמצעות 50 μl של חרוזי פאראמגנטיים מעורבים, ולהשאיר 95 supernatant μl. עם הצינורות על מעמד מגנטי, ולתת אוויר יבש דגימות ב RT במשך 5 - 10 דק '.
    9. הסר את צינורות רצועת PCR מהדוכן המגנטי ולהוסיף חיץ resuspension 22.5 μl על צינור אחד. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    10. דגירת הצינורות ב RT במשך 2 דקות. מניח את הצינורות על המעמד המגנטי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות או עד שהנוזלים ברורים. העברתי 20 μl supernatant מצינור כל עלצינור 0.2 מ"ל PCR רצועה חדשה. יש להיזהר שלא להפריע את החרוזים. זוהי נקודת עצירה בטוחה ניתן לאחסן cDNA ב -20 ° C עד 7 ימים.

4. הגברת הספרייה

  1. עשר DNA שברי
    1. הסר את תערובת מאסטר PCR, קוקטייל פריימר PCR ו חיץ resuspension מהאחסון -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר. הסר את בקבוק חרוזים פאראמגנטיים מהאחסון 4 ° C ולתת לעמוד במשך לפחות 30 דקות כדי להביא לטמפרטורת החדר.
    2. לתכנת מראש את Cycler תרמית עם ההגדרות הבאות: בחר באפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קבע denaturation הראשונית ב 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 15 מחזורים של denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, חישול ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וסיומת ב 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, מחזור הארכה אחת אחרון ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחזיקו על 4 מעלות צלזיוס. שמור תוכנית זו כמו "PCR."
    3. צנטריפוגה מאסטר PCR מופשרלערבב פריימרים PCR צינורות ב g 600 × במשך 5 שניות. הוסף 5 μl של פריימרים PCR מופשר על צינור אחד מדגם. הוסף 25 μl של תמהיל מאסטר PCR מופשר על צינור אחד מדגם. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    4. מניח את צינורות PCR רצועת כתרי Cycler התרמית המתוכנתת מראש. סגור את המכסה ולהפעיל תוכנית ה- PCR. כאשר PCR יושלם, להסיר צנורות Cycler תרמית ולשמור על קרח.
    5. חזור על לשטוף כמתואר 2.2.3 - 2.2.4, באמצעות 50 μl של חרוזי פאראמגנטיים מעורבים, ולהשאיר 95 supernatant μl. עם הצינורות על מעמד מגנטי, ולתת אוויר יבש דגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות.
    6. הסר צינורות מהדוכן המגנטי ולהוסיף חיץ resuspension 32.5 μl על צינור אחד מדגם. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות. לדגור על RT במשך 2 דקות. מניח את צינורות PCR על המעמד המגנטי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות או עד שהנוזלים ברורים. ואז להעביר 30 μl supernatant צינורות 0.2 מ"ל PCR טריים.
    7. בצע כימות של cDNA באמצעות fluorometer 7 ולקבוע איכות cDNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימי 8.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה cDNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים. הערה: ספרייה זו נחשבת ספריית RNA-seq.
      צעדים לאחר להוביל ספרייה לכידה.

