מאמר שיטה

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

DOI:

10.3791/54097

⸱

17 ביוני 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, יש את היכולת הפנימית להתמיין לכל שלוש שכבות הנבט. זה הופך אותם למקור תאים אטרקטיבי לרפואה רגנרטיבית ולמודלים ניסיוניים של אורגנוגנזה נורמלית וחולה. עם זאת, ההתמיינות של hPSCs במבחנה היא הטרוגנית ומופרעת מרחבית. טכנולוגיות מיקרו-דפוס תאים מציעות פוטנציאל את האמצעים לשלוט מרחבית במיקרו-סביבות של תאי גזע ולארגן את גורלות ההתמיינות הנובעים מכך. מיקרו-תבניות hPSCs צריכות לקחת בחשבון את הדרישות המחמירות להישרדות ותחזוקה של hPSC. כאן, אנו מתארים מיקרו-דפוסי סטנסיל כשיטה שתואמת מאוד ל-hPSCs. מיקרו-תבניות hPSC מוגדרות על ידי הגיאומטריות של חורי השבלונה של התא, אשר מגבילות פיזית את המיקומים שבהם hPSCs יכולים לגשת ולהתחבר למצע המצופה מטריצה חוץ-תאית. בשל אופן פעולה זה, יש גמישות רבה יותר להשתמש במצעים שיכולים לתמוך כראוי ב-hPSCs בהשוואה לשיטות מיקרו-דפוס תאים אחרות. אנו גם מדגישים שלבים קריטיים ליצירה מוצלחת של מיקרו-דפוסי hPSC. כדוגמה, אנו מדגימים כי ניתן להשתמש במיקרו-דפוס שבלונה של hPSCs כדי לווסת קיטוב מרחבי של הידבקויות תא-תא ומטריצת תא, אשר בתורו קובע דפוסי התמיינות מזואנדודרם. שיטה פשוטה וחזקה זו למיקרו-תבניות hPSCs מרחיבה את הסיכויים להקמת מודלים ניסיוניים לחקירת ארגון ודפוס רקמות במהלך התפתחות עוברית מוקדמת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים האדם (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים (hESCs) ותאי גזע מושרים (hiPSCs), מנוצלים נרחב ברפואה רגנרטיבית וכן מודלים ניסיוניים של organogenesis בריאים וחולים בגלל פוטנציאל הבידול שלהם לתוך שושלות תאים של כל שלוש שכבות ניבטות 1,2. גורלן הבידול של hPSCs רגיש מאוד גורמים סביבתיים מקומיים שיכול לווסת autocrine או paracrine איתות 1 כמו גם תהליכי mechanotransduction בתיווך רמזים פיסיים 3-5. Micropatterning הסלולרי מקיף קבוצה של טכניקות פותחו כדי לארגן את הגיאומטריה ומיקום מרחבית של אוכלוסיית תא כאמצעי לשלוט microenvironment הסלולר המקומי, כגון תאי תאי אינטראקציות 6 ואינטראקציות-מטריקס 3 תאים. בהקשר של hPSCs, תא micropatterning הועסק כדי לקבל תובנות משמעותיות לתוך איך נישה-תלוייםאיתות autocrine אף אוזן גרון מודולציה החלטות בידול-pluripotency hESC 7 וארגון לתוך דפוסי הבידול עובריים מוקדם 6. HPSCs micropatterned 2D and 3D שמש לשלוט בגודל המושבה של דפוסים רבים-תאיים, אשר בתורו השפיעו החלטות בידול לשלוש השכבות ניבטו 8,9. יש לנו עובדים micropatterns hPSC רב-תאיים לווסת את מידת תאים תאים ואינטראקציות תא-מטריקס בתוך המושבה hPSC לחקור כיצד integrin-E-cadherin crosstalk יכול להצמיח ההטרוגניות גורל התא 10. ההפגנות מן האפיקים החדשים הפתוחים דוחות מעל לקראת היישום של micropatterns הרב-תאיים של hPSCs כמודלים ניסיוניים להקרנת תרופה רעילה למחלות התפתחותיות 11, כדי לחקור את ההשפעה של גורמי גדילה והורמונים במהלך רקמות או התפתחות איברים, וכדי לפתור את ההיווצרות דפוסי רקמה.