5. הכלאה, לכידת סידור

  1. כלת multiplexed
    1. סר מנהג בדיקות hydrated, DNA מיטת-1, oligos חסימה אוניוורסלי, oligos חסימת ספציפיים מתאם מ -20 ° C ו להפשיר על קרח.
    2. בתוך צינור מ"ל נמוך לאגד 1.5, לשלב 500 DNA ng (125 ng לדגימה כאשר דגימות ריבוב 4), 5 μl DNA מיטת-1 (1 מיקרוגרם / μl), oligos חסימת אוניברסלי 1ul, 0.5 μl P7 (6 נוקליאוטידים) מתאם ספציפי חסימת oligos (סכום זה עשוי צריך להיות מותאם בהתאם conditi זמניתons) ו -0.5 μl P7 (8 נוקלאוטיד) מתאם oligos ספציפי חסימה (סכום זה עשוי צריך להיות מותאם בהתאם לתנאי זמני).
    3. מניחים את הצינור מדגם בתוך concentrator ואקום עם פתוח כובע פונה לכיוון ההפוך של הסיבוב. תוכן יבש ב 45 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות או עד אידוי מוחלט של נוזל.
    4. Resuspend תוכן יבשים עם חיץ הכלאה 8.5 μl 2x, 3.4 רכיב הכלאה μl ו -1.1 מים חינם μl nuclease. אפשר 10 דקות עבור resuspension מערבולת כל 2.5 דקות. העבר-החומר המושהה לצינור 0.2 מ"ל PCR לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על Cycler תרמית.
    5. סור צינור מדגם הכלאה בין Cycler תרמית ולהוסיף 2 μl של בדיקות מותאמות אישית resuspended בריכוז של 1.5 pmol / μl. לחלופין, להוסיף 4 μl של בדיקות מותאמות אישית resuspended בריכוז של 0.75 pmol / μl. הכלאת דגירת תגובת הלילה (16 - 24 שעות) על 65 מעלות צלזיוס.
      הערה: Probeים שנרכש מיצרנים שונים עשוי לשמש הוראות היצרן צריכות להיות אחריו. משך שלב הכלאה עשוי להשתנות גם.
  2. הכנת חרוז ו ללכוד
    1. הסר בקבוק חרוזים פאראמגנטיים מצמידים streptavidin מ -4 ° C לאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לדלל 10x לשטוף חוצצים (I, II, III, ומחמירים) ו 2.5x חרוז הצפת לשטוף ליצור פתרונות עבודה 1x.
    2. Aliquot 140 μl של חיץ לשטוף 1x לי לתוך צינור 1.5 מיליליטר טרי. כמות חום כולו של חיץ aliquot מחמיר 1x של חיץ לשטוף 1x אני על 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום במשך שעה לפחות 2.
    3. Aliquot 100 μl של חרוזים פאראמגנטיים מצמידים streptavidin לכל ללכוד לתוך צינור 1.5 מ"ל. מניחים על מגנט וזורקים supernatant. הוסף 200 μl לשטוף חרוז חיץ לכל 100 חרוזים μl ו מערבולת למשך 10 שניות. מניחים על אבן שואבת 2 - 5 דקות או עד supernatant ברור. לאחר supernatant ברור, וזורקים אותו מחדשכבול פעם נוספת עבור סכום כולל של שני שוטף.
    4. לאחר הסרת חיץ לשטוף חרוז, להוסיף למאגר לשטוף חרוז נפח שווה כמו נפח התחלה ראשוני (כלומר, 100 μl עבור לכידה אחד). Resuspend והעברת צינור 0.2 מ"ל PCR. מניח צינורית מתל מגנטי 2 - 5 דקות או עד supernatant ברור. supernatant מחק.
    5. בשני מדגם ההכלאה וחרוזי Cycler התרמית על 65 מעלות צלזיוס, להעביר את תערובת ההכלאה אל הצינור החרוז ומעלה פיפטה ולמטה 10x לערבב. לדגור על 65 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, מערבולת ספין למטה מדגם עבור 4 שניות באמצעות מהירות קבועה (6.0 XG) צנטריפוגות מינית בטבלה העליונה.
  3. חרוז Wash
    1. הסר צינור ללכוד מ Cycler תרמית ולהוסיף 100 μl מחומם מראש הצפת 1x לשטוף לי אל הצינור מערבולת במשך 10 שניות כדי לערבב. מעביר את תערובת צינור מיליליטר נמוך לאגד טרי 1.5. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי ולאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. Dsupernatant iscard.
    2. הוספת 200 חיץ לשטוף מחמירים 1x שחומם מראש μl ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי ולאפשר 2 - 3 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. supernatant מחק. חזור על לשטוף מחמירים פעם נוספת עבור סכום כולל של שני שוטף.
    3. הוספת 200 1x הטמפרטורה μl חדר לשטוף חיץ לי מערבולת למשך 2 דקות לערבב. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי המאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. supernatant מחק.
    4. הוסף 200 μl 1x בטמפרטורת החדר לשטוף חיץ II ו מערבולת דקות 1. לערבב. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי המאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. supernatant מחק.