מספר עצום של תאים micropatterטכניקות נינג פותחו כפי שנסקרו על ידי Falconnet et. al. 12 אבל רק קומץ, כגון מגע מיקרו הדפסת 7,8,13, תרבות microwell 14,15, photopatterning 6 ו microstencils 16 יושמו בהצלחה עם hPSCs. האתגר עם hPSCs micropatterning טמון פגיעותם ודרישה מחמירה של מטריצות תאיות ספציפיות (ECM) ותנאי צמיחה עבור התקשרות לתא והישרדות. דפוסי 2D hPSC, הדפסת מייקרו מגע היא אחת השיטות הנפוצות ביותר כדי ליצור micropatterns hPSC על מצעי תרבות זכוכית רקמות 13. השיטה יכולה לשמש כדי ECM משותף דפוס המשמש בתרבות hPSC, לרבות מטריצות הממברנה laminin ומרתף, כגון Matrigel. עם זאת, בדרך כלל זה דורש תהליך ציפוי שני שלבים שנעזר Poly-D- ליזין, ועליו תנאים אטמוספריים ולחות אינרטי ספציפיים לעשות micropatterns ECM יציב hPSCs לצרף על 6,13. התמורה ובראשונה של כל שיטת micropatterning היא האם משטר שינוי פני השטח יכול ליצור דפוסי ECM hPSC-דבקים ברזולוציה הגיאומטרית הרצויה תוך מזעור מצורף תא נוקב אל בסביבותיה.

כאן אנו מדווחים על שימוש סטנסיל micropatterning כשיטה פשוטה ליצור micropatterns hPSC ללא צעדים שינוי פני השטח נוספים לפני דור דפוסי ECM דבק hPSCs לצרף על. סטנסיל התא מורכב של קרום דק, למשל, polydimethylsiloxane (PDMS) גיליון, עם מיקרון מילימטר גודל דרך נקבי חתום על מצע תרבית תאים להכיל ציפוי ECM פיזית ובהמשך hPSCs הזורע. כמו דפוסי סטנסיל עובדים פיזית ירסנו את המיקום שבו hPSC יכול לגשת ולצרף ישירות למצע ECM המצופה הבסיסי, שיטה זו היא תואמת עם מצעים שונים שיכול לתמוך תרבויות hPSC. Requiremen רקt הוא כי הבחירה של חומר סטנסיל יכולה ליצור חותם הפיך עם המצע. מצעים אלה כוללים קלקר בתרבית רקמה קונבנציונלי (TCPS) 17, מצעי מצומדות ליגנד 18, כמו גם מצעים אלסטומרי עם קשיחות מתכוננת (למשל., PDMS) 19. שיטה זו גם מאפשרת ציפוי של ECM שונים, כגון vitronectin (או חלבון VTN), laminin ומטריצות קרום במרתף (למשל, Matrigel ו Geltrax) כדי לאפשר התקשרות נאותה והבחנה של hPSCs. לכן, אנחנו יכולים להעביר אופטימיזציה תצורות ECM-מצע עבור קו hPSC ספציפי שבלונת micropatterning הידבקות, הישרדות התמיינות תאים-מטריקס אופטימלית. לאחרונה, בשיטה דומה גם דווחה לכוון בידול הכבד על ידי hESCs micropatterning באמצעות פולי (methacrylate מתיל) (PMMA) מערכים-סטנסיל מיקרו 16.

סטנסילים ניידים יכולים להיות מפוברקים מחומרים שונים, לרבות נפגשו als 20,21, פולי (p-xylylene) פולימרים 22,23, PMMA 16 והכי נפוץ, PDMS 24-28. סיליקון פולי (p-xylylene) סטנסילים פולימרים דורשים תחריט הישיר של החורים דרך עם ציוד מיוחד 20-23, אשר מגביל הנגישות שלהם למשתמשים ביולוגיים. סטנסילים PDMS יכול להיות מפוברק על ידי שיטות שונות בהתאם לגודל המאפיין הרצוי, אשר בדרך כלל נע בין 3 מיקרומטר 2,000 מיקרומטר 11,26-29. אם תכונות קטנות הן רצויות, גיליונות שכפולים רזה יכולים להיות מיוצרים על ידי דפוס עיתונות PDMS מראש פולימר על תבנית סיליקון microfabricated המכילה תבליטים של micropatterns 28. עבור תכונות> 1,000 מיקרומטר, חותך ליזר CO 2 מספק שיטת עלות קלה ונמוכה לחתוך את הדפוסים ישירות על גיליון מראש casted PDMS במהלך ייצור סטנסיל. המחזור של סטנסילים PDMS גם גורם להם חסכוני לבצע סדרה של ניסויים עם עקביות מספיק.