    5. הוסף 200 μl 1x בטמפרטורת החדר לשטוף חיץ III ו מערבולת למשך 30 שניות כדי לערבב. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי המאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatantברור. supernatant מחק.
    6. הסר את הצינור ממדף הפרדה המגנטי ולהוסיף 20 μl מי nuclease ללא resuspend את החרוזים. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים.
  4. לכידת הודעת הגברת PCR
    1. הסר חרוזים פאראמגנטיים מ -4 ° C לאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. הסר תחילת PCR חם מוכן מערבבים (2x) ו- PCR פריימר Mix מ -20 ° C ו להפשיר ב RT ואז מניחים על קרח. הכן מיקס מאסטר הגברה הספרייה על ידי שילוב 27.5 μl של תערובת מוכנה PCR להתחיל חם 2x עם 2.75 μl של ה- PCR פריימר 1 ו 2.75 μl של פריימר PCR 2 (כרכים אלה הם עבור 1 הספרייה הכלאה פלוס 10 עודף%).
    3. הגדרת התגובה בצינור PCR על ידי הוספת 20 μl של חרוזים בתוספת DNA שנתפס עם 30 μl של תמהיל מאסטר הגברת ספרייה עבור בנפח כולל של 50 μl. צינור שווי כראוי מערבולת לערבב. צינורות צנטריפוגה במשך 4 שניות באמצעות כרטיסייה מינית מהירות קבועהle-top צנטריפוגות ב 6.0 x גרם.
      1. הגדר את תוכנית ה- PCR הבאה: לבחור את האפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קבע denaturation הראשונית ב 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 10 - 12 מחזורים של denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות רחבה על 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, מחזור הארכה אחת אחרון ב 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות וחזקות על 4 מעלות צלזיוס.
    4. הסר מדגם מן thermocycler ולהוסיף 75 חרוזים פאראמגנטיים μl. מערבבים היטב לדגור על RT במשך 15 דקות.
    5. מניחים צינורות על מגנט בטמפרטורת החדר למשך 2 - 3 דקות ולאחר מכן להסיר supernatant. לשטוף חרוזים על מגנט על ידי הוספת אתנול 200 μl 80%, דוגרת במשך 30 שניות ולאחר מכן הסרת supernatant. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף 80%.
    6. לדגור על RT במשך 5 - 10 דקות, כדי לאפשר חרוזים להתייבש. אל על יבש פיצוח. חרוזים Resuspend ב 22 μl של טריס-EDTA pH 8.0 (פתרון TE 1x) ולאפשר 3 דקות עבור elution. מניחים דגימה על שואבת 3 - ה 5 דקותen העביר 20 μl של מוצר eluted לצינור מיליליטר נמוך לאגד טרי 1.5, להבטיח שום חרוזים מתבצעים מעל.
    7. בצע כימות של cDNA שנתפסו באמצעות fluorometer 7 ולקבוע איכות cDNA שנתפסו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימי 8.
  5. הליך טוען ברצף שולחן 9
    1. לדלל ספריית cDNA שנתפסו לריכוז סופי של 4 ננומטר באמצעות 10 מ"מ טריס-Cl-pH 8.5 עם 0.1% Tween 20. ההפשרה 10 N NaOH חיץ הכלאה על הקרח. כ -30 דקות לפני השימוש, להפשיר תיבת ערכת מגיב v2 ברצף העבודה 1 במים RT. אין למלא מעל המילוי המרבי LINE 10. שימו לב שמדובר בהליך פלטפורמה ספציפית רצף ועשוי להשתנות לפי הוראות היצרן.
    2. הכן 1ml של 0.2 N NaOH ידי שילוב 20 μl 10 N NaOH עם 980 מים חינם nuclease μl בצינור microcentrifuge (תמיד להכין טרי). לדלל את ספריית PhiX (שליטת ספרייה) עד 4 ננומטר ידישילוב של 2 μl שליטת ספריית 10 ננומטר עם 3 μl 10mm טריס-Cl-pH 8.5 עם 0.1% Tween 20.
    3. לפגל ספרייה סופית ושליטת ספרייה ידי שילוב 5 μl של ספריית 4nM עם 5 μl של 0.2 N NaOH ו מערבולת בקצרה לערבב. צינורות צנטריפוגה במשך 4 שניות באמצעות צנטריפוגות בטבלה העליונה מיני מהירות קבועה 6.0 x גרם. לדגור על RT במשך 5 דקות כדי לפגל ספריות.
    4. להוסיף 990 μl של חיץ הכלאה מראש צונן אל הצינורות המכילים 10 μl של ספריות מפוגלות. התוצאה היא ספריית 20 PM. סמן את ספריית 20 PM המפוגל עם התאריך ניתן לאחסן עד 3 שבועות ב -20 ° C.
    5. מערבב 375 μl של 20 PM מלא ספרייה עם 225 μl של חיץ הכלאה מראש צונן ובקרת ספרייה מדוללת לגרום פקד 12.5 pm ספרייה. היפוך מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון.
    6. מערבב 594 μl של ספרייה סופית מפוגלת עם 6 μl שליטת ספרייה מפוגלת 12.5 בערב, המערבולת לערבב. הגדר את samp בשילובle ספרייה ובקר ספרייה בצד על קרח עד דגימות מוכנות לטעון לתוך המחסנית מגיב ברצף שולחן עבודה.

6. ניתוח נתונים

  1. להערכת איכות רצף
    1. חשב את איכות נתוני רצף הגלם (קבצי fastq) באמצעות הערכת איכות רצף 11.
      הערה: פעולה זו מסייעת להעריך את הנתונים שלפניו הוא נתון מעבר לניתוח במורד הזרם. התוכנה פועלת עם פרמטרים המובנית ומייצרת סט של ערכים לכל קובץ fastq.
  2. יישור
    1. יישר רצף קורא (קבצים fastq) אל hg19 ו transcriptome הגנום האנושי התייחסות באמצעות 12 Tophat2 (גרסה 2.0.10) תוך מתן תמלילי ידוע כקובץ GTF. הפלט הוא בצורת תבנית יישור בינארי בשם הקובץ BAM.
    2. בצע שלבים עיבוד פוסט כולל מיון ויצירת אינדקס באמצעות Samtools 13 (גרסה 0.1.19) על קובץ BAM. בצע כפול סימון, סידור מחדש SAM, הכנס חישוב גודל הוספה או החלפה של קבוצות קריאה באמצעות כלים פיקארד 14 (גרסה 1.84).
  3. להערכת איכות RNA-seq
    1. לחשב סדרה של מדדי בקרת איכות עבור נתוני RNA-seq באמצעות הערכת איכות RNA-seq. קלט תוכנה זו הוא קובץ BAM 15 מן יישור Tophat2. הפלט הוא קובץ HTML המפרט ספירה לקריאה כוללת, כפילויות, ממופה לקרוא אחוז ואחוז rRNA, וכו ', בין יתר.
  4. שיחות Variant
    1. השתמש STAR (גרסה 2.4.0) 16 ליישור ואז להתקשר נוקלאוטיד בודד וריאנטים באמצעות של GATK (גרסה 3.3-0) HaplotypeCaller 17 צעדים .Follow GATK BAM שלאחר עיבוד קריטריונים לסינון לסמן ולהסיר תוצאות חיוביות שגויות מהפלט.
  5. ביטוי גנים
    1. חישוב usi ביטוי גניםng חפתים התוכנה (גירסה 2.1.1) מתוך הסוויטה טוקסידו 18.
      הערה: הקלט הוא קובץ BAM מ כלי יישור Tophat2. התפוקה מופקת על איזופורם, רמת הגן והתעתיקים, שבו הביטוי מחושב FPKM (שברים לכל kilobase למיליון ממופי כניסות).
  6. שיחות Fusion
    1. התקשר בשילובים מכל מדגם באמצעות ChimeraScan 19 (גרסה 0.4.5), Tophat Fusion 20 מותאמים אישית TRUP 21. ויסמנו את בשילובים לדומיינים באמצעות Oncofuse 22 (1.0.9b2 גרסה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