התחת = "jove_content"> כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה מפורט על המצאה של סטנסיל PDMS עם 1,000 מיקרומטר תכונות ידי חיתוך לייזר דור micropatterns hESC. Micropatterns hESC אלה שימשו כדי לווסת את מידת integrin ו- E-cadherin בתיווך הידבקויות תוך מושבה hESC מלוכדת כדי לחקור כיצד הקיטוב המרחבי של הידבקות התא הביאה ההטרוגניות גורל התא 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הייצור של סטנסיל PDMS עם 1,000 מיקרומטר דפוסים ידי ליזר חיתוך micropatterning של קו hESC, H9 באמצעות שבלונת PDMS.

תכנון ייצור 1. של סטנסיל PDMS עבור micropatterning

  1. לעצב את גיליון שכפול עם חורים דרך של גיאומטריה לגודל הרצוי (למשל, 1,000 מיקרומטר עיגולים) ואת אטם סטנסיל באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב 10.
  2. בחיתוך לייזר הגיליון שכפול אטם על 120-150 מיקרומטר ו -2 מ"מ polydimethylsiloxane עבה (PDMS) גליונות בהתאמה באמצעות 10 CO 2-חיתוך בלייזר.
  3. איגרות החוב אטם PDMS עם הסדין סטנסיל PDMS באמצעות PDMS ואופים דפוקה נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שעות כדי להשיג את השבלונה PDMS עבור micropatterning.
  4. לעקר את הסטנסיל PDMS ידי מעוקר ב 120 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר ייבוש בתנור לפני השימוש.

2. hESCs ראשיtenance

  1. תרבות קווי hESC בתווך ללא תחזוקה מזינה על 1 × קרום במרתף hESC מוסמך צלחות תרבית תאים מצופים מטריקס ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. מסדרון, hESCs כאשר הם כ 70% ומחוברים על ידי 3 דגירת דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם dispase טיפול מכאני מתנערים מושבות hESC לתוך 100-200 מיקרומטר גושים. פלייט גושים hESCs בצפיפות של 30-50 גושים לכל 9.6 ס"מ 2 של אזור הגידול על קלקר בתרבית רקמה מצופה מטריצה ​​קרום במרתף בבית 1: יחס פיצול 6.

3. סטנסיל micropatterning של בתאי גזע עובריים אנושיים

  1. הכנה לפני תא דפוסים
    1. חותם סטנסיל PDMS לצלחת פטרי 60 מ"מ על ידי מחלק 700 μl 70% אתנול כיתה אנליטיות מים ultrapure לתוך צלחת פטרי הצבת השבלונה על גבי.
    2. מניחים את צלחת פטרי בתוך ארון biosafety לילה לתת tהוא אתנול יבש.
    3. בדקו אין בועה שקיימת מתחת השבלונה על מנת להבטיח כי סטנסיל מהווה חותם טוב עם צלחת פטרי. הדבר מונע דליפות של פתרון ציפוי ECM. חותם את צלחת פטרי ולאחסן בתנאים סטריליים עד שהוא מוכן זריעת תאים.
    4. כן aliquots של מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך על פי תעודת הניתוח. ודא שכל תשואות aliquot 1 × פתרון מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך כאשר מדולל 25 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco: מזין תערובת F-12 (DMEM / F12) על פי גיליון מוצר של יצרן.
    5. הכן את הפתרון ציפוי ECM על ידי הוספת aliquot אחד מטריצה ​​קרום במרתף hESC מוסמך לתוך 16.7 מ"ל של DMEM / F12 כדי להפוך 1.5 × פתרון מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך. שמור את כל פתרון ציפוי ECM על קרח כדי למנוע gelation.
    6. מוסף בינוני תחזוקה hESC עם 10 מיקרומטר ROCK מעכב (Y27632).
  2. ציפוי ECM על פני המצע סטנסיל
    1. פנקו את צלחת פטרי עם 100 WO 2 פלזמה למשך 90 שניות. כדי להבטיח סטריליות, רק לפתוח את מכסת צלחת פטרי בתוך חדר הפלזמה לפני טיפול פלזמה, ובמהירות לכסות בחזרה צלחת פטרי לאחר השלמת טיפול. זה הופך לפשוט הרטבת שטח ומונע היווצרות בועת אוויר micropattern דרך חורה במהלך התוספת של פתרון ציפוי ECM.
    2. להוסיף 450 μl של 1.5 × פתרון מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך לכסות את הסטנסיל כולו. חותם את צלחת פטרי עם סרט עצמי סגר, כגון Parafilm, כדי למנוע את הפתרון מההתייבשות, דגירה במשך 5 שעות ב 37 מעלות לפני השימוש.
  3. HESCs מתזמן על גבי מצע סטנסיל
    1. בדוק מושבות hESC בצלחת 6 גם לזהות את אזורי תא הבדיל מראים פסד של מורפולוגיה hESC הטיפוסית (כמו, אובדן packe המעוגלת, בחוזקהמורפולוגיה אפיתל ד, יחס גרעין / הציטופלסמה גבוהה עם nucleoli בולט). הסר אזורים מובחנים באמצעות aspirator ואקום.
    2. שטפו פעמיים עם 2 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב.
    3. הוסף 1 מ"ל של אנזימי עיכול, כגון Accutase, לכל גם צלחת 6 באר לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. קש על הצלחת בעדינות כדי לנתק את כל המושבות מן המצע.
    4. יש לשטוף היטב עם כל 4 מ"ל לפחות של DMEM / F12 לכל 1 מ"ל של אנזימי עיכול לאסוף את ההשעיה התא לתוך 15 מ"ל צינור חרוטי.
    5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב × 200 גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. לשאוב להסיר את supernatant ולהוסיף 400 μl של מדיום תחזוקה hESC השלימו עם מעכב ROCK (ROCKi) מחדש להשעות את התאים. פיפטה את תא השעיה ולמטה 3 פעמים בעדינות לשבור גושים לתוך תאים בודדים.
    7. מערבבים היטב ההשעיה תא בודד לדלל 10 μl של דגימות תאים לתוך 190 μl של DMEM / F12 (01:20 דילול). השתמש hemocytometer כדי לקבוע את צפיפות תאי השעית תא המניות.
    8. חשב את צפיפות זריעת תא הדרושה סטנסיל נתון.
      הערה: לדוגמה, אנו באופן ניסיוני קבענו את צפיפות תאי הזריעה להשיג בשכבה ומחוברת של תאים בודדים היא כ 4,444 תאים / מ"מ 2. לפיכך, סטנסיל עם שטח של 450 מ"מ 2 ונפחי זריעה של 400 μl ידרוש השעית תא להיות בצפיפות של 2 מיליון תאים / 400 μl.
    9. לדלל את ההשעיה תא המניות לצפיפות זריעת הנדרש (ראה הערה צעד 3.3.8) עם המדיום תרבות hESC בתוספת ROCKi.
    10. הוספת נפח מיועד של השעית תא המכיל את המספר הדרוש של תאים לתוך אחד סטנסיל ולהשאיר צלחת פטרי ללא הפרעת מכסה המנוע במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר לתאים להתיישב.
    11. מעביר את צלחת פטרי לתוך חממת דגירה במשך שעה 1 כדי לאפשר התקשרות לתא. תשמור על עצמך כדי לשמור על רמת צלחת פטרי במהלךלהעביר תהליך כך התאים נשארים כמו בשכבה ב השבלונה.
  4. הרחקת פסיבציה סטנסיל של מצע unpatterned
    1. בדוק את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם התאים מחוברים כראוי על גבי המצע הבסיסי.
    2. לשאוב משם השעית תא מן השבלונה.
    3. הוסף 2 מ"ל / תבשיל של פעילי שטח בלתי יוניים תואם תרבית תאים 0.5% ב DMEM / F12 לאזור שמסביב השבלונה.
    4. השתמש זוג מלקחיים autoclaved להתקלף השבלונה בעדינות. מערבולת הפתרון הפעיל שטח בלתי יוני סביב כמו סטנסיל הוא קלף כדי למנוע את התאים מההתייבשות. מבחינה ויזואלית לבחון את תאי micropatterned בצלחת פטרי.
    5. דגירה-תאי micropatterned בתמיסת 0.5% שאינם יונית פעיל שטח-DMEM / F12 במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    6. לשאוב משם הפתרון הלא יוניים פעילי שטח-DMEM / F12. לשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל / תבשיל של DMEM / F12.
    7. הוסף 2 מ"ל / תבשיל של hESCבינוני תחזוקה בתוספת ROCKi לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    8. לאחר הדגירה לילה, מדיום תחזוקה hESC לשאוב בתוספת ROCKi, לשטוף פעם אחת עם DMEM / F12 ו להשרות התמיינות mesoendoderm על ידי הוספת 2 מ"ל / תבשיל של מדיום בידול השלימו עם 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP4 ו -10 ng / FGF2 מ"ל .
    9. להעריך את micropatterns באמצעות הדמיה לעומת שלב ולחשב את פרופילי עצמה הממוצעים Brachyury (T) עבור כל תבנית כפי שתואר לעיל 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה נתאר את ייצור של סטנסיל התא באמצעות מכשיר חיתוך בלייזר כדי ליצור 1,000 מיקרומטר תכונות. סטנסיל הורכבה 2 חלקים: סדין שכפול דק (כ 100-200 מיקרומטר עבה) המכיל את micropattern דרך חורים, ואת אטם PDMS להכיל פתרון ציפוי ECM או השעית תא. הנה, 127 מיקרומטר ו -2 מ"מ עובי זמינים מסחרית גליונות PDMS שימשו כסדין שכפול אטם בהתאמה. שיטות אחרות להכנת גליונות PDMS של עובי לשליטה, כגון ציפוי ספין, יכול לשמש גם כדי להמציא מחדש את החלקים. שני המרכיבים היו מל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המצאה של סטנסילים micropatterning