צעדים מפתח סכמטי הדגשת ב לכידת RNA-seq מוצג באיור 1. ארבע שורות תאי סרטן עם מוטציות ידועות שימשו כדי להדגים את האפקטיביות של טכניקה לכידת RNA-seq (K562 עם פיוז'ן ABL1, LC2 עם פיוז'ן RET, EOL1 עם פיוז'ן PDGFRalpha ו RT- 4 עם פיוז'ן FGFR3). ארבע הדוגמאות היו נקווה יחד להפיק ולרצף עם 2x 100 נ"ב קורא על ברצף שולחן העבודה, אשר מייצר קבצי FASTQ. קבצי FASTQ נוהלו באמצעות צינור ניתוח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לכידת RNA-seq היא אסטרטגית ביניים בין RNA-seq ו microarray גישות לשערוך חלק נבחר של transcriptome. היתרונות של לכידה כולל עלות מופחתת, זמן אספקה ​​מהיר על ברצף שולחן עבודה, קצב העברת נתונים גבוהים, וזיהוי של שינויים הגנומי. השיטה יכולה להיות מותאמת לאפיין RNAs ללא קידוד 23, לזהות נוקלאוטיד בודד גרסות 4-6, לבחון שחבור, ולזהות בשילובי גן או rearrangements המבני 24. יתר על כן, ניתן ליישם גישה זו דגימות קליניות או מעובד שעברו קיבוע עם בפורמלין מוטבע בב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

S.R. מקבלת מימון מנוברטיס ואריאד פרמצבטיקה לביצוע ניסויים קליניים. בני המשפחה הקרובים של ס.ר. מחזיקים במניות בג'ונסון אנד ג'ונסון.

תודות

אנו מודים במיוחד לעזרא ליון, אליוט ז'ו, מישל ווינג, אסקו קאוטו ואריק סמורודניצקי על התמיכה הטכנית. ברצוננו גם להודות לג'ני בדילו על תמיכתה האדמיניסטרטיבית בצוות שלנו. אנו מודים למרכז מחשבי העל של אוהיו (OSC) על מתן שטח דיסק, יכולת עיבוד ותמיכה בהפעלת הניתוחים שלנו. אנו מודים למרכז הסרטן המקיף (CCC) במרכז הרפואי וקסנר של אוניברסיטת אוהיו על תמיכתם האדמיניסטרטיבית בעבודה זו. S.R. והצוות נתמכים על ידי האגודה האמריקאית לסרטן (MRSG-12-194-01-TBG), פרס החוקר הצעיר של הקרן לסרטן הערמונית, NHGRI (UM1HG006508-01A1), קרן פור לחקר הסרטן, איגוד הריאות האמריקאי ופלוטוניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Thermomixer REppendorf21516-166
צנטריפוגה 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
ביולוגיה מולקולרית אתנולSigma AldrichE7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 מ"לEppendorf21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300- מחזורים)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Desktop SequencerIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit עם RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® אוליגו חוסם אוניברסלי - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® אוליגו חוסם אוניברסלי - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® אוליגו חוסם אוניברסלי - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - חרוזי טיהור PCR בקמן-קולטרA63880
Dynabeads® M-270 StreptavidinLife Technologies65305
COT DNA אנושי, דרגה פלואורומטרית, 1 מ"גRoche Applied Science05480647001
Qubit® שפופרות בדיקה Life TechnologiesQ32856
Qubit® ערכת בדיקה dsDNA HSLife TechnologiesQ32851
SeqCap® ערכות הכלאה ושטיפה של EZ  (24 או 96 תגובות)רוש נימבלגן 05634261001 או 05634253001 
Qubit® פלואורומטר 2.0 Life TechnologiesQ32866
10 x 2 מ"ל IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Life Technologiesללא נוקלאזAM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler עם 96– מודול תיקון מהיר היטבBiorad185-1196
SeqCap EZ ערכות הכלאה ושטיפהRoche Applied Science05634253001
SuperScript II Reverse Transcript 200 U/μ lLife Technologies18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 מ"לבקמן קולטר בע"מA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
RNA ScreenTape LadderAgilent Technol. Inc.5067-5578
RNA ScreenTape מאגר דגימהAgilent Technol. Inc.5067-5577
נתרן הידרוקסידסיגמא72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 SIDE EACHLife Technologies12331D
כלורופורםסיגמאC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטרתרמו מדעי
My Block מיניאמבט יבש מדדBSH200
D1000 ריאגנטיםAgilent Technol. Inc.5067- 5583
ואקופוגה פלוסאפנדורף022829861 
Water

מקורות

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815(2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36(2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72(2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7(2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNARNAPCR
ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.