micropatterning סטנסיל מספק שיטה אידיאלית ליצור hPSC micropatterns על חקירת דפוסי בידול בתיווך נישה. היתרון העיקרי של דפוסים סטנסיל על פני שיטות micropatterning אחרות, כגון הדפסת microcontact ו photopatterning, הוא שהיא אינה דורשת שינוי פני שטח והוא יכול להיות מיושם על מצעים קונבנציונליים TCPS. לכן, תקשורת ותרבות אופטימיזציה וציפויי ECM לקווי hPSC שונים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי NUS להתחלה מענק (R-397-000-192-133) ו ETPL גאפ קרן (R-397-000-198-592). GS הוא חוקר NUS. מחברים מבקשים להודות לד"ר Jiangwa Xing לקבלת התמיכה הטכנית שלה על micropatterning תא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  גיליון PDMS בעובי 2 מ"ממוצרי סיליקון מיוחדים בע"מ, ארה"בSSPM823-.005משמש ליצירת מאגר לשבלונה
120-150 μ גיליון PDMS בעובי mמוצרי סיליקון מיוחדים בע"מ, ארה"בSSPM823-.040משמש ליצירת סטנסיל 
צלחת פטרי 60 מ"מNunc Nunclon Delta150326מצע למיקרו-דפוס
AccutaseAccutase, Merck Millipore, סינגפורSCR005אנזים לפירוק תאי H9 לתאים בודדים
Activin   מו"פ D Systems, סינגפור338-AC-010גורם צמיחה לבידול H9
BMP4 מו"פ D Systems, סינגפור338-BP-010גורם גדילה להתמיינות H9
מערכת פלזמה Femto Science, קוריאהCUTE-MPלחמצון פלזמה של שבלונה
DispaseStemCell™ טכנולוגיות, סינגפור7923אנזים המשמש להחלשת הידבקות התא-ECM במהלך מעבר
DMEM/F12GIBCO, ארה"ב11330032מדיום בסיסי לתאי
H9 FGF2R& D Systems, סינגפור233– FB– 025גורם גדילה להתמיינות H9
קו תאי H9מכון המחקר WiCell, Inc., ארה"בWA09תאי גזע עובריים אנושיים
מטריצת קרום בסיס מוסמכת hESCMatrigel, BD Biosciences, סינגפור354277ציפוי מטריצה חוץ-תאית לתמיכה בצמיחה של תאי H9
מיקרוסקופ הפוךLeica Microsystems, סינגפורDMi1ללכידת שדה בהיר תמונות
חותך לייזרEpilog Helix 24 מערכתהמשמשת ליצירת חורים דרך גיליון PDMS
mTeSR ™ 1 בינוני StemCell וסחר; טכנולוגיות, סינגפור5850מדיום תחזוקה לתאי H9
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., ארה"ב3097358-1004משמש להדבקת שבלונה ורזרב PDMS
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, סינגפור688000שומר על תאי H9 כתאים בודדים 
STEMdiff ומסחר; APEL™ בינוני StemCell וסחר; טכנולוגיות, סינגפור5210מדיום התמיינות לתאי H9
סרט פוליאתילן טרפתלטSureMark סינגפורSQ-6633משמש ליצירת סטנסיל 
פעילי שטח לא יוני תואם תרבית תאיםחומצה פלורונית F-127, סיגמא, סינגפורP2443מגיב פסיבי לדחיית הידבקות תאים במצעים שאינם מיקרו-דפוסיים
לייזר חומר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  3. Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  4. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
  5. Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
  6. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  7. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  8. Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
  9. Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  10. Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
  11. Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038(2015).
  12. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  13. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  14. Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
  15. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
  16. Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
  17. Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
  18. Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
  19. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
  20. Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
  21. Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
  22. Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
  23. Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
  24. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
  25. Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
  26. Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
  27. Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
  28. Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784(2014).
  29. Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
  30. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499(2012).
  31. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
  32. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
  33. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
  34. Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS

מאמרים קשורים